专利名称：一种组织芯片制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织芯片制作方法，本发明尤其是涉及一种能精确位点取 材的组织芯片制作方法。
背景技术：
组织芯片(tissue chip)，又称组织微阵列(tissue microarray， TMA)， 是继基因芯片、蛋白质芯片之后出现的又一种重要的生物芯片技术。这一技术 由美国国立癌症研究院的Kononen等于1998年在Nature Medicine上首次报 道[l]。它是将数十至上千个小组织按照设计整齐地排放在一张载玻片上而制 成的组织切片。
由于现有组织芯片制作方法需要专门的仪器，费用昂贵，且取样位点不够 准确，存在偏差，不利于TMA工作的广泛开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织芯片制作方法，解决了以往制作组织芯片中 的一系列难题，首次实现了精确位点取样。
本发明提供了一种组织芯片制作方法，包括受体蜡块的制作及打孔、待取 位点标记及供体蜡块的制作、供体蜡块的取样、阵列位点信息记录、阵列蜡块 的处理和切片的步骤，其特征在于用以下步骤制作待取位点标记及供体蜡块-(a)在取材时用针在蜡块的左上象限l/3处打孔做标记，作为XY轴的原点a， (b) 以a为原点，分别在显微镜下测出需要取材的位点在水平轴(X轴)和垂直轴(Y 轴)上的坐标距离，(c)返回到蜡块上相应的坐标位点做标记，(d)用采样 针在供体蜡块欲取出部位上打孔采样，(e)在阵列蜡块(受体蜡块)上准确植 入样品。
本发明还提供了所述组织芯片制作方法中供体蜡块的取样步骤所使用的 工具，其特征在于在两个内空的矩形直角边上刻上精确刻度，取样时用两个矩 形相对的直角两边组成一个中空矩形，按照前面显微镜下测量的距离和方向，以打孔点为矩形的一个直角的顶点，对角顶点就是要取样的位点的精确位置。 组织芯片由于它的高通量，平行性和科学性无疑会给科学发展的飞跃提供一个 非常优秀的平台，由于这项技术还不很成熟，需要专门的昂贵设备，且可操作 性不好，国内对它的研究还处于起步阶段，本文全面系统的阐述了组织芯片的 制作方法和设备的制作，解决了制作组织芯片技术中的所有难题，可以更好的 促进我国组织芯片技术的蓬勃发展，在全国迅速的建立系列组织库。
我们技术的优势(1)依托石蜡切片的现有设备，自己设计和制作各种 工具和设备，成本低，可操作性强，非常有利于开展工作。(2)成功实现点 对点的精确位点取材，从而避免了以前报道的由于肿瘤异质性所造成的无效芯 片偏差。(3)精确记录每一个芯片位点的信息，便于以后试验。能够有效的 建立系列正常和肿瘤组织芯片库。(4)我们的各种组织芯片蜡块全部统一大
小规格，能够与包埋常用的底板兼容，方便了切片，也能够使技术规范化、标
准化，便于以后计算机阅片。(5)在实践中可以很方便的组合所需要的各种 组织芯片。
由于信息量大，效率高，消耗试剂少，TMA技术的提出，使以免疫组织化 学和原位PCR为代表的分子病理TMA具有普通切片无法比拟的优越性非常微小 (直径0.6-2.0mm)，数量多(目前可达1000个点阵)，形状规则，排列有序， 具有高通量和平行性，检测结果的科学性和可比性强，信息量大，效率高，消 耗试剂少。这一技术的提出，使以免疫组织化学和原位PCR为代表的分子病理 学研究进一步迈向规范化、科学化和高技术化[3]。在对肿瘤的分子改变与临 床病理特征的联系研究上，TMA将提供巨大帮助，同时TMA也可用于基因产物的 筛选、生物试剂的测试、病理质量的控制及标准化、教学和考试以及制作微縮 组织学和病理学图谱。随着TMA技术的不断发展，肿瘤及正常组织库的建立， TMA的构建形成系列化，病理学的作用将面临转变，即在肿瘤分型时不再把重 点放在组织学形态改变上，而是从多方面、多水平地为临床治疗提供更多资料。 相信在不久的将来，TMA技术在肿瘤的诊断和研究领域中将发挥更加重要的作 用。
具体实施方式
所使用材料均为市售。 实施例1打孔针和取样针的制作。打孔针和取样针均可以用带实芯针的穿刺针自己
磨制， 一套针有四件，两个空心针及配套的两个实心针。针径可以是0.6 — 2.0mm，须注意打孔针径比取样针径小1号(即打孔针的外径与取样针的内径 一致)，以便取样组织的直径和打孔孔径一致，以防组织芯片与受体蜡块连接 不紧脱落，我们使用的取样针直径是1.6mm，打孔针和取样针的外周套彩色塑 料膜以标记针进入蜡块的深度，打孔针打孔的深度要比取样针深l.Omm。有人 报道是采用微雕开窗标记刻度技术，我们认为不可取，因为针用久不锋利时要 磨，会影响刻度[2]。
实施例2
通量定位模板的制作。根据自己的需要，可以使用不同直径的针制作不同 通量的模板(最好用透明材料)，孔间距可以为L0mm到2.0mm，建议刚开始 操作不熟练时间距大一点(2.0mm)，四周留白距离大一点(3.0mm)，以防止 打孔歪了或裂了，影响效果。模板的四周最好是三周都有挡板，模板的内径大 小和受体腊块相同，以便模板卡在受体蜡块上，操作起来很轻松。我们使用的 通量模板有两种(1)通量阵列5X7，取样直径2.0mm，间距2. Omm; (2) 通量阵列7X9，取样直径1. 5mm， 间距1. 5mm;蜡块统一为30. 0X25. Omm， 厚度15.0mm，便于管理。
实施例3
TMA制作方法，包括以下步骤
受体蜡块的制作及打孔 (1)可以使用熔点在60 — 62'C普通切片纯净石 蜡制作，依据自己的需要设计制作规格与模板一致大小的各种包埋框；(2) 倒入融化的液体石蜡，在蜡块的面加上普通塑料包埋底盒，以便切片时固定蜡 块和编号，也可直接用标签纸蜡封编号(切片时有可能使底盒与蜡块脱落，但 蜡块依然很规整不影响切片)。浇注液体石蜡后开始计时，40—50min后(具 体时间可能因为室温的不同而不同)蜡块成型并且处于未完全固体化状态，剥 离包埋框，开始打孔；(3)打孔时先将定位模板卡住受体蜡块固定，然后用 对应型号的打孔针通过定位模板上的阵列孔打孔，深度为6.0mm。打孔需快速 进行，否则蜡块变冷变硬时容易发裂，此时也可以放入摊片机水箱中(水温46 °C)加热3 — 5min，使蜡块受热变软而不易发裂。待取位点标记及供体蜡块的制作 这是技术创新的关键。由于多数取材 蜡块是四方形的，很少是不规则的，使我们在显微镜下阅片后很难回到蜡块上 的某一点精准取材，常用方法是在玻片上画圈标记，再回到蜡块上目测找位点， 这种方法由于取样位点象限不好确定而需要多处取样，这大大增加了我们的工 作量和成本。我们的解决方法是坐标定位法准确定位(1)在取材时用大头 针在蜡块的左上象限1/3处打孔做标记(也可在已成形的蜡块上用小针打孔标
记)，作为XY轴的原点。(2)我们阅片时以此打孔点位为原点，分别在显微 镜下测出我们要取材的位点在水平轴(X轴)和垂直轴(Y轴)上的坐标距离， 再返回到蜡块上相应的坐标位点做标记，取样。从而实现点对点的精确位点取 样，仅一次就可成功。
供体蜡块的取样 (1)供体蜡块取样前需加热，方法有烤箱加热和水浴 加热，我们认为水浴更方便，且易于控制。水温46 — 48'C，加热5—10min;
(2)依据前面测量的坐标找到需要取材的位点，用采样针在供体蜡块欲取出 部位上打孔采样，深度5.0mm (比受体蜡块孔浅l.Omm)，深度可以先在针上 用彩色塑料膜标记，采样时需缓慢用力，防止供体蜡块裂开，到达要求的深度 后要旋转两周以便针芯充满。(3)在阵列蜡块(受体蜡块)上找到要填入的 位点，用实心针芯缓缓推出，准确植入，摁平要使组织芯的平面和蜡块的基本 一致。(4)为了更方便准确的取样，我们制作了简单的取样定位工具，制作 方法在两个内空的矩形直角边上刻上精确刻度，取样时用两个矩形相对的直 角两边组成一个中空矩形，按照前面显微镜下测量的距离和方向，以打孔点为 矩形的一个直角的顶点，对角顶点就是要取样的位点的精确位置。以上创新方 法我们取名为坐标定位矩形模板取样法。
阵列位点信息记录 (1)在植入组织芯时在左上象限非对角线上的某
一个位点要空出，以便识别阵列的方位。有人报道采用植入脑组织来定位，我 们实践后认为还是不植入方便，因为1)不植入组织芯的阵列，我们肉眼就可 以确定方位，而植入脑组织的阵列要在显微镜才能确定；2)脑组织在摊片时 有时容易散开，从而增加确定方位难度。(2)信息记录采用二维记录方式， 精确记录每一位点的信息。水平方向从左到右每个点坐标标记为A、 B、 C、…， 垂直方向每个点坐标标记为1、 2、 3…，这样每个位点都有由一个由字母和数 字组成的坐标，如(A3) ， (B5) ， (G2)等等。可以在登记本上记录每个位 点的信息，很方便的建立组织芯片库。阵列蜡块的处理 阵列制作完毕后，将阵列蜡块含有组织的一面平放在 一玻璃板上，置于56'C恒温箱内，每5min观察一次，待蜡块和玻璃板中间出 现液体状的石蜡把蜡块取出，置于冰箱内冰块上冷却。有人报道是在常温下冷 却，我们实践和比较后认为冰箱内冷却效果更好，因为常温下冷却蜡块必须 底面(有组织芯片的面)朝上，这时液体石蜡容易流出，使蜡块的边角变钝， 这样影晌边角的组织芯的切片。切片 冰好后以4um厚切片，裱贴于经2% 3-氨丙基三乙氧硅垸(APES) 丙酮液处理过的载玻片上。微阵列蜡块的切片用德国徕卡一次性刀片在徕卡切 片机上切片，与常规组织切片基本相同，但是因为蜡块内的组织块多，在裱 片时操作要轻，速度掌握适宜，否则容易离断或组织阵列偏移，另外，还要注 意水温，过低切片展不开，过高易拉长，拉断，保持在48'C左右较合适。用一 次性切片刀比用普通厚钢刀切片质量要好。
权利要求
1.一种组织芯片制作方法，包括受体蜡块的制作及打孔、待取位点标记及供体蜡块的制作、供体蜡块的取样、阵列位点信息记录、阵列蜡块的处理和切片的步骤，其特征在于用以下步骤制作待取位点标记及供体蜡块(a)在取材时用针在蜡块的左上象限1/3处打孔做标记，作为XY轴的原点a，(b)以a为原点，分别在显微镜下测出需要取材的位点在水平轴(X轴)和垂直轴(Y轴)上的坐标距离，(c)返回到蜡块上相应的坐标位点做标记，(d)用采样针在供体蜡块欲取出部位上打孔采样，(e)在阵列蜡块(受体蜡块)上准确植入样品。
2，如权利要求1所述的组织芯片制作方法中供体蜡块的取样步骤所使用的工 具，其特征在于在两个内空的矩形直角边上刻上精确刻度，取样时用两个矩形相对 的直角两边组成一个中空矩形，按照前面显微镜下测量的距离和方向，以打孔点为 矩形的一个直角的顶点，对角顶点就是要取样的位点的精确位置。
全文摘要
本发明公开了一种组织芯片制作方法。此法包括受体蜡块的制作及打孔、待取位点标记及供体蜡块的制作、供体蜡块的取样、阵列位点信息记录、阵列蜡块的处理和切片的步骤，其中用以下步骤制作待取位点标记及供体蜡块(a)在取材时用针在蜡块的左上象限1/3处打孔做标记，作为XY轴的原点a，(b)以a为原点，分别在显微镜下测出需要取材的位点在水平轴(X轴)和垂直轴(Y轴)上的坐标距离，(c)返回到蜡块上相应的坐标位点做标记，(d)用采样针在供体蜡块欲取出部位上打孔采样，(e)在阵列蜡块(受体蜡块)上准确植入样品。该发明能成功实现点对点的精确位点取材，从而避免了以前报道的由于肿瘤异质性所造成的无效芯片偏差。该发明还能精确记录每一个芯片位点的信息，便于以后试验。能够有效的建立系列正常和肿瘤组织芯片库。
文档编号C12Q1/00GK101294951SQ20071004016
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者漆楚波 申请人:漆楚波