专利名称：一种全层生物角膜及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物工程中的医用材料领域，尤其涉及以异种角膜脱细胞 基质为载体在生物反应器中培养构建而成的全层生物角膜,这种生物角膜可用于 生理、药理和病理学基础研究，又可作为供体应用于角膜移植和屈光手术。
背景技术：
角膜疾病是一种发病率高、治疗困难的顽固性致盲眼病，各种原因所致的角 膜损伤、溃疡、瘢痕及水肿混浊是当今世界致盲的主要原因之一。目前治疗角膜 混浊的主要方法是板层或穿透性角膜移植，但受到了角膜供体来源缺乏、角膜供
体老龄化、术后并发症以及术后免疫排斥反应等现状的限制。高分子PMMA等材 料的临床应用推动了人工角膜的发展，使其成为继供体来源角膜移植后另一种治 疗途径，但异质性材料与生物组织之间的相容性问题尚未完全解决，由此引起排 异、渗漏感染等严重的并发症，其设计和植入方式还不够成熟。
利用新兴的生物工程和组织工程技术为体外构建出全层生物角膜以替代供体 角膜移植提供了新的思路和和方法。然而生物角膜的构建由于缺乏合适的载体和 近似生理的培养条件，使其研究停留在初步阶段，虽然体外构建人工角膜模型已 初具正常组织结构和功能，但还不能用于移植。最早20世纪90年代Minami等以 胶原混合角膜基质细胞构建出基质层后再种角膜上皮和内皮细胞，得到初具角膜 三层细胞结构的雏形，近年来Griffith等用戊二醛交联的胶原作为人工角膜的支 架，角膜成纤维细胞混合在胶原中培养，将上皮细胞培养在支架表层，内皮细胞 培养在胶原支架的底层，从而构建出与人角膜形态、结构和组织特性功能相似的 角膜等效物。而中国专利CN 1579342A也公开了"一种无细胞异种角膜基质及制 备方法和用途"，其提供了一种可用于人工角膜构建的无细胞异种角膜基质。
已有研究用于生物角膜构建的载体材料包括天然的细胞外基质、天然和合成 高分子材料的复合物、有机材料同无机材料的复合物。常见的有胶原，聚乳酸、 甲壳素、壳聚糖、纳米材料等，但尚未仿生制备出与角膜相近似的纤维板层结构。 角膜构建常用的这些载体也因透明性、机械强度、降解速度等参数并非最佳，构建出的角膜都不够理想。
要构建出全层生物角膜，其核心是建立角膜细胞与生物材料的三维空间复合 体，载体支架是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响构成的 组织形态与功能。角膜特有的结构是维持角膜透明、屈光、通透性等正常生理功 能的重要因素，通过生物化学方法将细胞成分去除而保留正常组织的细胞外基质 成份及结构的脱细胞组织基质作为支架，具有良好的生物学特性，而且来源广泛。 脱细胞角膜基质可保留正常角膜板层排列结构，并具有良好的韧性和适合细胞生 长的生理微环境，同时猪的角膜基质虽为异种的天然同质材料，但具有良好的生 物相容性，尤其是脱细胞处理后抗原性极低，是构建生物角膜的良好载体。
传统的角膜构建方法都是在培养皿中静态培养，不利于组织和细胞进行营养 交换和新陈代谢，而近年来生物反应器在体外细胞培养和组织重建研究领域中发 挥越来越重要的作用，通过模拟体内动态环境，为细胞生长提供不断新鲜的营养 物质并带走代谢产物，从而改善离体细胞的培养条件；同时细胞及组织在动态中 更有利于细胞外基质的分泌和细胞间的信号转导；细胞在生物反应器中有一定程 度的三维空间自由，有利于细胞-细胞、细胞-基质之间按组织学特性相互接触，且 不易形成坏死中心。生物反应器的上述特点使之成为组织工程化器官和组织体外 重建的理想装置。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的可用于移植的全层生物角膜，该全层生物角膜 以动物角膜脱细胞基质为载体，在所述脱细胞基质上还有体外培养和扩增的动物 角膜基质细胞、上皮细胞及内皮细胞。
本发明的另一个目的是提供这种全层生物角膜的构建方法，该方法通过以 下技术方案实现
(l)作为载体的脱细胞基质的制备取新鲜动物角膜，机械法去除上皮层、 撕除后弹力层后，浸于含l%TritonX-100， 4匸振荡72小时脱细胞，再用PBS 缓冲液反复振洗，组织采取切除前板层和后板层，保留中间三分之一厚基质层， 静置-80'C冻存过夜后，转入真空干燥处理24小时，所述脱细胞基质应用前分别 在PBS缓冲液和无血清的DMEM培养基中复水，4。C保存备用；(2) 基质、上皮和内皮细胞的培养和扩增无菌取另一动物角膜，显微镜
下剥离所述角膜上皮层、基质层，沿Descemet膜撕下内皮层，取角膜缘上皮 lmmxlmm组织块，贴壁法培养于含10%胎牛血清的DMEM: F12=l: 1的培养 基中；基质层用3%11型胶原酶，消化法制成细胞悬液种植于培养皿；胰酶消化 后弹力层上角膜内皮细胞，种植培养基中；各细胞静置37i:， 5。/。C02饱和湿度 培养箱培养，隔日换液，细胞生长大于80%融合时，胰酶消化、离心，制成细 胞悬液，按1 : 2或1 :3分配接种于新的培养皿传代培养，待细胞生长接近融 合后重复上述步骤依次传代消化、传代培养；
(3) 生物反应器内培养三维角膜基质层将角膜基质细胞转染绿色荧光蛋 白基因，对细胞进行荧光标记，然后制成浓度为2xl(^个/ml的细胞悬液于离心 管中，将制备的脱细胞基质载体置入，抽真空使载体浸于细胞悬液中，2小时后 取出细胞载体复合物置于24孔板，再次制角膜基质细胞悬液，以lmlOT针筒 注入载体中央部位，为0.1ml/载体，静置培养4小时后转入生物反应器；
(4) 角膜内皮和上皮细胞种植于基质及生物反应器内培养首先将生物反 应器内培养一周的基质层取出置24孔板，内皮面向上，将角膜内皮细胞制细胞 悬液，滴加于内皮面上，静置培养大于4小时后转入反应器内旋转，20转/分， 再次培养一周时取出，上皮面向上于培养皿，将角膜上皮细胞悬液滴加表面， 同样静置培养4小时后转入生物反应器培养，继续培养一周后终止。
本发明的再一目的是全层生物角膜在角膜移植、角膜屈光手术中作为医用 材料的应用。
本发明的主要特点在于通过生物化学方法制备的异种角膜脱细胞基质在形 态、结构以及生物相容性是作为体外构建生物角膜的良好载体，通过分别种植角 膜基质细胞、内皮细胞和上皮细胞，在生物反应器中模拟体内环境动态培养，可 在体外构建出近似正常组织结构和特性的全层生物角膜，这种生物角膜可用于模 拟生理性角膜进行生理、病理和药理学的基础研究，同时也可作为供体直接用于 治疗性角膜移植。
图1显示了制备的猪角膜脱细胞基质载体支架结构；图2显示了异种脱细胞基质载体植入兔角膜基质板层后宿主角膜； 图3显示了脱细胞基质载体植片于宿主角膜基质层间融合良好；
图4显示了构建的三维基质层内GFP标记的角膜基质细胞镶嵌于基质支架内
部；
图5显示了构建的全层生物角膜组织大体形态；
图6显示了全层角膜具复层扁平上皮层，基质板层和单层内皮细胞； 图7显示了扫描电镜下生物角膜表面上皮细胞呈叠层生长，排列紧密； 图8显示了扫描电镜下生物角膜内皮细胞呈单层的多角形细胞镶嵌排列； 图9显示了透射电镜下角膜基质细胞贴附于载体胶原纤维上，并分泌细胞外 基质；
图10显示了生物角膜上皮层细胞特异性角蛋白CK3表达阳性； 图11显示了生物角膜内角膜基质细胞波形蛋白vimentin表达阳性； 图12显示了生物角膜内皮细胞水通过道蛋白AQP1表达阳性。
具体实施例方式
下面将通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例1猪角膜脱细胞基质的制备及其生物相容性
取新鲜猪角膜，机械法去除上皮层、撕除后弹力层后，浸于含l%TritonX-100， 4。C振荡72小时脱细胞，再用PBS缓冲液反复振洗，组织采取切除前板层和后板 层，保留中间三分之一厚基质层,静置-80。C冻存过夜后，转入真空干燥处理24小 时。脱细胞基质在应用前分别在PBS缓冲液和无血清的DMEM培养基中复水，4'C 保存备用。制备的猪角膜脱细胞基质维持角膜原有的基本形态和韧性，呈水肿的 半透明状，扫描电镜下基质纵切面板层胶原纤维排列较整齐，波浪状，较致密， 纤维间可见大小不等的孔隙(见图1)。
将制备的猪角膜脱细胞基质植片植入新西兰大白兔角膜基质囊袋中:将白兔 以速眠新2mg/kg肌注全身麻醉，配以2%利多卡因lml球后注射麻醉；以直径为 7mm的环钻在角膜表面作标记，于角膜上方11点到1点钟位置标记处切开角膜 深度约达1/3 1/2角膜厚度，然后在此板层平面作层间分离，钝性分离基质板层 间边界达标记处，形成一囊袋状，用生理盐水冲洗植床；将脱细胞基质制成0.3mm厚、直径为5mm的移植片，从切口处移入兔角膜囊袋中，虹膜恢复器将植片展平， 10-0尼龙线间断缝合切口 。术后结膜下注射庆4万单位大霉素和2.5mg地塞米松， 涂四环素可的松眼药膏。
移植后一周内动物角膜移植区有水肿，4周后角膜透明度逐渐恢复，观察到 术后6个月角膜保持透明，未发生明显的排斥反应，亦无新生血管长入(见图2)。 通过取材角膜组织学观察，脱细胞基质植入受体后一直于基质板层间，与宿主角 膜基质融合较好，植入第8周时即可见宿主角膜基质细胞于植入物上下两端长入 脱细胞基质纤维内(见图3)，之后植入组织与宿主角膜板层逐渐融合难以观察出 边分界线。
实施例2兔角膜上皮、基质和内皮细胞的分离和培养
无菌取兔角膜，显微镜下剥离兔角膜上皮、基质层，沿Descemet膜撕下内皮 层。组织块种植法培养原代角膜上皮细胞去除浅层上皮细胞后将角膜缘切成 lmmx2mm组织块，上皮面朝下贴于培养皿底，孵箱中干燥半小时后加少量含10% 胎牛血清的DMEM/F12 (1: 1)培养基刚刚浸没组织块为好，过夜后添加培养液。 原代基质细胞获取采用联合消化和组织块法基质层组织块剪碎，置离心管中， 加入3%11型胶原酶热消化，于37。C振摇40min左右。当显微镜下观察到组织块松 散、形成网状胶原丝，其间漂浮着圆圆透亮的细胞时即终止消化，加5倍体积的 无血清培养基稀释，混匀振荡器后于离心机中1500r/min离心5分钟，弃上清液， 再加入PBS缓冲液洗涤，再次离心5分钟，弃上清液，然后加入10%FBS的 DMEM/F12 (1:1)培养基，吹打混匀重悬，将细胞悬液和残留未消化的组织块 都接种于培养皿，先加少许培养基让细胞和组织块贴壁，次日添加培养基。通过 消化后弹力层上的内皮细胞获取原代角膜内皮细胞的培养将撕下的后弹力层置 于无菌培养皿中，内皮面向上展平后加入含血清培养基，先置培养箱中孵育1天 后弃去培养液，加入PBS缓冲液洗涤一次，然后加入0.25W胰酶-0.02。/。EDTA混 合消化液，37'C消化15min左右。显微镜下观察到透明的后弹力层上六边形细胞 镶嵌排列，边界清晰，逐渐细胞皱縮，细胞间隙变大，当摇晃培养皿，大部分细 胞从后弹力层上脱落时，加含胎牛血清培养基终止消化，反复吹打后于离心机 1500r/min离心5分钟，弃上清液，再加入PBS缓冲液洗涤，再次离心5分钟，弃上清液，加入含15%胎牛血清的培养基制成2><104 3><104个/1111细胞悬液种植 直径为35mm培养皿中。各细胞静置37'C, 5%<:02饱和湿度培养箱培养，隔日换 液。细胞生长大于80%融合时，胰酶消化、离心，制成细胞悬液，按l :2或1 : 3分配接种于新的培养皿传代培养，待细胞生长接近融合后重复上述步骤依次传 代。
培养的各角膜细胞体外生长增殖良好，上皮细胞呈多角形，细胞间相互衔接 镶嵌，呈马赛克状；角膜基质细胞为梭形的细胞排列紧密，谱呈旋涡状、放射编 织状图案；内皮细胞为六角形或多角形，细胞间镶嵌紧密，呈铺路石状铺于培养 皿底。各细胞传代后生长增殖旺盛，可传至10代以上，细胞形态和增殖率仍与原 代基本相似，足够数量作为种子细胞种植载体，构建全层生物角膜。
实施例3生物反应器内培养三维角膜基质层
首先将角膜基质细胞转染绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)， 对细胞进行荧光标记。角膜基质细胞贴壁生长近70% 80%融合时，吸弃培养液， 将新鲜培养液和GFP重组腺病毒液以2: l的比例加入培养皿，置37"C， 5%C02 饱和湿度培养箱中过夜，次日弃去混合液，用PBS缓冲液洗涤两次，去除残留病 毒颗粒，然后再次加入新鲜含血清培养基，继续培养24小时，荧光显微镜下观察 细胞高表达绿色荧光后，可用于种植角膜脱细胞基质载体。
将GFP标记的角膜基质细胞消化、离心后制成浓度为2xl06/ml的细胞悬液， 以lmlOT针筒注入载体中央部位，约O.lml/载体，静置培养4小时后转入生物反 应器，生物反应器内角膜组织在旋转轮带动下，在培养液中轻微浮动。培养一周 后，取出细胞-支架复合组织，于激光共集焦显微镜下观察基质细胞与载体的三维 结构，通过GFP标记角膜基质细胞发出的绿色荧光，可见基质细胞镶嵌在载体支 架内，较均匀的生长，分布于不同板层间，形成三维立体结构的基质层(见图4)。
实施例4角膜内皮和上皮细胞种植于基质及生物反应器内培养
首先将生物反应器内培养一周的基质层取出置培养皿中，内皮面向上，然后 将培养的角膜内皮细胞制细胞悬液，滴加于内皮面上，静置培养大于4小时后转 入反应器内悬浮动态培养。再次培养一周时取出，此时将复合物上皮面朝上于培养皿中，将培养的角膜上皮细胞悬液滴加其表面，同样静置培养4小时后转入生
物反应器悬浮动态培养，继续培养一周后终止。
终止培养后，取出重建角膜组织，肉眼观察其大体形态透明度和厚度情况。
部分组织用中性福尔马林固定24小时，酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片HE染色， 光学显微镜下观察重建角膜组织结构。扫描电镜观察上皮和内皮面细胞在脱细胞 基质载体上生长形态结构，透射电镜观察基质细胞在载体板层间生长及活力情况。 对重建角膜组织各层细胞分泌蛋白进行免疫组化检测，上皮层检测角膜上皮特异 性角蛋白CK3;对基质层细胞进行波形蛋白vimentin检测；对内皮层检测与角膜 内皮细胞泵功能密切相关的水通道蛋白AQP1 。
生物反应器内构建的全层生物角膜薄而透明，为圆盘状，有一定的曲率和弯 度，直径8-10mm，厚度400-600pm，与正常哺乳动物角膜组织形态基本相同(见 图5)。通过组织切片HE染色对其结构进行观察，发现以角膜脱细胞基质载体构 建出的角膜组织初具角膜的全层结构，上皮层为复层扁平细胞层，基质层为胶原 纤维板层及其间镶嵌生长的梭形基质细胞，内皮面为一单层连续的扁平细胞层， 组织学上更近似正常角膜组织结构(见图6)。对生物反应器内培养的生物角膜各 层细胞进行超微结构的观察可见，在脱细胞基质载体的上皮表面，细胞呈多层重 叠生长，排列整齐，细胞为扁平形，体态饱满，相互紧密连接，并在形态上向梭 形变异，有的细胞表面有微绒毛(见图7);在载体内皮面生长的细胞为单层的多 角形细胞镶嵌排列，呈现典型的内皮细胞镶嵌样外观，细胞形态较饱满，细胞间 相互连接紧密(见图8);角膜基质细胞贴附于载体胶原纤维上，细胞内多内质网 等细胞器，并可见吞噬颗粒，细胞旁有细胞分泌的细胞外基质成分(见图9)。对 全层生物角膜各层细胞分泌蛋白进行检测，角膜上皮层细胞表达角膜上皮特异性 角蛋白CK3 (见图10);基质层细胞，胞浆中有棕色颗粒，即表达波形蛋白(见 图11);对内皮层检测与泵功能相关的水通道蛋白AQP1，免疫组化结果呈强阳性， 角膜内皮细胞高表达水通道蛋白(见图12)。
无需进一步详细阐述，相信阅读了本发明上述公开的内容后，本领域技术人 员可最大限度地应用本发明，可作各种改动或修改，因此，前面的实施方案应理 解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1、一种全层生物角膜，以动物角膜脱细胞基质为载体，其特征在于，在所述脱细胞基质上还有体外培养和扩增的动物角膜基质细胞、上皮细胞及内皮细胞。
2、 如权利要求1所述的全层生物角膜的制备方法，其特征在于通过以下技术方案实现(1) 作为载体的脱细胞基质的制备:取新鲜动物角膜，机械法去除上皮层、撕除后弹力层后，浸于含l%TritonX-100， 4"C振荡72小时脱细胞，再用PBS 缓冲液反复振洗，组织采取切除前板层和后板层，保留中间三分之一厚基质层, 静置-80'C冻存过夜后，转入真空干燥处理24小时，所述脱细胞基质应用前分别 在PBS缓冲液和无血清的DMEM培养基中复水，4t:保存备用；(2) 基质、上皮和内皮细胞的培养和扩增无菌取另一动物角膜，显微镜 下剥离所述角膜上皮层、基质层，沿Descemet膜撕下内皮层，取角膜缘上皮 lmmxlmm组织块，贴壁法培养于含10%胎牛血清且DMEM: F12=l: 1的培养 基中；基质层用3%11型胶原酶，消化法制成细胞悬液种植于培养皿；胰酶消化 后弹力层上角膜内皮细胞，种植培养基中；各细胞静置37"， 5。/。C02饱和湿度 培养箱培养，隔日换液，细胞生长大于80%融合时，胰酶消化、离心，制成细 胞悬液，按1 : 2或1 : 3分配接种于新的培养皿传代培养，待细胞生长接近融 合后重复上述步骤依次传代消化、传代培养；(3) 生物反应器内培养三维角膜基质层将角膜基质细胞转染绿色荧光蛋 白基因，对细胞进行荧光标记，然后制成浓度为2xl()S个/ml的细胞悬液于离心 管中，将制备的脱细胞基质载体置入，抽真空使载体浸于细胞悬液中，2小时后 取出细胞载体复合物置于24孔板，再次制角膜基质细胞悬液，以lmlOT针筒 注入载体中央部位，为0.1ml/载体，静置培养4小时后转入生物反应器；(4) 角膜内皮和上皮细胞种植于基质及生物反应器内培养首先将生物反 应器内培养一周的基质层取出置24孔板，内皮面向上，将角膜内皮细胞制细胞 悬液，滴加于内皮面上，静置培养大于4小时后转入反应器内旋转，20转/分， 再次培养一周时取出，上皮面向上于培养皿，将角膜上皮细胞悬液滴加表面， 同样静置培养4小时后转入生物反应器培养，继续培养一周后终止。
3、 如权利要求l所述的全层生物角膜，其在角膜移植、角膜屈光手术中作为医用材料的应用。
4、如权利要求2所述的全层生物角膜制备方法制备的全层生物角膜，其在 角膜移植、角膜屈光手术中作为医用材料的应用。
全文摘要
本发明的目的是提供一种新的可用于移植的全层生物角膜，该全层生物角膜以动物角膜脱细胞基质为载体，在所述脱细胞基质上还有体外培养和扩增的动物角膜基质细胞、上皮细胞及内皮细胞。本发明的主要特点在于通过生物化学方法制备的异种角膜脱细胞基质在形态、结构以及生物相容性是作为体外构建生物角膜的良好载体，通过分别种植角膜基质细胞、内皮细胞和上皮细胞，在生物反应器中模拟体内环境动态培养，可在体外构建出近似正常组织结构和特性的全层生物角膜，这种生物角膜可用于模拟生理性角膜进行生理、病理和药理学的基础研究，同时也可作为供体直接用于治疗性角膜移植。
文档编号C12N5/071GK101433478SQ20071017040
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者瑶 傅, 范先群 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院