专利名称：：慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVα12亚家族的Y基因序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一个T细胞受体(TCR)的核苷酸序列，特别是指一种慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列。
背景技术：
：苯是目前应用最为广泛的化工原料和工业溶剂之一。我国职业苯暴露工人达50万以上，占各种化学物职业接触人数之首。国际癌症研究署(IARC)和美国环境保护局(EPA)都将苯列为确证的人类致癌物。我国学者与美国国家癌症研究所(NCI)合作对中国74828名接苯工人和3580名对照工人进行的队列研究证明，接苯工人发生血液淋巴系统恶性肿瘤，如再生障碍性贫血(AA)、骨髓增生异常综合征MDS)或白血病的相对危险性明显增加。苯致血液系统损伤的机制目前尚未完全阐明，普遍认为是多因素、多水平综合作用的结果。近年研究表明，苯对人体血液系统的损伤，其原因之一可能是通过抑制T细胞的增殖而损伤机体的免疫功能。T细胞受损后机体清除异常细胞能力下降，最终会导致肿瘤的发生。AA患者存在T细胞克隆性或寡克隆性活化增殖，并认为多克隆淋巴细胞被高度扩张的寡克隆淋巴细胞取代是再障发病起始阶段主要致病原因之一。国内外对慢性轻度苯中毒患者免疫方面的研究主要集中在T淋巴细胞亚群及TCR(3亚家族的录用情况。但有关职业接苯人群中TCR(x亚家族及其互补决定区3(CDR3)，即与抗原特异性识别结合的部位的研究资料较少。在慢性苯中毒患者中存在的这种克隆性T淋巴细胞是否一样具有恶性克隆的性质，国内外尚未见报道。因此，进一步了解慢性苯中毒患者细胞免疫状态，可以为职业苯中毒免疫方面的研究提供新思路，同时可将所获得的T细胞克隆作为阻断靶点，为遏制慢性苯中毒病程发展及免疫抑制治疗提供依据。
发明内容为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列。本发明从慢性轻度苯中毒患者外周血中存在T细胞受体(TCR)Va亚家族的克隆性T细胞，经序列分析显示其特异性TCR序列的高度可变区V-N-J区，即互补决定区3(CDR3)，与抗原特异性识别结合的部位，表明该克隆性T细胞所表达的TCR为慢性轻度苯中毒相关抗原刺激所产生的特异性TCR，获得了慢性轻度苯中毒相关的TCR基因序列。本发明公开了针对慢性轻度苯中毒相关抗原的特异性TCR的基因序列，尤其是TCR的高度可变区即CDR3，后者是T细胞表面受体识别抗原的特异区域，针对于不同抗原，除了机体所选用的TCRV(x亚家族T细胞不同，更为关键的是其TCR基因的CDR3序列的差异，该部位决定了所属T细胞所能识别的抗原。本发明提供了识别慢性轻度苯中毒相关抗原的TCRVal2基因序列，由于其CDR3的特异性，仅来自于单一克隆的T细胞，是一高度特异的序列。同时，根据CDR3的基因序列编码的蛋白质，可用来了解职业接苯后的相关抗原肽，为慢性苯中毒的生物学特性提供资料。本发明的另一目的在于提供上述基因序列的应用。根据所获得的慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列，可以用于(1)了解职业接苯人群所存在的TCRVal2亚家族T细胞的情况，用于评价病人的免疫功能状态，早期发现可能的不良效应、筛检易感人群等方面及时提供信息。(2)借助所获得的T细胞克隆，寻找接苯后慢性中毒的抗原，并采用TCR特异性单抗及TCRDNA疫苗选择性地取出异常T细胞克隆从而靶向治疗慢性苯中毒。本发明的目的通过下述技术方案来实现一种慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVcc12亚家族的Y基因序列，所述基因序列如下所示CGGCCTGGAGCAAC。其中，Y基因序列为408个bp:l-144bp为V区；145-150bp为N区，151-208bp为J区;209-408bp为C区。上述慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRV(x12亚家族的Y基因序列翻译的蛋白质(136AA)如下QSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAAAWSN。上述慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列的制备方法，包括如下步骤A、收集慢性轻度苯中毒患者外周血，Ficoll分层法分离外周血单个核细胞；B、提取外周血单个核细胞的RNA，RT-PCR合成cDNA第一链；C、在NCBI的Genebank中查找TCRa链的基因序列，并标出各亚家族的V区及C区在基因组中的位置；D、设计29个V(x特异性上游引物及Ca下游引物；E、PCR扩增29个Va亚家族TCR重排时产生的V-N-JC区；F、Ca-Fam标记PCR产物，基因扫描分析T细胞亚家族的表达和克隆性；G、将呈单克隆或寡克隆扫描图的亚家族PCR产物进行切胶纯化序列分析。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(1)本发明制备得到了一种独特的慢性轻度苯中毒抗原的相关TCRVa12基因序列，该序列可以作为一种新的抗原识别TCR基因(主要变化区在于CDR3序列)补充人类基因库资料。(2)该TCR基因可用于研究慢性苯中毒的特异性免疫诊断和治疗。上述慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVal2亚家族的Y基因序列后，一方面可用于进一步检测病人体内所存在的TCRVal2亚家族T细胞的情况，以评价其细胞免疫功能状态，另一方面应用是制备选择性地去除慢性苯中毒患者中异常增殖的T细胞克隆靶向免疫治疗研究方面。前者的检测所采用技术与上述检测TCR基因的技术相同，通过不同时间点的分析，可以了解病人所存在的TCRVal2亚家族T细胞的情况，用于了解病人的免疫状态。后者主要通过慢性轻度苯中毒相关抗原特异的TCR基因制备对抗确定的特异性抗原的单抗，从而具备了发挥相应特异性去除慢性苯中毒患者中异常增殖的T细胞克隆。本发明所提供的TCR基因的应用最终目的是通过对慢性苯中毒患者进行特异性免疫治疗，从而提高疗效，改善病人的生存质量等，是具有很大的市场推广应用价值和和较大的社会经济效益。图1为慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVal2亚家族的基因扫描图。其中，A为TCRVal2亚家族多克隆图；B为TCRVal2亚家族寡克隆图;。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例(一)抗原特异性TCR基因序列的分析分析TCRVci基因谱的CDR3的长度和碱基序列的方法是利用RT-PCR—基因扫描方法分析TCRVcx29个亚家族的CDR3长度。首先收集慢性轻度苯中毒患者外周血，Ficoll分层法分离外周血单个核细胞，留取Pl(T个PBMCs(外周血单个核细胞)提取RNA，RT-PCR合成cDNA。同时，在NCBI的基因库中查找出TCRa链的基因序列，并标出各亚家族的V区及C区在基因组中的位置。根据Va29个亚家族基因的cDNA设计相应的29个Va特异性上游引物，并在Ca区设一Ca下游引物，利用PCR技术扩增患者29个Va亚家族TCR重排时产生的V-N-JC区。如图1所示，荧光素Fam标记各亚家族PCR产物的Ca区，基因扫描分析T细胞各亚家族的表达，根据不同位置，高度和形态的峰，表示产物的大小、量和均一性，从而确定T细胞克隆性(一般情况下，正常转录的每个Va亚家族包含810个峰，即810个不同克隆的T细胞；主峰的出现表明相同大小cDNA的过度扩增，单峰表明产物中DNA片断大小相同，均存在寡克隆或单克隆T细胞群，三者分别提示产物来自多克隆、寡克隆和单克隆的T细胞)。基因扫描结果发现患者的Val2亚家族T细胞呈明显单克隆；将Val2亚家族的PCR产物切胶纯化，序列分析Val2亚家族TCR的基因序列及其CDR3区(V-N-J区)，即为与慢性轻度苯中毒相关抗原特异性结合的部位。慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVod2亚家族的Y基因序列的制备方法1、分离外周血单个核细胞(1)取淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077)4mL加入离心管内，将稀释后的抗凝外周血标本混悬液平铺于分离液之上，以水平离心机，2000rpm，离心15分钟。(2)吸取中间单个核细胞层转移至另一离心管内，再加入5mL1640液，轻轻吹打，以1500rpm，离心洗涤10分钟，弃上清，加入1640液至2mL，混匀后计数，并用同样的方法洗涤两次，按2xlO々mL调整细胞浓度备用。2、RNA提取(TRIzol试剂盒方法提取法)(1)将已加入TRIzol试剂一20。C冻存的细胞取出，置冰上解冻，混匀后加入0.2mL氯仿，充分混匀，4°C，14000rpm离心30分钟。(2)吸取上层液至另一离心管，加入0.5mL异丙醇并混匀，室温静置IO分钟后4。C，14000rpm离心30分钟。(3)去上清，并用lmL75^乙醇(一20。C)洗两次(28。C，14000rpm)，每次混匀30秒后，离心IO分钟。(4)去上清，再离心23分钟，去除剩余的乙醇，置于超净台上自然干燥11.5小时。加入超净水(2050pL)溶解。(5)于紫外线分光光度仪中检测样品的纯度和含量，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和质量。(6)RNA保存脂A样品加入其O.l倍容积的3mol/LNaAC(醋酸钠)和2倍容积的乙醇后，保存于一80。C备用。3、cDNA合成(1)应用六聚体随机引物和反转录酶试剂盒合成cDNA第一链。l|igRNA加入16.5pL预先配制的混合液其中包括7|iLH20、2pL10xPCR-Buffer、2|iL0.lmmol/LDTT、5fxL2.5mmol/LdNTP和0,5jiLRand.Hexmer。(2)于73°C3分钟后，置于冰中30秒。低温高速离心30秒置于冰中23分钟。(3)加入0.6fiLRnasin(33U/pL)和0.5pLSuperscript(200UVL)后，低温高速离心30秒。(4)室温静置10分钟；42°C，40分钟以上；83°C，5分钟，一20。C保存备用o4、cDNA合成质量检测将所有样本的cDNA经PCR检测(32M基因(引物序列见表1)而确定其合成质量。总反应体系20jiL，其中上下游引物0.5(imol/L，dNTP0.1mmol/L，Taq聚合酶l.OU，MgCL21.5mmol/L，10xPCR缓冲液2pL，cDNA产物l)iL和dH20，同时设置阳性和阴性对照。在德国BiometraPCR扩增仪中进行PCR反应。反应条件94°C1分钟(首次3分钟)，58°C1分钟，72°C1分钟(末次6分钟)，共35个循环，最后保存于4。C中。取8^LPCR产物以1.5%(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，(32M阳性者可进一步研究，阴性者视为无cDNA合成，弃去不用。5、PCR扩增TCRVa29个亚家族以29个TCRVa亚家族基因设计相应的特异性上游引物，并在Ca区设计一下游引物(引物序列见表l)。PCR按常规方法进行。总反应体系20(iL，其中含任一Va引物(29个Va亚家族之一)和Ca引物0.5[imol/L，余同上。反应条件94°C、1分钟(首次3分钟)，6(TC、1分钟和72°C、1分钟(末次6分钟)，共进行40个循环，最后PCR产物保存于4t:中。取8pLPCR产物电泳分析结果。6、T细胞克隆性分析(1)标记PCR产物10pL的反应体系含2.5)aL未标记的PCR产物、0.15pmol/LC|3-fam引物、1.5mmol/LMgCl2，O.lmmol/LdNTP，0.75UTaq聚合酶，lpL10xPCR缓冲液和dH20。PCR共进行35循环，每一循环包括94°C、1分钟(首次3分钟)，66°C、l分钟和72"、l分钟(末次6分钟)，最后PCR产物保存于4匸中。(2)基因扫描样品配制荧光素标记的PCR产物(2pL)加入高质量的去离子甲酰胺(Hi-DiFormamide)与Genescan-500LIZ分子量标准品按20:1比例配好的lOpL混(3)基因扫描(按操作指南进行)1)按操作指南准备好仪器并更换水和缓冲液。2)灌胶灌胶前2小时从4。C冰箱取出POP-4(PerformanceOptimizedPolymer-4)胶回温12小时，把胶液抽进贮胶5mL针筒中(抽取的mL数约为0.5+0.07x做样次数)，倒置排出针筒内气泡，装紧针筒。3)上样将备好的样品于94"变性4分钟，然后立即放置冰上冷却2分钟。变性后的样品加入96孔板，直接装载到3100遗传分析仪进行电泳。4)运行自动进样器会自动把样品板移到要分析的4个样品的位置，电泳过程中CCD检测器把荧光信号转换为电信号并把它传送给安装了3100数据采集软件的计算机工作站。5)数据处理数据处理完成后就存贮在计算机的数据库里并以电泳信号图的形式显示出来。电泳信号图的X轴表示时间，Y轴表示相对荧光强度，每个图中同时画出几种用于标记DNA片断的荧光素信号，电泳信号图中的每个峰代表一个DNA片断。完成处理的数据被自动地从数据库中提取并进行分6)结果分析打开GeneMapperSoftwareTMv3.5，将保存于计算机硬盘数据库中的原始数据加进分析软件，分析产物的长度和荧光素强度。7、核苷酸序列分析(1)E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化PCR产物1)切胶将PCR产物全部加入l2。/。的琼脂糖凝胶的加样孔，当电泳至足以分离目的DNA时，于紫外灯下用干净的手术刀切下含有目的条带的琼脂糖凝胶块，切下的凝胶块置于1.5mL离心管中。2)按E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒说明进行PCR产物的纯化，先加入500BindingBuffer,5565。C孵育至凝胶块完全溶解；凝胶溶解液加入HiBindDNAspin-column中高速离心去废液后，再依次加入300pLBindingBuffer、700jxLSPWBuffer洗膜；高速离心甩干spin-column的滤膜后，加入30DNAElutionBuffer(加于滤膜上)，室温静置5min，高速离心1min后可得纯化的PCR产3)取3纯化后的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察纯化效果；剩余的PCR纯化产物真空冷冻干燥浓縮约20min至10左右。(2)BigDye标记用BigDyeTerminatorv3,lCycleSequencingkit标记纯化后的PCR产物，反应体系为BigDyeTerminator1)iL、相应单向引物(2|imol/L)1.6jxL、纯化后PCR产物2.4piL，反应条件96°C1min，(96°C10sec、50°C5sec、60°C4min)25个循环。(3)测序将标记好BigDye的5[iL体系的测序产物补水至20(iL，转入1.5ml的离心管，再依次加入23MNaAc(pH5.2)、2(iL125mMEDTA-Na2、5095%乙醇，旋涡振荡后室温下避光放置15min;5415型高速台式离心机2800g离心20min，沿离心沉淀物的对侧小心吸取上清并弃去，加入250(iL70%冰冻乙醇，2800g离心5min，弃上清；将管盖打开置于加热板上，9495°C1min使其干燥。加入10高质量的去离子甲酰胺，反复吹打混匀，转入0.2pL的PCR管内，在PCR仪上95"变性4min，然后迅速置冰中冷却至少4min后，装载到3100DNA序列分析仪上进行毛细管电泳。表1RT-PCR实验所涉及的弓I物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>Votl75'-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3'Val8'-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3,Val2'-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3'Va20，-TCCCTGTTTA丁CCCTGCCGACAGA-3'Va21'-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3'Va22'-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va23^'-CC丁GAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va245，'-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3'Va255'-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3'Va265''-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3'Va275，-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3'Va285，-TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3'Va295，-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3'Ca5，-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3'Ga-fam5，-Fam-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3卩rM5'5，-TACACTGAATTCACCCCCAC-3'卩2-M3'5'-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3'(二)抗原特异TCR基因转导技术1、重组质粒TCRVa12(Y)-pIRES的构建*(1)目的基因的扩增根据慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVocl2亚家族基因序列(包括完整的CDR3区)设计引物，扩增病人样本中的TCRV(xl2基因序列的上游引物上带有Xhol酶切位点、下游引物上带有EcoRl酶切位点(与真核表达载体pIRES中的插入位点A的酶切位点相对应)。按BDAdvantage2PCR试剂盒说明书进行PCR反应PCR总反应体系50|^L，其中含lOxBDAdvantage2PCRBuffer、上下游引物各0.5jimoI/L、dNTPMix0.2mmol/L、50xBDAdvantage2PolymeraseMix、超纯水和1cDNA模板，同时设置阳性和阴性对照。反应条件94°C1min(首次为3min)、60°C1min、72°C2min(末次为7min)，共35个循环。扩增产物用1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。(2)重组质粒的构建A、E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化目的基因TCRVal2的PCR产物(同第一部分，步骤7);B、将真核表达载体pIRES与纯化后的TCRVal2PCR产物分别用XhoI酶切，体系为①TCRVcd2PCR产物28pL、TangoTMbuffer8]uL、XhoI内切酶1jliL、超纯水3^L;②pIRES载体4juL、TangoTMbuffer8|iL、XhoI内切酶ljliL、超纯水27^L;混匀后置于37'C水浴3h;C、纯化XhoI酶切后的pIRES载体和TCRVal2PCR产物；D、将已纯化好的XhoI酶切后的pIRES载体和TCRVod2PCR产物分别再用EcoRI酶切，体系为①TCRVctl2PCR产物(Xho1)28|uL、TangoTMbuffer8)LiL、EcoRI内切酶l)iL、超纯水3^L;②pIRES载体(XhoI)28^tL、Tangobuffer8pL、EcoRI内切酶ljuL、超纯水3^L;混匀后置于37。C水浴3h;E、双酶切后的pIRES载体和TCRVal2PCR产物进行连接反应体系为10xT4bufferl|iL、T4DNA酶liiiL、双酶切后的pIRES载体2pL、双酶切后的TCRV(313PCR产物6pL，混匀后置于16。C过夜；F、转化①将连接产物(10pL)加入感受态大肠杆菌DH5a(1.5mL离心管，lOOiaL菌液，一7(TC保存，北京Tiangen公司)中，轻轻混匀，置冰中30min;②42。C热休克90s，迅速置冰中3min;③加入SOC培养基800]nL，置干燥恒温振荡箱中37。C180200rpm振摇60min;菌液用玻璃推铺于1.5%LB固体培养基(含氨苄青霉素100pg/mL)上，置37。C孵箱过夜培养；G、随机挑选10个菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C180rpm振摇培养过夜，PureLinkTM超纯质粒提取试剂盒抽提质粒(5415型台式高速离心机)①3000rpm室温下离心菌液15min，去上清；②加入250pL含認aseA的ResuspensionBuffer,重悬细菌；③加入250pLLysisBuffer,轻轻混匀，室温下放置5min;④加入350pLPrecipitationBuffer,立即振荡混匀；⑤以11400rpm离心10min后，将上清液转移至Minicolumn中，11400rpm离心lmin，去废液；加入700|iLWashBuffer,11400rpm离心lmin，去废液；⑦再以11400rpm离心lmin后，将Minicolumn放入一新的1.5mL离心管中，加入75[iL预热65。C的TEBuffer,室温下放置3min，11400rpm离心2min，所收集的溶液即为富含质粒溶液；H、提取质粒DNA后用XhoI和EcoRl双酶切鉴定，同时在pIRES载体的IRES区设计一下游引物IRES-R(5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，结合pIRES载体上游的T7公共引物(5，-TACGACTCACTATAGGCTAG-3，)进行PCR鉴定，PCR反应体积为25pL，包括O.lmmol/LdNTP、1.5UTaq聚合酶、10xPCR缓冲液、1.5mmol/LMgCl2和超纯水，引物浓度均为0.4jumol/L，以1:500稀释的质粒DNA1pL作为模板。PCR扩增条件为94。C3min，(94°C30s，6(TClmin，72。C2min，35个循环)，72°C5min;酶切产物及PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。筛选出阳性克隆，再对其进行双向测序鉴定，证实为本发明特异基因序列后扩增阳性克隆并提取质粒，从而获得特异性慢性轻度苯中毒相关抗原特异的TCRVod2-pIRES质粒。用紫外分光光度计测定重组质粒的浓度。2、脂质体介导的重组质粒TCRVal2-pIRES转染(1)脂质体LipofectamineTM2000转染A549细胞株、Molt4细胞株转染A549细胞株①将处于对数生长期的八549细胞株以4><105个细胞/孔的密度，加入2mL无血清无抗生素的IMDM培养基，接种6孔培养板；②取TCRVal2-pIRES重组质粒(4吗)置于1.5mL离心管中，加入无血清无抗生素的IMDM培养基至250^L，轻轻混匀；③取15脂质体Lipofectamine2000置于1.5mL离心管中，加入无血清无抗生素的IMDM培养基至250pL，轻轻混匀后室温下孵育5min;将②和③混匀后，室温下孵育20min;◎将④加入①的A549细胞培养基中(转染平行2孔)，另设1孔转染pIRES空载体作为阴性对照，具体操作方法同转染重组质粒；置于37'C、5y。C02培养箱中培养24h后全量换液为完全培养基，培养72h后加G418进行筛选(终浓度600pg/mL)，每4天换一次培养基，同时加入相同浓度的G418，在此筛选条件下培养20d可得到稳定表达细胞系。转染Molt4细胞株将处于对数生长期的Molt4细胞株以2"06个细胞/孔的密度接种6孔板，取4pgTCRVctl2-pIRES重组质粒和脂质体LipofectamineTM2000混合后转染Molt4细胞株，方法同转染A549细胞株。3、重组质粒转染后TCRVal2基因表达的鉴定(1)RT-PCR和实时定量PCR检测TCRVal2mRNA的表达转染7天后，各孔收集3xl(^细胞，用TRIZol试剂盒和SurperScriptII逆转录试剂盒分别提取总RNA、合成cDNA，经PCR扩增管家基因卩2M检测cDNA的合成质量(同第一部分，步骤7);用相应的TCRVctl2引物以及相应的C(3引物进行PCR扩增，转染空载体组作为阴性对照，PCR扩增体系和扩增条件同前所述。(2)间接免疫荧光法和流式细胞仪检测重组质粒的表达转染10天后，收集lxl(^细胞，用0.1mol/L的PBS洗涤细胞两次后，标记大鼠抗人TCRVa单抗(一抗，1:100稀释)，37。C孵育lh;PBS洗涤细胞三次后，标记FITC-兔抗大鼠IgG抗体(二抗，1:50稀释)，37。C孵育lh;PBS洗涤细胞三次后，在荧光显微镜下观察重组质粒在转染后细胞株中的表达情况；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVal2单抗标记，37。C孵育30min，PBS洗涤细胞一次后用流式细胞仪进行流式检测重组质粒的表达。(3)点印记杂交和WesternBlot检测TCRVal2蛋白的表达转染20天后，收集2><106稳定表达重组质粒的细胞，用RIPA蛋白提取试剂盒提取总蛋白，真空冷冻干燥浓縮后考马斯亮兰法定量；同样提取脐血细胞(TCRVcd2亚家族表达均阳性)的蛋白作为阳性对照，转染空载体的细胞的蛋白为阴性对照。1)点印记杂交A、取NC膜2cmx4cm，划分小格，用微量加样枪分别点膜，重组质粒组、阳性对照组、阴性对照组的蛋白样品分别点3次，每次l)lL;进行2个平行反应；B、用blocldngReagent封膜4h后用washbuffer洗涤2次，每次5min;C、加入l:500的大鼠抗人TCRVal2单抗(用blockingReagent稀释)，4°C孵育过夜后用washbuffer洗涤2次，每次5min;D、加入l:500的HRP-兔抗大鼠IgG抗体(用blockingReagent稀释)室温孵育2h，用washbuffer洗涤3次，每次5min;E、将NC膜浸入DAB底物液(避光)显色。2)WesternBlotA、SDS-PAGE电泳将转染重组质粒组的浓縮蛋白样品、阳性对照和阴性对照分别加样于15。/。SDS-PAGE胶(每孔上样约100(ig)，以PageRulerPrestainedProteinLadder为预染marker，进行3个平行反应；用恒压60V电泳30min后，改恒压100Vlh;B、分离其中1个平行反应的SDS-PAGE胶，用考马斯亮兰染色后，用冰乙酸甲醇洗脱液反复漂洗直至有清晰条带显出；C、转膜PVDF膜预先用甲醇浸泡lmin，再浸泡到转膜液中备用；切好的滤纸和海绵也浸泡到转膜液中10min;将切下的另2个平行反应的SDS-PAGE胶与相应的PVDF膜放入转膜液中浸泡片亥I」；将海绵一滤纸一PVDF膜一SDS-PAGE胶一滤纸一海绵依次放到阳极板上，胶大小=膜>滤纸；用4。C预冷的转膜液，恒压40V，90min(湿转);D、封膜用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗涤2次，每次5min;E、检测人P-actin蛋白(内参照)的表达将其中1个平行反应的PVDF膜加入l:800的小鼠抗人卩-actin单抗(用blockingReagent稀释)，4。C孵育过夜后用washbuffer洗涤2次，每次5min;加入l:1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体(用blockingReagent稀释)室温孵育2h，用washbuffer洗涤3次，每次5min;F、检测目的蛋白TCRVal2的表达将另1个平行反应的PVDF膜加入1:800的大鼠抗人TCRVa单抗(用blockingReagent稀释)，4。C孵育过夜后用washbuffer洗涤2次，每次5min;加入l:1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗体(用blockingReagent稀释)室温孵育2h，用washbuffer洗涤3次，每次5min;G、化学发光法显影在暗室中将PVDF膜转入LumiGLOWorkingReagent中，室温孵育3min;用镊子将PVDF膜取出，沥去多余的试剂；将PVDF膜放入塑料薄膜中，要保证PVDF膜与塑料薄膜之间没有气泡；将含有PVDF膜的塑料薄膜放入X线曝光暗盒中，压上X线胶片(曝光30s)，常规显影、定影后得到显影的X线胶片。4、重组质粒TCRVal2-pIRES转染正常人T细胞，免疫小鼠制备单克隆抗体(1)重组质粒TCRVal2-pIRES转染正常人T细胞将处于对数生长期的正常人T细胞以2><106个细胞/孔的密度接种6孔板，取4|igTCRVcd2-pIRES重组质粒和脂质体LipofectamineTM2000混合后转染正常人T细胞，操作方法同前所述，培养扩增后得到表达抗原特异性相关TCRVal2基因的T细胞，并检测验证重组质粒的表达(方法同前)。(2)免疫小鼠制备特异性单抗体外大量培养特异性表达TCRVal2的T细胞，收集特异性表达TCRVal2T细胞后腹腔注射小鼠，根据单克隆抗体制备相关技术制备针对慢性轻度苯中毒相关抗原特异的单抗。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCEUSTING<110>暨南大学<120>慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列<130>41<160>2<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>408<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVot12亚家族的Y基因序列<400>1cttattcgtcggaactcttttgatgagcaaaatgaaataagtggtcggtattcttggaac60ttccagaaatccaccagttccttcaacttcaccatcacagcctcacaagtcgtggactca120gcagtatacttctgtgctctgagtgaccgaaatactggaggcttcaaaactatctttgga180gcaggaacaagactatttgttaaagcaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccag240ctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaa300acaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagac360atgaggtctatggacttcaagagcaacagtgccgcggcctggagcaac408<210>2<211>136<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列翻译的蛋白质<400>2LeulieArgArgAsnSerPheAspGluGinAsnGlulieSerGlyArg151015TyrSerTipAsnPheGinLysSerThrSerSerPheAsnPheThrlie202530ThrAlaSerGinValValAspSerAlaValTyrPheCysAlaLeuSer354045AspArgAsnThrGlyGlyPheLysThrHePheGlyAlaGlyThrArg505560LeuPheValLysAlaAsnlieGinAsnProAspProAlaValTyrGin65707580LeuArgAspSerLysSerSerAspLysSerValCysLeuPheThrAsp85卯95PheAspSerGinThrAsnValSerGinSerLysAspSerAspValTyr100105110HeThrAspLysThrValLeuAspMetArgSerMetAspPheLysSer115120125AsnSerAlaAlaAlaTipSerAsn13013权利要求1、一种慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVα12亚家族的Y基因序列，其特征在于所述Y基因序列如下CTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTCTGTGCTCTGAGTGACCGAAATACTGGAGGCTTCAAAACTATCTTTGGAGCAGGAACAAGACTATTTGTTAAAGCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAAC。2、根据权利要求1所述的一种慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列，其特征在于所述慢性轻度苯中毒相关抗原特异TCRVa12亚家族的Y基因序列翻译的蛋白质如下DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAAAWSN。全文摘要本发明公开了一个慢性轻度苯中毒相关抗原的特异性T细胞受体的核苷酸序列。通过RT-PCR基因扫描分析慢性轻度苯中毒患者外周血中TCRVαl2亚家族呈明显单克隆，其PCR产物进行序列分析特异性TCR序列的V-N-J区，即互补决定区3，是和抗原特异性识别结合的部位，表明该克隆性T细胞的TCR为慢性轻度苯中毒相关抗原刺激所产生的特异性TCR。它是进行慢性轻度苯中毒免疫靶向治疗的基础和关键。该特异性TCR的核苷酸序列为进一步开展针对慢性轻度苯中毒的特异性细胞免疫治疗的一个重要基础。文档编号C12N15/12GK101245347SQ20081002580公开日2008年8月20日申请日期2008年1月14日优先权日2008年1月14日发明者萡李,李扬秋,杨力建,陈少华申请人:暨南大学