杜氏盐藻tpsp基因、其编码蛋白及其克隆方法和植物转化载体的构建方法

专利名称：杜氏盐藻tpsp基因、其编码蛋白及其克隆方法和植物转化载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种杜氏盐藻TPSP基因、其编码蛋白及其克隆方法和植物转化载体的构建方法。
背景技术：
杜氏盐藻(Dunaliella viridis)是一种单细胞真核藻类，属于绿藻纲(Chlor-ophyceae)，团藻目(Volvocales)，杜氏藻科(Dunaliellaceae)。广泛分布于海洋、盐湖等盐度较高区域，无细胞壁，原生质外仅有一层糖蛋白组成的外膜。
盐藻细胞生活在极端环境中，可在含0.05-5.5mol/LNaCl的培养液中生存，是迄今发现的最耐盐的真核生物。盐藻有非常强的渗透调节能力。它一次可以耐受3-4倍的渗透压变化；如果通过梯度改变渗透压，它可以耐受7倍以上的渗透压变化。同时，盐藻对高盐，渗透等逆境胁迫都具有强的耐受性。因此盐藻是一个研究植物胁迫耐受调节分子机制的理想系统，是人们寻找与耐受极端环境密切相关基因的一个极好的生物材料。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一个杜氏盐藻TPSP基因。
本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。
本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。
本发明的目的之四在于提供该基因的植物表达载体的构建方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种杜氏盐藻TPSP基因，其特征在于该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。
一种上述的杜氏盐藻TPSP基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
一种上述的杜氏盐藻TPSP基因的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤a.根据EST拿到的三个重叠群contig设计的引物序列P6(+)5′-gtgtggtactacaaggatgcag-3′，P6(-)5′-atgtcctcatcactgcggtcgt-3′，在盐藻的BAC文库中进行筛选，得到一段约1.5kb的片断；对这段片断进行测序，并与盐藻的cDNA序列进行对比，得知这段序列跨一个内含子；再以位于外显子上的P6(+)为正向引物，在内含子上设计一条反向引物P6(-2)5′-acgggcttattggacagcac-3′，筛选盐藻的BAC文库；得到四个阳性克隆，将这四个阳性克隆分别用Not I，EcoR I和Hind III进行酶谱分析，将其中包含的片断最多的第一个克隆挑出做鸟枪文库；b.将步骤a所挑出的克隆，用Large Construct Kit(QIAGEN)抽提BAC质粒，将得到的BAC片断进行物理破碎，得到的片断大约2～4kb；将此2～4kb的片断割胶回收，载体是用Sma I酶切去磷的pUC18制得；将回收的2～4kp片断连入线性化的pUC18进行测序，测序引物为M13(+)(-)，一共测了九块96孔板，大约864个克隆；c.将上述的864个克隆的原始数据输入Phred/Phrap的Linux程序，得到5个较长的contig，其长度分别为35945bp、26502bp、4913bp、3076bp、1407bp；经GENSCAN和FGENSH两大软件的预测，其中长度为35945bp的congtig即为DvTPSP cDNA的全序列，该序列包含3.2kb的开放阅读框。
一种上述的杜氏盐藻TPSP基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.质粒pBI121的改建根据盐藻TPSP基因的序列，设计DvTPSP正、反义引物。
GUS(+)5‘-atgcccgggaattctggtcagtcccttatg-3‘Sma I EcoR IGUS(-)5‘-atggagctctcgaggtagcaattcccgag-3‘Sac I Xho ITPSP(+)5‘-ggagaacgggggatttgaggga-3‘TPSP(-)5‘-tgacaggaagtggcgagcgt-3‘通过酶切、补平的方式破坏pBI121中NOS终止子后的EcoR I酶点，得载体pBI121(E-)；然后，以pBI121为模板，用GUS上、下游引物PCR扩增GUS基因，PCR产物用Sma I/Sac I双酶切，回收GUS片断，并克隆至pBI121(E-)的SmaI/Sac I间，从而在pBI121(E-)的GUS基因上游Sma I酶点后及下游Sac I酶点前分别添加EcoR I和Xho I酶点，得载体pBI121(E+/X+)；b.拟南芥rd29A/rd29B基因诱导型启动子元件的克隆根据文献上发表的拟南芥中的逆境诱导型基因rd29A及rd29B的启动子序列，设计并合成了两对引物，
Prd29A(+)5‘-aggaagcttatggaggagccatag-3‘Hind IIIPrd29A(-)5‘-aggtctagatgagtaaaacagaggaggg-3‘Xba IPrd29B(+)5‘-aggaagcttcgttgacagaaacagtc-3‘Hind IIIPrd29B(-)5‘-atgggatccttcgtgtctctgagaa-3‘BamH I通过PCR的方法，从拟南芥基因组中扩增到rd29A及rd29B的启动子序列Prd29A和pRD29B；pRD29A和pRD29B分别用Hind III/Xba I及Hind III/BamH I双酶切，回收两启动子片断，并分别克隆至pUC19中Hind III/Xba I及Hind III/BamH I酶点间，得pUC29A及pUC29B；c.植物转化载体的构建将Prd29A及Prd29B分别从pUC29A和pUC29B中切出，并分别克隆至pBI121(E+/X+)中，取代原有的CaMV35S启动子，从而获得两个逆境诱导型植物表达载体pBI29A及pBI29B，然后，将TPSP从pBK-TPSP中切出，并分别克隆至pBI121(E+/X+)、pBI29A及pBI29B中，取代原有的GUS基因，从而获得了三个分别由CaMV35S启动子、rd29A及rd29B控制的盐藻TPSP基因的植物表达载体pBI35S-TPSP、pBI29A-TPSP及pBI29B-TPSP。
本发明首次发现杜氏盐藻DvTPSP基因，并首次提供杜氏盐藻DvTPSP基因的全长cDNA序列；经过序列分析，并与其他物种TPS基因对比，可知该基因在盐藻中编码海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶。然而，该基因和已知的海藻糖合成酶基因有较大的不同，是在盐藻中首次发现并首次克隆到一个新的海藻糖合成酶基因。将该基因转入不同的酵母突变体中进行功能鉴定，发现该基因在盐敏感突变体G19中具有一定的盐耐受性。另外，将该基因通过农杆菌遗传转化高等植物，进行了分子鉴定和逆境生理分析，结果证明该基因能提高植物的逆境耐受性，特别是抗旱能力，因此该基因具有应用到植物抗逆基因工程的价值。


图1为杜氏盐藻DvTPSP基因的酵母转化载体pYTPSP和pATPSP双酶切鉴定图。
图2为杜氏盐藻DvTPSP基因转化酵母突变体G19对生长的影响图。
取约500个G19/pYES2(A)或G19/pYTPSP(B)细胞分别涂布到含不同浓度NaCl(1150mM；2200mM；3250mM)的固体AP(Gal，-Ura)平皿(9×9cm)上，30℃培养6d后，转化子的生长情况。
图3为杜氏盐藻DvTPSP基因转化酵母突变体G19对生长的影响图。
将G19/pYES2和G19/pYTPSP的培养液分别稀释至105、104、103、102cells/μL四个梯度，并各取5μL分别滴到不含NaCl及含150mM NaCl的固体AP(Gal，-Ura)平皿上，30℃培养6d后，转化子的生长情况。
图4为质粒pBI121(E-)的酶切鉴定图。
图5为质粒pBI121(E+/X+)的酶切鉴定图M1kb Marker；1pBI121/Sma I+Sac I；2pBI121/EcoR I+Xho I；3pBI121(E+/X+)/Sma I+Sac I；4pBI121(E+/X+)/EcoR I+Xho I。
图6为载体pBI121的结构图。
PPromoter；TTerminator；LBLeft border；RBRight border图7为载体pBI121(E+/X+)的结构图。
PPromoter；TTerminator；LBLeft border；RBRight border图8为Prd29A及Prd29B的PCR扩增图。
M1kb Marker；1Prd29A的PCR产物；21的阴性对照；3Prd29B的PCR产物；43的阴性对照图9为pBI29A及pBI29B的PCR鉴定图M1kb Marker；1H2O(模板)/Prd29A(+)(-)(引物)；2pBI29B/Prd29A(+)(-)；3pBI29A/Prd29A(+)(-)；4H2O/Prd29B(+)(-)；5pBI29A/Prd29B(+)(-)；6pBI29B/Prd29B(+)(-)图10为pBI35S-TPSP、pBI29A-TPSP及pBI29B-TPSP的酶切鉴定图。
M1kb Marker；1pBI121/EcoR I+Xho I；2pBI35S-TPSP/EcoR I+Xho I；3pBI29A-TPSP/EcoR I+Xho I；4pBI29B-TPSP/EcoR I+Xho I图11为插入了DvTPSP基因的三个不同启动子的质粒pBI35S-TPSP、pBI29A-TPSP、pBI29B-TPSP的结构图。
PPromoter；TTerminator；LBLeft border；RBRight border图12.PCR鉴定转基因苗基因组DNALane1H2O；Lane2TPSP正对照；Lane3，Lane4野生型拟南芥；Lane5，Lane6转基因对照，转入pBI121(E+/X+)即不含TPSP的对照载体；Lane7，Lane8转pBI35S-TPSP质粒的转基因苗基因组DNA；Lane9，Lane10转pBI29A-TPSP质粒的转基因苗基因组DNA；Lane11转pBI29B-TPSP质粒的转基因苗基因组DNA。
图13为转基因苗在-20℃冷冻处理表型.
图14为干旱处理表型A转基因对照，枯萎；B转pBI35S-TPSP，正常生长；C转pBI29A-TPSP，正常生长；D转pBI35B-TPSP，正常生长图15为冷冻处理RT-PCRAWT对照，不表达TPSP；B转基因对照，不表达TPSP；C转pBI35S-TPSP，组成型表达TPSP。DpBI29A-TPSP诱导表达TPSP，在1h开始表达，表达量随着时间的增加而增加；EpBI29B-TPSP的表达情况在此不明显。
图16为干旱处理RT-PCRAWT对照，不表达TPSP；B转基因对照，不表达TPSP；C、转pBI35S-TPSP，组成型表达TPSP；DpBI29A-TPSP诱导表达TPSP；EpBI29B-TPSP在干旱诱导条件下表达量有所变化。
具体实施例方式实施例一杜氏盐藻TPSP基因的克隆根据EST(Expressed Sequence Tag)拿到的三个重叠群(contig)设计的引物序列P6(+)5′-gtgtggtactacaaggatgcag-3′，P6(-)5′-atgtcctcatcactgcggtcgt-3′，在盐藻的BAC文库中进行筛选，得到一段约1.5kb的片断。对这段片断进行测序，并与盐藻的cDNA序列进行对比，可知这段序列跨一个内含子。再以位于外显子上的P6(+)为正向引物，在内含子上设计一条反向引物P6(-2)5′-acgggcttattggacagcac-3′，筛选盐藻的BAC文库。得到四个阳性克隆，将这四个阳性克隆分别用Not I，EcoR I和HindIII进行酶谱分析，可以确定，第一个克隆最长，所包含的片断最多，因此将第一个克隆挑出做鸟枪文库。
将该克隆挑出，用Large Construct Kit(QIAGEN)抽提BAC质粒。将得到的BAC片断进行物理破碎，得到的片断大约2～4kb。将此2～4kb的片断割胶回收。载体是用Sma I酶切去磷的pUC18制得。将回收的2～4kp片断连入线性化的pUC18进行测序，测序引物为M13(+)(-)。一共测了九块96孔板，大约864个克隆。原始数据输入一个叫Phred/Phrap的Linux程序里得到5个较长的contig，分别长35945bp、26502bp、4913bp、3076bp、1407bp。其中通过GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)和FGENSH(http://www.softberry.com/berry.html)两大软件的预测可知在最长的contig中即35945bp的congtig里包含了完整的DvTPSPcDNA的全序列，该序列包含3.2kb的开放阅读框，经过分析可知该基因编码了一个完整的930个氨基酸的蛋白产物。
通过Genbank中的Blast程序进行结构域分析，发现该基因主要包含两个结构域，从N端Asn50到Arg542约500个氨基酸区域和E.coli的OtsA(trehalose-6-phosphatesynthase)及酵母的TPS1相似，属于Glycosyltransferase family 20，参与形成糖苷键并能够在碳水化合物的运输和代谢中发挥作用。C端含有Trehalose_Ppase(592-910)，即海藻糖-磷脂酶结构域，磷脂酶结构域存在于许多磷脂酶家族包括酵母的TPS2中。海藻糖磷脂酶可以将海藻糖-6-磷酸去磷酸化，并生成海藻糖和正磷酸。由于该基因具有TPS和TPP的结构域，我们将此基因命名为DvTPSP。
与所有已知的蛋白序列进行比较分析发现盐藻DvTPSP与真核细胞的TPS的同源性高于与原核细胞TPS的同源性。与拟南芥TPS7，8，9的一致性达50％，相似性达67％。与Seleginella lepidophylla和水稻(Oryza sativa，japonica cultivar-group)的TPS的一致性分别是34％和50％。与裂殖酵母和酿酒酵母TPS的一致性有39％和35％(图3)。DvTPSP与植物TPS高度一致性部分说明了盐藻与高等植物亲缘关系以及进化上的保守性。DvTPSP与一些物种的TPP也有较高的同源性，例如，与Candidaalbicans TPP，裂殖酵母TPP和酿酒酵母的TPP的一致性分别是31％，29％和31％。
实施例二DvTPSP酵母转化载体的构建、酵母转化及功能分析为了验证DvTPSP是否具有TPS和/或TPP的功能，将DvTPSP转入酵母tps1缺失突变与tps2缺失突变中进行酵母的功能分析。考虑到该基因从盐藻中拿到，而盐藻是极其耐盐的一种真核生物，为了进一步确认DvTPSP是否具有抗盐功能，将该基因转入酵母的盐敏感突变菌株G19中，观察该基因是否具有盐耐受性。
1、酵母转化载体的构建为了通过酵母功能互补的方法进一步验证DvTPSP是否具有TPS和/或TPP的功能，我们把该基因构建到酵母表达载体pAJ401及pYES2中，用EcoR I/Xho I双酶切pBK-TPSP，回收DvTPSP片段，通过EcoR I/XhoI酶点分别克隆至酵母穿梭载体pYES2及pAJ401中，得酵母转化载体pYTPSP和pATPSP，并通过EcoR I/Xho I双酶切进行鉴定，参见图1。
2、酵母转化将构建好的酵母转化载体转化酵母tps1(编码TPS)缺失突变体YSH290及酵母tps2(编码TPP)缺失突变体YSH450，观察突变表型的恢复情况。同时，为了进一步确认DvTPSP是否具有抗盐功能，把该基因转化到酵母盐敏感突变体G19中，观察盐敏感程度的变化。
利用PEG/LiAC转化方法将pAJ401和pATPSP分别转化酵母YSH202(野生型酵母菌株)及YSH290；将pYES2和pYTPSP分别转化酵母YSH202、YSH450及G19，得酵母转化子YSH202/pAJ401、YSH290/pAJ401、YSH290/pATPSP、YSH202/pYES2、YSH450/pYES2、YSH450/pYTPSP、G19/pYES2、G19/pYTPSP。
结果表明，DvTPSP不能互补YSH290的在以葡萄糖为单一碳源的培养基上不能生长的突变表型，也不能互补YSH450的在37℃下不能生长的温度敏感突变表型(结果未显示)。但是，DvTPSP能部分互补G19的盐敏感突变表型，使G19在含200mMNaCl的AP培养基上微弱生长，参见图2；且G19在转入DvTPSP后，相同细胞数的转化子在含150mM NaCl的AP培养基上的长势要好于对照，参见图3。这表明DvTPSP具有部分耐盐的功能，但由于盐藻和酵母有较大的密码子偏好性差别，而且DvTPSP和酵母TPS和TPP在序列同源性上相对较弱，因此还不足以互补YSH290和YSH450的突变表型。
实施例三用于植物转化表达载体的构建为了应对目前海藻糖基因工程改造中存在的一些问题，如海藻糖合成酶高表达带来的发育和生长上的不利因素等，本研究中除了采用组成型CaMV 35S启动子之外，另外在拟南芥中克隆了两个逆境诱导的rd29A/B启动子，并进行载体改建得到三个不同启动子CaMV 35S，rd29A和rd29B控制的DvTPSP表达载体。
1、质粒pBI121的改建由于pBI121上的GUS基因两端可用的酶切位点非常有限，而DvTPSP基因本身很长，酶点较多，从pBK-TPSP上切下DvTPSP基因很难直接插入到载体中并取代原有的GUS基因，因此需要对改载体进行改建。为了pBI121改建的需要，根据载体序列，设计GUS基因正、反义引物，在正义引物一端添加Sma I和EcoR I酶点，在反义引物一端添加Sac I和Xho I酶点。另外，为了检测构建的植物转化载体是否成功导入农杆菌，根据盐藻TPSP基因的序列，设计DvTPSP正、反义引物。1GUS(+)5‘-atgcccgggaattctggtcagtcccttatg-3‘Sma I EcoR IGUS(-)5‘-atggagctctcgaggtagcaattcccgag-3‘Sac I Xho ITPSP(+)5‘-ggagaacgggggatttgaggga-3‘TPSP(-)5‘-tgacaggaagtggcgagcgt-3‘
通过酶切、补平的方式破坏pBI121中NOS终止子后的EcoR I酶点，得载体pBI121(E-)，从EcoR I/BamH I双酶切结果，参见图4，可知pBI121(E-)中EcoRI酶点已被破坏。然后，以pBI121为模板，用GUS上、下游引物PCR扩增GUS基因，PCR产物用Sma I/Sac I双酶切，回收GUS片断，并克隆至pBI121(E-)的Sma I/Sac I间，从而在pBI121(E-)的GUS基因上游Sma I酶点后及下游Sac I酶点前分别添加EcoR I和Xho I酶点，得载体pBI121(E+/X+)。通过Sma I/Sac I及EcoR I/Xho I双酶切鉴定，参见图5可知pBI121(E+/X+)中EcoR I和Xho I酶点添加成功，参见图6和图7，从而为TPSP基因插入载体扫除了障碍。
2、拟南芥rd29A/rd29B基因诱导型启动子元件的克隆根据文献上发表的拟南芥中的逆境诱导型基因rd29A及rd29B的启动子序列，设计并合成了两对引物，Prd29A的正、反义引物一端分别添加了Hind III和Xba I酶点；在Prd29B的正、反义引物一端分别添加了Hind III和BamH I酶点。通过PCR的方法，从拟南芥基因组中扩增到rd29A及rd29B的启动子序列。
Prd29A(+)5‘-aggaagcttatggaggagccatag-3‘Hind IIIPrd29A(-)5‘-aggtctagatgagtaaaacagaggaggg-3‘Xba IPrd29B(+)5‘-aggaagcttcgttgacagaaacagtc-3‘Hind IIIPrd29B(-)5‘-atgggatccttcgtgtctctgagaa-3‘BamH ICTAB法提取拟南芥总DNA。94℃预变性4min；94℃，30S；55℃，30S；72℃，1min；30个循环；72℃，5min从拟南芥总DNA中扩增到rd29A的启动子Prd29A。94℃预变性4min；94℃，30S；60℃，30S；72℃，1min；30个循环；72℃，5min从拟南芥总DNA中扩增到rd29B的启动子pRD29B，参见图8。pRD29A和pRD29B分别用HindIII/Xba I及Hind III/BamH I双酶切，回收两启动子片断，并分别克隆至pUC19中HindIII/XbaI及Hind III/BamH I酶点间，得pUC29A及pUC29B。测序由上海博亚生物技术有限公司完成。
测序结果表明两启动子长度分别为870bp和950bp，其中Prd29A与发表的序列完全一致，而Prd29B与发表的序列比较有两个碱基的差别，但这两个碱基并不在启动子的功能区域内，其中DRE顺式作用元件、ABA作用元件ABREs、TATA框及CAAT框均没有发生任何改变，因而不会影响启动子活性。
3、植物转化载体的构建为了便于后续通过GUS染色检测启动子的活性，首先将Prd29A及Prd29B分别从pUC29A和pUC29B中切出，并分别克隆至pBI121(E+/X+)中，取代原有的CaMV35S启动子，PCR检测，参见图9，表明Prd29A及Prd29B均已成功插入载体中，从而获得两个逆境诱导型植物表达载体pBI29A及pBI29B，。然后，将TPSP从pBK-TPSP中切出，并分别克隆至pBI121(E+/X+)、pBI29A及pBI29B中，取代原有的GUS基因，EcoR I/Xho I双酶切结果，参见图10，表明DvTPSP已成功插入三载体中，从而获得了三个分别由CaMV35S启动子、rd29A及rd29B控制的盐藻TPSP基因的植物表达载体pBI35S-TPSP、pBI29A-TPSP及pBI29B-TPSP，参见图11。
实施例四农杆菌转化拟南芥及转基因植株筛选将构建好的pBI35S-TPSP质粒通过电击转化导入农杆菌GV3101，挑取阳性的含质粒的农杆菌GV3101单克隆，培养至菌液OD600为0.8左右，离心收集菌体，弃上清，沉淀用浸润培养基(1/2MS，5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，pH5.8)重悬至菌液OD600在0.8～1.0左右。将菌液滴在拟南芥未开花花序上，用保鲜膜封好保持湿度，23℃暗培养过夜后，再移至23℃温室正常培养。
待果荚成熟，收取种子，将拟南芥种子灭菌后种于含50mg/L Kana的1/2MS培养基上，筛选抗性苗。拟南芥放置在23℃光照培养箱中，三天发芽，十天左右取出抗性苗，移至培养土中，16h/8h光/暗条件下23℃恒温培养。
转基因植株的筛选与鉴定种子消毒灭菌后播于含50mg/L Kana的1/2MS培养基上，筛选抗性苗。放置培养皿于23℃培养箱中萌发，三天后发芽，一周后观察。转基因苗生长正常，非转基因苗变黄枯萎。
移出阳性苗，待其叶片长到合适大小，抽取基因组DNA，PCR鉴定，结果表明都为阳性转基因苗，参见图12。
实施例五转基因植株的逆境生理和分子检测1、冷冻处理含kana的1/2MS培养基上筛选出来的pBI35S-TPSP抗性苗移到不含kana的1/2MS上，处理前与野生型WT无差别。-20℃放置5h后，放置于23℃光照培养箱回复培养，第二天野生型WT与pBI35S-TPSP全部白化；在第五天的时候，有部分转基因苗回复；而与此同时处理的野生型WT并未出现回复，参见图13。
2、干旱处理先用喷壶将50ml水把干燥的土壤表面喷湿，再将从含kana的1/2MS培养基上筛选出来的抗性苗移出并栽种到表面湿润的培养土中，移好后用保鲜膜覆盖，一天之后小苗回复后，揭开保鲜膜，放置一天，培养土表面的水分自然风干之后，植物处于干旱状态。一天之后复水，表型如图14转空载的转基因植株出现枯萎的症状，未能回复；而其他的导入外源基因DvTPSP的转基因株并未枯萎，且出现了回复。
3、冷冻处理分子检测将长8-10片子叶的拟南芥置于-7℃下胁迫，分别在0h，1h，2h，4h，6h，8h，20h，32h取材料。分别抽取RNA，RT-PCR检测，参见图15。结果表明WT和转基因对照拟南芥不表达TPSP，且随着处理时间的增加均无变化；转pBI35S-TPSP拟南芥组成型表达TPSP；转pBI29A-TPSP诱导表达TPSP；转pBI29B-TPSP由于rd29B启动子在冷冻时诱导表达比rd29A迟缓，在32h内暂时没有看出TPSP的表达变化。
4、干旱处理分子检测转基因植株进行干旱胁迫，将长至8～10片子叶的拟南芥小心从土壤中连根拔出，放在滤纸上，保持空气湿度为60％，分别在0h，1h，2h和4h取样，抽取RNA，RT-PCR鉴定，由于WT，C，pBI35S-TPSP在2hr后RNA样本降解，故未采用。结果显示，WT和转基因对照的海藻糖不表达；但在转pBI35S-TPSP的拟南芥中组成型表达；pBI29A-TPSP转基因苗的TPSP表达量随着处理时间而上升；转pBI29B-TPSP也有TPSP的表达，参见图16。
序列表<110>上海大学<120>杜氏盐藻TPSP基因、其编码蛋白及其克隆方法和植物转化载体的构建方法<160>14<210>1<211>3204<212>DNA<213>杜氏盐藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>
<222>
<400>32041GGCACGAGGA GCCACCCAGC AGCAGCCCAG ATTATACAGG AGGTGGTGC51 ACTGTGCACA GGCTGCAGCA GGGGGCAGCA TTCACCCAGC ATTAAGCCAG101 CCAGCATGCT TAGCAGCCAT GCCAAGTCCT CCAGCTCTTC CAGGAACCTG151 GCAGGGATGC TGGAGAACGG GGGATTTGAG GGAGAGGGCT CTGGCAGTTG201 CGGGGGAAGC AGGCAGCAGG CGCGCGACCC TAGGCGCACC AGCCTGAGTG251 TGAACAGTGG GCGAGTAATC ATTGCGTCCA ACCATCTGCC GCTGCGGGTG301 AAAAAGAGCT CCACAGGAGA GTGGCAGTTC GAGTTCGATG AGGACGCGCT351 GACCGCGCAG GCCAAGGATG GCGTGCCGCG CTCGCACTTC CAGGAGGTGC401 TGTATGTGGG TGGCCTGCCC GTGGACGTGG AGCCTGAGGA GCAGGAGAAC451 ATCGCCATCA AGCTGAAGGA CCTGTACAAC TGCTGCCCTG TGTACCTGGA501 CTCAGCTGTG AAGGAACGTT TCTACAAGGG CTTCTGCAAG CAGCAGCTGT551 GGCCGCTCTT CCACTACGTC CTGCCTGGCT CCCCCAGCAG CTCCCAGCGC601 TTCAATGTGG AGTTCTGGCA GGCGTATGTC AAGGCCAACA AGTGCTTTGC651 GGACAAGATC GTGGAGGAGA GCCTCACAGA CACCGAGTTT GTGTGGATCC701 ATGACTACCA CCTGCTGGTC CTGCCCTCCC TCCTGCGCAA GCGCTTCAAC751 CGCATCCGTG CCGGTGTCTT CCTGCACTCA CCCTTCCCCT CGTCAGAGAT801 CTTCAGGACC TTCCCCAAAC GCGAGGAGCT GCTCCGCTCG CTGCTGAATG851 CAGATTTGAT AGGTTTCCAC ACGTTCGACT ACGCTCGCCA CTTCCTGTCA901 TGCTGCTCGC GCATGCTGGG CCTGGAGCAT GAGACTTCTA GGGGCTCCAT951 CACCATAGAC TACTACGGCC GGACAGTGGG CATCAAGATC ATGCCGACAG1001 GTGTAAACCC CAAGCGCTAC CTGGACGGCT TCTCGTGGGA TGAGTTCAAG1051 TGGAGGCGTG GGGAGCTGGA GGCGCAGTTC AAGGGCATGA CGGTGCTAGC1101 GGGCGTAGAT GACATGGACA GCTTCAAGGG CATCGACCTG AAGCTGCAGG1151 CGTTCGAGCG GCTGCTAGAG TACCATGCTG AGTGGCGGGG CAAGGTGGTG1201 CTGGTCCAGG TCACCAACCC ACCGCGCTCC ACGGGCCACG ACATCACTGA1251 GCTGCATGCC TTTGTGACCA ACCTGGTGGC GTCCATCAAC TACAAGTACG1301 GCAACCCATC CACCAACTAC GTGCCAGTTC ACTACCTGGA GCGCCACGTG
1351 CCGCTGCATG AGCGCATGGC TTTCTACAGC ATCGCGGACT GTGTGGTGGT1401 GACTGCGACG CGCGACGGCA TGAACCTTGT GCCCTATGAG TACATCGTGT1451 GCCGGCAAGG GTCGGATACC ACTCCATGCG CTGAGTCGAC TGTGGAGTCG1501 GGGCCCAGGG ACTCCATGCT GGTCGTGTCA GAGTTCGTGG GCTGCTCGCC1551 ATCGCTCAGT GGCGCCATCC GCGTGAACCC CTGGTCCATC GACAGTGGCT1601 ACAACGGCAT GTACGCAGCC ATCTGCATGC CCCTGGAGCA CCGCCGGCTG1651 CGGCACCAGA AGCACTGGCG CTATGTCAGC CAGCACACCG TCGCATTCTG1701 GGCGCAGTCA TACCTCATGG ACCTCGTGCG CGTGACGCGC AACCACGTGA1751 CCATGAAGTG CTACGGCCTT GGCCTGGGCC TGGACACCTT CCGCATGGTG1801 GCGCTGGATG CCAACTTCCG AAAGATGGAG GAGTCGCAGG TGGCCGCCAC1851 ATACAAGAGC TCCAAGAGCC GTGTGTTCTT CCTGGACTAC GATGGCACCC1901 TCACCGCGGG CCAGCACACA TCCATCACGC TTGCTCCGCT GGATGAGGTG1951 CTGCAGGTCC TGCGTGCGCT GACTGCTGAG CCGCTCAACA AGGTGGTGCT2001 CTTCAGCGGG CGCCCCAAGG CAGAGCTGCA GGAGTGGTTC GCTTCAGTGC2051 CCAACCTCGC GCTGGTGGCG GAGAACGGCT GCTACCTGCG CCTAGGAGAG2101 GGCCAGACCT GGAGGTCGCA CCTCACACCT GGCCTGCAAG TTGCTGACCA2151 GTCGTGGGTC AGCCTGGTGG TGGCTGCGGA CTTTGGGTGG AAGAAGATGG2201 CGCTGCCCAT CCTGCAGCAG TACCAGGAGA GCACAGATGG CAGCAGCATC2251 GAGGCCAAGG AGAGCGCGCT GGTGTGGTAC TACAAGGATG CAGACCCCGA2301 TTTCGGGAGC TGGCAGGCCA AGGAGCTGTT GGATCACCTG GAGGGCGTGC2351 TGTCCAATAA GCCCGTTGAG ATTGTGGGCG GCTCGTCGGC TGTTGAGATC2401 AAGCCGCAGG GCGTGTCCAA GGGTCAGGCA GTGGAAAAGA TGCTGGGGCA2451 GTTGTATGGC TACCCCGCGA TCGCGGAACG CCGCAGCAGC AGCAGCAGGC2501 CGATGGGGCG GCCCAGCAGC GACGCCAGCG AGCGCAGACC CTCCTCCTCC2551 CGCTTCAGCA TGAGTGACAG AGGGCCCTCT GCTGGCAGCG CAGCAGTGCA2601 GAGCGCTGCA AGCTCAGTGC AGGGTGGTGG TGCTGAGGCG GCAGCACAGC2651 AAGAGCTCGC TGCTGCAGGC AAGGGCCCCG ACTTTGTGCT GTGCATCGGG2701 GACGACCGCA GTGATGAGGA CATGTTCACG AGCATAGAGA TGATGCGCGC2751 GTCGCCGCAG ATGATGTCAT CCGAGGTCTA CGCATGCACA GTGGGTCAAA2801 AGCCCAGCCG CGCCCCCTTC TACCTGAACG ACCCTGGAGA AGTGTTGCAC2851 CTCCTCGCGC GCCTGGTGGG CATCAACCTG CCCAACCTGC CCCTCTAGAT2901 TTGGAGAGAG CGAGCGTGTA TGTGTGTGTG CATCTGATCC GTGCGAAACA2951 GAAAACAGAA AATGGATGCC CTGCGATTCT GGGTTGTTGG GCACCATGCT3001 TTCTTGGCTT TTGTGTTCCT TTTTTTGTTT TTTAGGCAGT TGCTGGGTGC3051 AAGCACATTT TTTTGGCTGT TGTGCTGCAC GTTTGCTTGT CTGCTGAGCC3101 ACTGGGCTCT CACTTGCCCC AAGGCTGCCA TACACAGCTA CAGCACCCTG3151 ATTCGTGGGG TGGTGTTCAT GGCATGCCTA TAAGCCTGGG GCCTTTTTCC3201 TTTC<210>2<211>930<212>氨基酸<213>杜氏盐藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>
<222>
<400>9301 MLSSHAKSSS SSRNLAGMLE NGGFEGEGSG SCGGSRQQAR DPRRTSLSVN51 SGRVIIASNH LPLRVKKSST GEWQFEFDED ALTAQAKDGV PRSHFQEVLY101 VGGLPVDVEP EEQENIAIKL KDLYNCCPVY LDSAVKERFY KGFCKQQLWP151 LFHYVLPGSP SSSQRFNVEF WQAYVKANKC FADKIVEESL TDTEFVWIHD201 YHLLVLPSLL RKRFNRIRAG VFLHSPFPSS EIFRTFPKRE ELLRSLLNAD251 LIGFHTFDYA RHFLSCCSRM LGLEHETSRG SITIDYYGRT VGIKIMPTGV301 NPKRYLDGFS WDEFKWRRGE LEAQFKGMTV LAGVDDMDSF KGIDLKLQAF351 ERLLEYHAEW RGKVVLVQVT NPPRSTGHDI TELHAFVTNL VASINYKYGN401 PSTNYVPVHY LERHVPLHER MAFYSIADCV VVTATRDGMN LVPYEYIVCR451 QGSDTTPCAE STVESGPRDS MLVVSEFVGC SPSLSGAIRV NPWSIDSGYN501 GMYAAICMPL EHRRLRHQKH WRYVSQHTVA FWAQSYLMDL VRVTRNHVTM551 KCYGLGLGLD TFRMVALDAN FRKMEESQVA ATYKSSKSRV FFLDYDGTLT601 AGQHTSITLA PLDEVLQVLR ALTAEPLNKV VLFSGRPKAE LQEWFASVPN651 LALVAENGCY LRLGEGQTWR SHLTPGLQVA DQSWVSLVVA ADFGWKKMAL701 PILQQYQEST DGSSIEAKES ALVWYYKDAD PDFGSWQAKE LLDHLEGVLS751 NKPVEIVGGS SAVEIKPQGV SKGQAVEKML GQLYGYPAIA ERRSSSSRPM801 GRPSSDASER RPSSSRFSMS DRGPSAGSAA VQSAASSVQG GGAEAAAQQE851 LAAAGKGPDF VLCIGDDRSD EDMFTSIEMM RASPQMMSSE VYACTVGQKP901 SRAPFYLNDP GEVLHLLARL VGINLPNLPL<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3GTGTGGTACTACAAGGATGCAG22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>4ATGTCCTCATCACTGCGGTCGT22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5ACGGGCTTATTGGACAGCAC 20<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ATGCCCGGGAATTCTGGTCAGTCCCTTATG30<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7ATGGAGCTCTCGAGGTAGCAATTCCCGAG 29
<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8GGAGAACGGGGGATTTGAGGGA22<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9TGACAGGAAGTGGCGAGCGT 20<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10AGGAAGCTTATGGAGGAGCCATAG 24<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11AGGTCTAGATGAGTAAAACAGAGGAGGG 28<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12AGGAAGCTTCGTTGACAGAAACAGTC26<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>13ATGGGATCCTTCGTGTCTCTGAGAA 25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>14ATGGGATCCTTCGTGTCTCTGAGAA 2权利要求
1.一种杜氏盐藻TPSP基因，其特征在于该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的杜氏盐藻TPSP基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO2所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的杜氏盐藻TPSP基因的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤a.根据EST拿到的三个重叠群contig设计的引物序列P6(+)5′-gtgtggtactacaaggatgcag-3′，P6(-)5′-atgtcctcatcactgcggtcgt-3′，在盐藻的BAC文库中进行筛选，得到一段约1.5kb的片断；对这段片断进行测序，并与盐藻的cDNA序列进行对比，得知这段序列跨一个内含子；再以位于外显子上的P6(+)为正向引物，在内含子上设计一条反向引物P6(-2)5′-acgggcttattggacagcac-3′，筛选盐藻的BAC文库；得到四个阳性克隆，将这四个阳性克隆分别用Not I，EcoR I和HindIII进行酶谱分析，将其中包含的片断最多的第一个克隆挑出做鸟枪文库；b.将步骤a所挑出的克隆，用Large Construct Kit(QIAGEN)抽提BAC质粒，将得到的BAC片断进行物理破碎，得到的片断大约2～4kb；将此2～4kb的片断割胶回收，载体是用Sma I酶切去磷的pUC18制得；将回收的2～4kp片断连入线性化的pUC18进行测序，测序引物为M13(+)(-)，一共测了九块96孔板，大约864个克隆；c.将上述的864个克隆的原始数据输入Phred/Phrap的Linux程序，得到5个较长的contig，其长度分别为35945bp、26502bp、4913bp、3076bp、1407bp；经GENSCAN和FGENSH两大软件的预测，其中长度为35945bp的congtig即为DvTPSP cDNA的全序列，该序列包含3.2kb的开放阅读框。
4.一种根据权利要求1所述的杜氏盐藻TPSP基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.质粒pBI121的改建根据盐藻TPSP基因的序列，设计DvTPSP正、反义引物。GUS(+)5‘-atgcccgggaattctggtcagtcccttatg-3‘SmaI EcoRIGUS(-)5‘-atggagctctcgaggtagcaattcccgag-3‘SacI XhoITPSP(+)5‘-ggagaacgggggatttgaggga-3‘TPSP(-)5‘-tgacaggaagtggcgagcgt-3‘通过酶切、补平的方式破坏pBI121中NOS终止子后的EcoR I酶点，得载体pBI121(E-)；然后，以pBI121为模板，用GUS上、下游引物PCR扩增GUS基因，PCR产物用Sma I/Sac I双酶切，回收GUS片断，并克隆至pBI121(E-)的SmaI/Sac I间，从而在pBI121(E-)的GUS基因上游Sma I酶点后及下游Sac I酶点前分别添加EcoR I和Xho I酶点，得载体pBI121(E+/X+)；b.拟南芥rd29A/rd29B基因诱导型启动子元件的克隆根据文献上发表的拟南芥中的逆境诱导型基因rd29A及rd29B的启动子序列，设计并合成了两对引物，Prd29A(+)5‘-aggaagcttatggaggagccatag-3‘Hind IIIPrd29A(-)5‘-aggtctagatgagtaaaacagaggaggg-3‘Xba IPrd29B(+)5‘-aggaagcttcgttgacagaaacagtc-3‘Hind IIIPrd29B(-)5‘-atgggatccttcgtgtctctgagaa-3‘BamH I通过PCR的方法，从拟南芥基因组中扩增到rd29A及rd29B的启动子序列Prd29A和pRD29B；pRD29A和pRD29B分别用HindIII/Xba I及HindIII/BamH I双酶切，回收两启动子片断，并分别克隆至pUC19中HindIII/Xba I及HindIII/BamH I酶点间，得pUC29A及pUC29B；c.植物转化载体的构建将Prd29A及Prd29B分别从pUC29A和pUC29B中切出，并分别克隆至pBI121(E+/X+)中，取代原有的CaMV35S启动子，从而获得两个逆境诱导型植物表达载体pBI29A及pBI29B，然后，将TPSP从pBK-TPSP中切出，并分别克隆至pBI121(E+/X+)、pBI29A及pBI29B中，取代原有的GUS基因，从而获得了三个分别由CaMV35S启动子、rd29A及rd29B控制的盐藻TPSP基因的植物表达载体pBI35S-TPSP、pBI29A-TPSP及pBI29B-TPSP。
全文摘要
本发明涉及一种杜氏盐藻TPSP基因、其编码蛋白及其克隆方法和植物转化载体的构建方法。该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。本发明首次发现杜氏盐藻DvTPSP基因，并首次提供杜氏盐藻DvTPSP基因的全长cDNA序列；经过序列分析，并与其他物种TPS基因对比，可知该基因在盐藻中编码海藻糖－6－磷酸合成酶和海藻糖－6－磷酸磷酸酯酶。然而，该基因和已知的海藻糖合成酶基因有较大的不同，是在盐藻中首次发现并首次克隆到一个新的海藻糖合成酶基因。将该基因转入不同的酵母突变体中进行功能鉴定，发现该基因在盐敏感突变体G19中具有一定的盐耐受性。另外，将该基因通过农杆菌遗传转化高等植物，进行了分子鉴定和逆境生理分析，结果证明该基因能提高植物的逆境耐受性，特别是抗旱能力，因此该基因具有应用到植物抗逆基因工程的价值。
文档编号C12N15/82GK101033469SQ20071003742
公开日2007年9月12日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者许政暟, 宋任涛, 孟祥宗, 罗塞凡, 李启云, 董虹云, 李杉 申请人:上海大学