一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法

专利名称：一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵剂技术，具体涉及一种蔬菜直投发酵剂。(二) 背景技术酸菜作为我国北方传统发酵食品，因其风味独特、营养易于吸收、口感清爽、酸味浓郁 醇厚而广泛受到人们的欢迎。长期以来，东北地区由于受到地域限制形成了食用酸菜的生活 习惯，虽然随着经济的发展和生活水平的提高，酸菜已从餐桌上逐步淡化，但是这种长期形 成的饮食习惯难以被人们废除，而且以酸菜为主料烹制的许多菜肴，已构成我国北方地区饮 食文化的一大特色。但是酸菜中含有导致癌症的亚硝酸类物质，使酸菜消费受到了极大的限 制。东北地区，尤其是黑龙江省作为白菜生产基地，酸菜又是其消费的重要渠道，这就要求 科技工作者能够开发出降低亚硝酸类物质的酸菜发酵剂，来迎合酸菜在我国消费的要求。酸菜的生产目前以两种方式进行 一是家庭式的传统生产，二是工业化规模生产。家庭 式酸菜传统生产采用自然发酵法；而工业化规模生产采用自然发酵和乳酸菌发酵两种方式。 自然发酵周期长(一个月以上)、杂菌及其他有害物质污染无法控制、卫生质量难以保证。同 时由于长时间浸泡发酵，破坏了蔬菜的纤维结构，使蔬菜变软、发粘，影响外观和口感。近 年来，随着现代食品加工技术和食品牛物技术研究和应用的不断发展，特别是喜爱酸菜的消 费人群在国内外的迅速增加和消费范围的迅速扩大以及"楼道革命"的掀起，酸菜由家庭的传 统生产向现代化、规模化、工厂化生产转化，山自然发酵向纯齒种发酵转化。 乳酸菌在蔬菜发酵过程中起着重要的作用。它们的各种次生代谢产物可以使食品的风味独特， 香味浓郁。同时它们在生长过程中产酸和一些抗菌素，这些都抑制了腐败菌的生长，使产品 更加安全健康。在现代发酵食品工业中，利用人工接菌发酵解决了传统加工方式带来的各种 弊端，如发酵速度、产品质量不稳定等。但是由于发酵原料质量差异、发酵菌种的性质不稳 定或降解亚硝酸盐能力弱，容易引发发酵蔬菜在发酵中亚硝酸盐含量超标，对人体健康造成 一定的伤害，同时含亚硝酸盐废液的排放对环境有较大的危害。因此研制高效降解亚硝酸盐 蔬菜发酵剂对酸菜工业和生态发展具有重要意义。 (二)发明内容本发明的目的在于提供一种酸菜直投式发酵剂活菌数2l(^CFU/g，使蔬菜发酵时间大大 縮短到3 5天，并能够在较短时间内快速降解亚硝酸盐>90%以上，可以用于工业化生产的 高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂。本发明的目的是这样实现的它包括等质量混合的植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片 球菌和短乳杆菌的冻干菌粉。 .本发明的另一目的在于提供一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其步骤 包括(1) 增菌培养基将筛选高效降解亚硝酸盐能力的菌株植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、 乳酸片球菌和短乳杆菌四株菌在基础培养基上添加l 4%w/v碳源和0.5 1%W/V氮源构成增菌培养基，30 37'C培养40h;(2) 增菌条件在上述优化基础上优化生长条件，pH6.6 7.0，温度25 37。C，采用 摇动和静止培养方式；(3) 富集条件在增菌后菌体液基础上，通过4000 8000r/m， 10 20min条件下离心 浓縮增菌后的菌体；(4) 菌株冻干将富集后的菌体先处于w/v25X浓乳糖液中预处理，然后与冻干保护剂 v/v^:l混合，置于冻干机内冻干；(5) 菌株配比将四株菌进行等质量配比。冻干菌粉可直接以0.496。添加量投入生产， 也可以0.1%。接菌量在中间培养基中3(TC活化12h后，以3%液态形式投入生产。本发明关于高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法还包括这样一些技术特征1、 所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖和乳糖，重量百分比为1-4%;2、 所述的氮源包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨，重量百分比为0.5-1%;3、 所述的增菌培养基为肠膜明串珠菌4%蔗糖，0.5%蛋白胨，0.5%大豆蛋白胨，牛肉膏lg，酵母粉2g，氯化钠lg，水100ml，肠膜明串珠菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%;植物乳杆菌2%蔗糖，2%葡萄糖，1%胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g,酵母粉0.5g，吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml，植物乳杆菌与 增菌培养基的配比数值范围2-3%;短乳杆菌2%庶糖，1%大豆蛋白胨，2%葡萄 糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水 100ml，短乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%;乳酸片球菌1%蔗糖，1% 葡萄糖，1%胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰0.005g，硫酸镁0.01g， 吐温80 0.002ml，水100ml，乳酸片球菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%;4、 所述的增菌条件中肠膜明串珠菌pH7.0，温度3(TC， 90r/m摇动培养；植物乳杆 菌pH6.8，温度30'C，静止培养；短乳杆菌pH6.6 6.8，温度30 37。C， 90r/m 摇动培养；乳酸片球菌pH7.0，温度30'C，静止培养；5、 所述的富集条件为肠膜明串珠菌6000r/m， 20min，植物乳杆菌8000r/m， 15min，短乳杆菌8000r/m， 15min，乳酸片球菌8000r/m， 20min;四株菌沉淀得率分别为 肠膜明串珠菌21%，植物乳杆菌12。X，短乳杆菌10%，乳酸片球菌15%; 6、所述的乳糖液与冻干保护剂包括脱脂乳、甘油和海藻糖，肠膜明串珠菌，植物乳杆 菌，短乳杆菌和乳酸片球菌与乳糖液与冻干保护剂配比体积比1:1为肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌12%脱脂乳+ 5%甘油+ 10%海藻糖；乳酸片球菌12%脱脂乳+ 5%甘油+ 5%海藻糖。本发明关于一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法的具体实施方案如下 (O高效降解亚硝酸盐乳酸菌株的筛选以实验室保藏菌株和CICC购买的、并适用于酸菜生产的50多菌株为试验菌株，在20'C、 28°C、 37'C不同的温度条件下培养7天，筛 选高效降解亚硝酸盐能力的菌株四株，分别为肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、乳酸 片球菌，降解亚硝酸盐比率^85%。这四株乳酸菌均为酸菜发酵整个过程中的优势菌，适合酸 菜的发酵。(2) 增菌培养基将上述四株菌在基础培养基上添加1 4%碳源(葡萄糖、蔗糖、乳 糖)和0.5 1%氮源(大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨)，30 37。C培养40h。以菌数为参照 指标。增菌培养基为肠膜明串珠菌4%蔗糖，0.5%蛋白月东，0.5%大豆蛋白胨，牛肉膏lg，酵母粉2g，氯 化钠lg，水100ml。植物乳杆菌2%蔗糖，2%葡萄糖，1%胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉 0.5g，吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml。短乳杆菌2%蔗糖，1%大豆蛋白胨，2%葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉 0.5g，吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml。乳酸片球菌1%蔗糖，1%葡萄糖，1%胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰 0.005g，硫酸镁0.01g，吐温80 0.002ml，水100ml。(3) 增菌条件在上述优化基础上优化生长条件，pH6.6~7.0，温度25 37'C，采用 摇动和静止培养方式。以菌数为参照指标。增菌条件为肠膜明串珠菌pH7.0，温度3(TC， 90r/m摇动培养。 植物乳杆菌pH6.8，温度3(TC，静止培养。 短乳杆菌pH6.6 6.8，温度30 37。C， 90r/m摇动培养。 乳酸片球菌pH7.0，温度30'C，静止培养。(4) 富集条件在增菌后菌体液基础上，通过4000 8000r/m， 10 20min条件下离心浓縮增菌后的菌体。以菌数、离心损失率和收得率为参照指标。富集条件为肠膜明串珠菌6000r/m， 20min，植物乳杆菌8000r/m， 15min，短乳杆菌8000r/m， 15min,乳酸片球菌8000r/m， 20min。四株菌沉淀得率分别为肠膜明串珠菌21%，植物乳杆菌12%，短乳杆菌10%，乳 酸片球菌15%。(5) 菌株冻干将富集后的菌体先处于25% (w/v)浓乳糖液中预处理，然后与冻千保 护剂(l:l，v/v)混合，置于冻干机内冻千。肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌12%脱脂乳+ 5。％甘油+ 10%海藻糖；乳酸片 球菌12%脱脂乳+ 5%甘油+ 5%海藻糖，存活率^88%。肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳 杆菌，乳酸片球菌菌数分别为1.3xlOieCFU/g， 2.7x101()CFU/g， 0.9xl01GCFU/g， 3xlO10CFU/g。(6) 齒株配比以降解亚硝酸盐效果、产酸、风味和感官品质为参考指标，将四株菌 在上述冻干后菌数含量基础上进行适当配比。菌粉配比为肠膜明串珠菌植物乳杆菌短乳杆菌乳酸片球菌(1:1:1:1，质量比)。冻干菌粉可直接以0.4%。添加量投入生产，也可以0.1%。 接菌量在中间培养基中30'C活化12h后，以3%液态形式投入生产。本发明提供了一种可以用于工业化生产高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方 法，它是通过CICC保存具有降解亚硝酸盐菌株在营养条件、生长条件和富集冻干条件下制 备高菌数发酵剂，闲而其产品安全，无副作用。经测定其菌数均大于^10'GCFU/g。 2(TC发酵 300斤白菜10天发酵成熟，3(TC发酵300斤白菜5天发酵成熟，混合发酵降解亚硝酸盐^98 %，酸菜风味好，产品品质优良。(四)


图1为本发明制备流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明本实施例试验菌株包括植物乳杆菌(CICC6001)、肠膜明串珠菌(CICC 6055)、乳酸 片球菌(CICC 10146)、短乳杆菌(CICC 20014)将肠膜明串珠菌冻干菌粉在液体培养基中(这里是冻千菌粉)活化3代，保证其活力和 纯度，加入到115'C，灭菌15min的增菌培养基(4%蔗糖，0.5%蛋白胨，0.5%大豆蛋白胨， 牛肉膏lg，酵母粉2g，氯化钠lg，水100ml)中，于恒pH7.0，恒温度30。C， 90r/m摇动培 养，40h后得到的菌液通过6000r/m， 20min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在3(TC与25% 浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12%脱脂乳+ 5%甘油+ 10%海藻糖) 等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数肠膜明串珠菌冻干菌粉1.3xl01QCFU/g。将植物乳杆菌冻干菌粉在液体培养基中活化3代，保证其活力和纯度，加入到115'C， 灭菌15min的增菌培养基(2%蔗糖，2%葡萄糖，1%胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml)中，于恒pH6.8，温度30'C，静 止培养，30h后得到的菌液通过8000r/m， 15min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在3(TC与 25W浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12%脱脂乳+ 5%甘油+ 10%海藻 糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数植物乳杆菌冻干菌粉2.7xlO'eCFU/g。将短乳杆菌冻干菌粉在液体培养基中活化3代，保证其活力和纯度，加入到115°C，灭 菌15min的增菌培养基(2%蔗糖，1%大豆蛋白胨，2%葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g， 酵母粉0.5g,吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水IOOml)中，丁恒pH 6.6 6.8，温度30。C， 90r/m摇动培养，40h后得到的菌液通过8000r/m， 15min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在 3(TC与25^浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12%脱脂乳+ 5%甘油+10 %海藻糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数短乳杆菌冻干菌粉0.9xlO^CFU/g。将乳酸片球菌冻干菌粉在液体培养基中活化3代，保证其活力和纯度，加入到115'C， 灭菌15min的增菌培养基(1%蔗糖，1%葡萄糖，1%胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g， 硫酸锰0.005g，硫酸镁0.01g，吐温80 0.002ml，水100ml)中，于恒pH7.0，温度30。C'静 止培养，40h后得到的菌液通过8000r/m， 20min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在3(TC与 25%浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻千保护剂(12%脱脂乳+ 5%甘油+ 5%海藻 糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数乳酸片球菌冻干菌粉3xl(^CFU/g。将上述制备的四株冻干菌粉以等质量混合，制备成复合的发酵剂冻干菌粉可直接以0.4%。 添加量投入生产，也可以O.P/。。接菌量在中间培养基中3(TC活化12h后，以3%液态形式投入 生产。
权利要求
1、一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂，其特征在于它包括等质量混合的植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌的冻干菌粉。
2、 一种制备如权利要求1所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于 步骤包括(1) 增菌培养基将筛选高效降解亚硝酸盐能力的菌株植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、 乳酸片球菌和短乳杆菌四株菌在基础培养基上添加l 4%w/v碳源和0.5 l%w/v氮源构成 增菌培养基，30 37'C培养40h;(2) 增菌条件在上述优化基础上优化牛:长条件，pH6.6 7.0，温度25 37'C，采用 摇动和静止培养方式；(3) 富集条件在增菌后菌体液基础上，通过4000 8000r/m， 10 20min条件下离心 浓縮增菌后的菌体；(4) 菌株冻干将富集后的菌体先处于w/v25M浓乳糖液中预处理，然后与冻干保护剂 vA^l:l混合，置于冻干机内冻干；(5) 菌株配比将四株菌进行等质量配比。冻干菌粉可直接以0.496。添加量投入生产， 也可以0.1%。接菌量在中间培养基中30'C活化12h后，以3%液态形式投入生产。
3、 根据权利要求2所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的 碳源包括葡萄糖、蔗糖和乳糖，重量百分比为1-4%。
4、 根据权利要求3所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的 氮源包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨，重量百分比为0.5-1%。
5、 根据权利要求4所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的 增菌培养基为肠膜明串珠菌4%庶糖，0.5%蛋白胨，0.5%大豆蛋白胨，牛肉膏lg， 酵母粉2g，氯化钠lg，水100ml，肠膜明串珠菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%;植 物乳杆菌2%蔗糖，2%葡萄糖，1%胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g， 吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml,植物乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%; 短乳杆菌2%蔗糖，1%大豆蛋白胨，2%葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g， 吐温80 0.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml，短乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%; 乳酸片球菌1%蔗糖，1%葡萄糖，1%胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰0.005g， 硫酸镁O.Olg，吐温80 0.002ml，水100ml，乳酸片球菌与增菌培养基的配比数值范围2-3%。
6、 根据权利要求5所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的 增菌条件中肠膜明串珠菌pH7.0，温度3(TC， 90r/m摇动培养；植物乳杆菌pH6.8， 温度30。C，静止培养；短乳杆菌pH6.6 6.8，温度30 37。C， 90r/m摇动培养；乳酸片球菌pH7.0，温度30'C，静止培养。
7、 根据权利要求6所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的 富集条件为肠膜明串珠菌6000r/m， 20min，植物乳杆菌8000r/m， 15min，短乳杆菌8000r/m， 15min，乳酸片球菌8000r/m， 20min;四株菌沉淀得率分别为肠膜明串珠菌21%，植物 乳杆菌12%，短乳杆菌10%，乳酸片球菌15%。
8、 根据权利要求7所述的高效降解亚"硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的 乳糖液与冻干保护剂包括脱脂乳、甘油和海藻糖，肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌 和乳酸片球菌与乳糖液与冻T保护剂配比体积比1:1为肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌12%脱脂乳+ 5%甘油+ 10%海藻糖；乳酸片球菌12%脱脂乳+ 5 %甘油+5 %海藻糖。
全文摘要
本发明提供了一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法。高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂包括等质量混合的植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌的冻干菌粉。它是通过CICC保存具有降解亚硝酸盐菌株在营养条件、生长条件和富集冻干条件下制备高菌数发酵剂，因而其产品安全，无副作用。经测定其菌数均大于≥10¹⁰CFU/g。20℃发酵300斤白菜10天发酵成熟，30℃发酵300斤白菜5天发酵成熟，混合发酵降解亚硝酸盐≥98％，酸菜风味好，产品品质优良。本发明能够使蔬菜发酵时间大大缩短到3～5天，可以用于工业化生产。
文档编号A23L1/218GK101326972SQ200810064999
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月28日 优先权日2008年7月28日
发明者刘丽波, 春 李, 涛 程, 韩建春 申请人:东北农业大学