专利名称：：一种快速鉴定耐盐鸢尾种群的分子检测方法
技术领域：
：本发明属于生物学领域中分子生物学的检测和判别方法。尤其涉及鸢尾属耐盐植物种群的分子检测和判别，同时还涉及应用于鸢尾属植物的遗传多样性检测、进化、遗传图谱构建和QTL(数量性状基因位点)检测等。二、
背景技术：
鸢尾属植物是园艺中最早久负盛名的花卉之一，其花色丰富、花型多样，大小各异，且抗逆性强，具有很高的观赏价值。大多数种类的鸢尾不能够在盐碱地上生长，或受到盐胁迫后生长受限甚至出现死亡。其中一类称为耐盐鸢尾的种类，不仅具有上述优点而且具有非常强的耐盐能力，能够在含盐量超过0.3%以上、PH8-10的盐碱地上正常生长和繁殖。这类品种对沿海城市的绿化和美化、位于盐碱地的油田地区的绿化、盐碱地的土壤改良具有重要作用。但是，一般从表型特征很难区分耐盐和非耐盐植株，尤其是从非耐盐鸢尾和耐盐鸢尾杂交后代筛选出耐盐个体，通常要进行生理测定和耐盐试验，这样不仅费时、费力而且可能破坏植株，另外生理指标判断结果常常也存在不确定性。植物的耐盐性状是受多基因控制的，耐盐植株和非耐盐植株在基因组上存在一定的差异性。与生理指标不同，在相对较短的时间内，基因组具有很好的稳定性，基本上不受环境影响，且取材方便、微量。因此，通过对植株在基因组差异性的检测和追踪其性状上的差异是完全可行的。DNA分子标记是快速检测生物基因组差异的重要方法之一，其中微卫星标记是具有多态性高、稳定性好、操作便捷等诸多优点，通过对目标植物种群进行微卫星标记的检测，可以区分在性状上存在明显差异的个体。一旦确定特定的标记后，我们就可以对目标植株进行判别。目前国内外尚无对鸢尾属植物耐盐种群分子快速检测的相关报道。三、
发明内容本发明目的是提供一套用于在非破坏性取样下鸢尾属植物耐盐种群分子快速检测技术和方法，准确、省时、省力。本发明目的是这样实现的获得鸢尾属植物耐盐种群分子快速检测技术和方法，根据给出的鸢尾属植物微卫星DNA分子标记9个引物序列及扩增条件和参数，对目标参试植株进行DNA提取和微卫星标记扩增，然后对分子数据采用统计软件分析得出植株耐盐和非耐盐种群的检测和归类。本发明的更具体的方案是*其中9个微卫星引物的序列和标记扩增条件为(1)引物序列01ForwardPrimer(5ReversePrimer02ForwardPrimerReversePrimer03ForwardPrimer(fReversePrimer(f04ForwardPrimerReversePrimer05ForwardPrimer(5ReversePrimer06ForwardPrimer(fReversePrimer(507ForwardPrimer(5ReversePrimer08ForwardPrimerReversePrimer09ForwardPrimerReversePrimer(2)扩增条件1-5号引物的退火温度为50度；6号为60度；7-9号为65度；(3)PCR反应体系10XBufferw/15mMMgCl2(l.Oul)lOmMdNTPmix(0.2ul)lOuMForwardprimer(0.25ul)lOuMReverseprimer(0.25ul)Taqpolymeras(5U/ul)(0.05ul)dH20(7.25ul)DNA(15ng)(l.Oul)本发明特点是根据稳定性好、多态性强的9个微卫星标记序列信息，对目标参试的植株进行DNA扩增，获得分子标记数据后，利用统计分析软件得到种群的判别，与传统的生理方法、直接栽培法等相比，明显减少了工作量、而且效率大大提高，在非破坏性取样的前提下快速获得基因组信息，同时判别准确率高达97.5%。通过本项发明提供的鸢尾属微卫星DNA分子标记技术可以实现鸢尾属种群非破坏性取样下的耐盐种群植株的快速检测和判别，准确、省时和省力，大大降低了采用其to3')5'to3');'to3')to3，)〔5'to3');'to3')5'to3')5'to3')5'to3')5'to3')5'to3')5'to3，)(5，to3')5'to3')5'to3')'to3')5'to3')5'to3')GAAGTTTTGTAGAGGTCTGGTGGCTACAACTAAAGAGTCCAGTCGAGAAAGAAGGAGGAGGAAGGCAGCAACTGTGAGGAGAAAGGCACATAACCTCTCTTGTCCACCAGACTACGAATCATTACCCTTCAAGCCTCTACTAGAGAGACGCAACCTTGTAACCATCCCTTTCCTCCCTCTACTCATTCCCTAGCTAAGCGAGCTAACACAGCGGAAAGAATGAACACAAGGCGAAGAAGGAGCAAATAGTAGCCTCCTTCTTCAGACCCGTAGCGGCGGCGAGAAAAGTAGTGGTCCTAAGTGACTGATAGTGGGAGTAGAGAGTGACATGGAGGTGCGAGATATAAGGGAAAGACGATATTACCCATGCTAAGGCAG它判别方法的工作量和可能带来的误差。本发明在耐盐鸢尾植株快速中具有重要价值和应用前景，技术思想也同样适用于其它物种差异性状的快速分子检测。本发明己经应用于江苏省教育厅"江苏沿海适生耐盐鸢尾新品系选育"项目(JHB05-01)中取得高效分选且正确率的效果。四图l为本发明程序框图五具体实施方式参见图1。实例数据为120个鸢尾属植物种群(耐盐和非耐盐各60个个体)叶片样品。根据本项技术分析后，植株判别结果和准确率表120个鸢尾种群植株判别准确率％(括号内为个体数)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中60个耐盐个体有59个正确判别到耐盐种群，只有2个个体判到非耐盐种群；60个非耐盐个体有58个正确判别到非耐盐种群，只有1个个体判到耐盐种群。所述9个引物序列全部为鸢尾属植物区分耐盐鸢尾种群的特有引物；统计方法体现的软件为非商业化软件，是本
技术领域：
使用的软件；统计方法体现的软件的基本运算原理根据同类性质的基因组信息(本案例中为微卫星标记的DNA片段大小)具有相似性的原理，也就是植株的相似度越高，标记的相似性就大，软件根据每个植株的微卫星标记的特征，计算出植株与植株之间在标记信息上的相似度，根据相似度的大小进行归类。扩增的具体化条件(1)引物的退火温度l-5号引物的退火温度为50度；6号为60度；7-9号为65度；(2)PCR反应体系10XBufferw/15mMMgCl2(l.Oul)10mMdNTPmix(0.2ul)lOuMForwardprimer(0.25ul)lOuMReverseprimer(0.25ul)Taqpolymeras(5U/ul)(0.05ul)dH20(7.25ul)DNA(15ng)(l.Oul)。权利要求1、快速鉴定耐盐鸢尾种群的分子检测方法，其特征是根据给出的目标植株即鸢尾属植物进行DNA提取，对特有的9个引物序列进行DNA扩增，获得微卫星分子标记数据，将分子标记数据采用Arlequin3.11软件进行分析，得到植株的种群判别与归类；其中9个微卫星引物的序列(1)引物序列01ForwardPrimer(5′to3′)GAAGTTTTGTAGAGGTCTGGTGReversePrimer(5′to3′)GCTACAACTAAAGAGTCCAGTC02ForwardPrimer(5′to3′)GAGAAAGAAGGAGGAGGAAGGReversePrimer(5′to3′)CAGCAACTGTGAGGAGAAAG03ForwardPrimer(5′to3′)GCACATAACCTCTCTTGTCCReversePrimer(5′to3′)ACCAGACTACGAATCATTACCC04ForwardPrimer(5′to3′)TTCAAGCCTCTACTAGAGAGACReversePrimer(5′to3′)GCAACCTTGTAACCATCCC05ForwardPrimer(5′to3′)TTTCCTCCCTCTACTCATTCCReversePrimer(5′to3′)CTAGCTAAGCGAGCTAACAC06ForwardPrimer(5′to3′)AGCGGAAAGAATGAACACAAGReversePrimer(5′to3′)GCGAAGAAGGAGCAAATAGTAG07ForwardPrimer(5′to3′)CCTCCTTCTTCAGACCCGTAGReversePrimer(5′to3′)CGGCGGCGAGAAAAGTAG08ForwardPrimer(5′to3′)TGGTCCTAAGTGACTGATAGTGReversePrimer(5′to3′)GGAGTAGAGAGTGACATGGAG09ForwardPrimer(5′to3′)GTGCGAGATATAAGGGAAAGACReversePrimer(5′to3′)GATATTACCCATGCTAAGGCAG。2、根据权利要求1所述的低温热能回收利用方法，其特征在于换热器(3)内充有热泵工质，换热器(3)至废热锅炉(5)之间，有两路管道，其中的一路管道通过热泵(4)与废热锅炉(5)相连接，向废热锅炉(5)供热；另一管道是由废热锅炉(5)返回的的管道，经过加热器(6)，再接通膨胀阀(7)，然后返回到换热器(3)。3、根据权利要求1所述的低温热能回收利用，其特征在于低温位热能通过换热器(3)进行热交换，加热热泵工质，再由热泵(4)加压热泵工质，使热泵工质温度再升高，送至废热锅炉(5)，产生所能使用的过热蒸汽。4、根据权利要求1所述的低温位热能回收利用方法，其特征在于热泵工质从废热锅炉(5)出来后加热冷凝液，经膨胀阀(7)降压，降温，并吸收换热器(3)的热,再由热泵(4)升压升温。全文摘要本发明涉及生物学领域中分子生物学的检测和判别方法。根据给出的目标植株即鸢尾属植物进行DNA提取，对特有的9个引物序列进行DNA扩增，获得微卫星分子标记数据，将分子标记数据采用Arlequin3.11软件进行分析，得到植株的种群判别与归类；运用本发明对鸢尾种群植株分别归属于耐盐和非耐盐种群进行快速分子检测和判别。给出判别鸢尾属耐盐种群的微卫星DNA分子标记9个引物序列及扩增条件和参数。文档编号C12Q1/68GK101225443SQ200710192238公开日2008年7月23日申请日期2007年12月21日优先权日2007年12月21日发明者何祯祥申请人:南京大学被以下专利引用(3),