专利名称：：杂交瘤、抗人膀胱癌的单抗和导向药物及膀胱癌诊断试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药生物
技术领域：
，特别涉及一种产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤DTB、其用途及制备方法，抗人膀胱癌的单克隆抗体DTB和导向药物及膀胱癌免疫诊断试剂，以及所述导向药物的制备方法。
背景技术：
：膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。尽管目前采用多种措施进行综合治疗，但仍有40%-70%的患者要发生一次或多次复发，10%-15%的患者发展成更高级别的肿瘤或发生转移，同时这些治疗方法还有明显的毒副作用。膀胱癌在肿瘤切除后的预防复发是临床的重要课题。目前用于膀胱灌注预防复发的药物主要分以下几类(l)抗肿瘤化疗药物，如阿霉素、丝裂霉素C、喜树碱类等；(2)免疫增强剂，以卡介苗(BCG)为典型代表。(3)细胞因子，如干扰素、白细胞介素-2。以上几类药物可以单独使用或联合使用，虽在降低膀胱癌术后复发率上取得一些效果，但因特异性差、肿瘤多耐药性(MDR)等问题的存在，总体疗效并不理想，高达40%-70%的患者要发生一次或多次复发，10%-15%的患者发展成更高级别的肿瘤或发生转移。且以上各类药物分子量小，不但可非特异性地作用于全膀胱及尿道，还可经膀胱及尿道粘膜吸收，因而容易产生局部及全身的毒副作用。以疗效较为肯定的丝裂霉素C及卡介苗为例使用卡介苗的患者90。/。有BCG膀胱炎，其它的副作用有血尿、皮渗、发热、关节炎、附睾炎、尿道狭窄等，还有少见而严重的肝炎及肺炎、致命性败血症等。丝裂霉素C的副作用相对较少，但仍有5%~25%的化学性膀胱炎、5%~15%的过敏性反应，还可见尿道狭窄、骨髓抑制、膀胱壁钙化等副作用。导向药物是具有导向能力的分子(如单克隆抗体)和具有活性的效应分子(如毒素、药物、放射性核素等)偶联而成的一种具有特异性识别、杀伤或显像的杂交分子。膀胱癌是一种人体腔内肿瘤，相当于一个人体的"肉试管"，而导向药物在体外对靶细胞具有高特异和强杀伤作用。寻找一种疗效好、副作用少的新的抗人膀胱癌的导向药物，在膀胱癌的治疗上具有重要意义。在膀胱肿瘤的筛查中，膀胱癌的早期发现和正确的预后估计对临床治疗显得极为重要。近年新用于临床的分子标记，如核基质蛋白、膀胱肿瘤抗原和卫星不稳定性等，也同样受限于灵敏度和特异性低的不足。尿脱落细胞学分析和膀胱镜检查仍然是膀胱癌诊断和监测的金标准。所以，寻求有效、便利的膀胱癌的诊断方法是非常必要的。
发明内容本发明要解决的技术问题旨在克服上述已有技术的不足，提供了一种杂交瘤，这种杂交瘤能够产生高效价的抗人膀胱癌的单抗。本发明采用的技术方案是一种产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤DTB,其特征在于所述杂交瘤由以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫的小鼠的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而得。进一步地，本发明涉及的杂交瘤由下述方法制备而得以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫小鼠，将致敏的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基进行选4奪性培养，用ELISA方法筛选阳性克隆后，用有限稀释法进行克隆，经过2-3轮克隆化培养，获得能够产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明的杂交瘤与已有技术相比具有以下积极效果能够产生高效价的抗人膀胱癌的单抗DTB,并且分泌稳定。本发明还涉及所述杂交瘤DTB用于制备抗人膀胱癌单克隆抗体DTB的用途。本发明还涉及一种产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤的制备方法，所述制备方法包括下述步骤以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫小鼠，将致敏的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养，用ELISA方法筛选阳性克隆后，用有限稀释法进行克隆，经过2-3轮克隆化培养，获得能够产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明的杂交瘤的制备方法与已有技术相比简单易操作。本发明还涉及一种单克隆抗体DTB,所述单克隆抗体是由上述的杂交瘤所产生。本发明的单克隆抗体与已有技术相比具有以下积极效果免疫组织化学和免疫荧光法证明，该抗体DTB与人膀胱癌组织及膀胱癌细胞E-J呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织和其它非膀胱癌细胞无交叉反应，表明抗膀胱癌单克隆抗体DTB特异性强。本发明还涉及一种抗人膀胱癌的导向药物，所述导向药物的抗体部分是上述抗人膀胱癌的单克隆抗体。进一步地，所述导向药物由上述的抗人膀胱癌的单克隆抗体和蓖麻毒素A链连接而成。本发明的导向药物与已有技术相比具有以下积极效果(1)杀伤肿瘤的作用强，不会产生耐药性，预防术后复发的效果明显优于目前常规的治疗方法，对一些原发肺瘤可以有效地控制其生长。(2)特异性好，避免了机体其它正常组织非特异摄取所致的损伤和蓖麻毒素B链的非特异性所带来的毒副作用。(3)不进入血液，可避免血清中的人抗鼠抗体(HAMA)以及抗蓖麻毒素A链抗体的产生。(4)局部给药，避免了血液的稀释。对那些由于种种原因对抗癌药物不敏感的复发患者，通过加大药物剂量、调整用药频率，可获得非常明显的治疗效果。体外细胞杀伤实验表明，DTB-RA具有很强的特异杀伤活性，其对人膀胱癌细胞E-J的半抑制浓度(IC5Q)为1.0x10—"M，而对非膀胱癌细胞(人直肠癌细胞Lovo)的半抑制浓度为1.2xlO—9M。本发明还涉及一种制备所述导向药物的方法，所述制备方法包括下述步骤完整的蓖麻毒素经还原及亲和层析，分离纯化得到具有酶活性蓖麻毒素A链(RA)。蓖麻毒素A链与摩尔比过量的交联剂SPDP反应，透析。DTB单抗与摩尔比过量的交联剂SPDP反应，搅拌，透析。分别将透析好的蓖麻毒素A链与DTB单抗以等摩尔比例混合，搅拌，过G-100凝胶过滤柱。上样后收集的第一洗脱峰即为导向药物DTB-RA,将DTB-RA过滤除菌，冻存。本发明的导向药物的制备方法与已有技术相比筒单易操作。本发明还涉及一种膀胱癌免疫诊断试剂，所述诊断试剂由包被在酶标板上的人膀胱癌细胞系E-J细胞裂解液和抗人膀胱癌单克隆抗体DTB组成，采用竟争ELISA法检测尿脱落细胞中的膀胱癌抗原。本发明的膀胱癌免疫"^断试剂与已有技术相比具有以下积极效果(1)非损伤性，直接检测尿脱落细胞，避免了膀胱镜检查给病人带来的不便与痛苦。(2)灵敏度达到了86%，特异性达到了92%，远高于目前的膀胱肿瘤标记物(如核基质蛋白、细胞角蛋白、透明质酸等)的检测和尿脱落细胞的病理学检查。(3)特异性强、灵敏度高，采用竟争ELISA法检测细胞中的膀敏度较低的缺点。(4)方便快捷，适合于早期膀胱癌患者的筛查和肿瘤复发的冲企测。本发明提供的抗人膀胱癌导向药物及其膀胱癌免疫诊断试剂，为癌症病人的诊断、治疗、预后和监测提供了有效的途径。图1表示本发明涉及的DTB单抗，按常规方法对膀胱癌细胞E-J进行免疫荧光的400倍照片；图2表示本发明涉及的DTB单抗，按常规方法对其它细胞进行免疫荧光的400倍照片；图3表示本发明涉及的导向药物DTB-RA鉴定的吸光光度值。保藏说明保藏日期2008年3月5曰保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位简称CGMCC保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院农i生物研究所，100101分类命名抗人膀胱癌单克隆抗体杂交瘤细胞株保藏编号CGMCCNo.2393具体实施例方式参照附图，将详细叙述本发明的具体实施方式。本发明涉及一种产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞抹DTB，它能够产生高效价的抗人膀胱癌的单抗DTB，并且分泌稳定。实施例l:制备杂交瘤细胞抹材料人膀胱癌细胞系E-J细胞(北京北方伟业发展有卩艮公司)Balb/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCCCRL-1772)方法1)免疫以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫Balb/C小鼠，以1x107个细胞/0.5mlPBS的剂量进行腹腔注射。2周后对小鼠进行再次免疫，注射体积和方法不变。待小鼠血清效〗介达到要求后准备进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行加强免疫。在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCCCRL-1772)。2)细胞融合将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞按照下述方法进行细胞融合(1)取对数生长的骨髓瘤细胞Sp2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(2)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10的比例混合在一起，用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分4中。(3)弃上清，用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动，在室温下融合①30秒内加入预热的lml45%PEG(Merek公司)含5%DMSO(Sigma公司)，边加边搅拌，作用90秒钟。②加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入lml,2ml,3ml，4ml，5ml和10ml。(4)离心，800rpm，6分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640(GIBCO公司)轻轻混悬。(5)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100jal/孔，37℃、5%C02孵箱培养。)，用HAT培养基进行选择性培养(以小鼠腹腔巨喧细月包为饲养细"包)。3)4企测用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清以E-J细胞(105个/ml)包被96孔板，每孔100pl，37。C培养过夜。细胞贴壁后，加4%多聚曱醛室温固定IO分钟，洗涤3次，加待检上清lOOul,37℃孵育1小时。洗涤3次，加酶标二抗(抗小鼠IgG-HRP),37℃孵育1小时。洗涤3次，加底物显色剂50pl，室温静置5分钟，加终止液50μl。结果用酶标仪测定波长450nm的OD值，OD值高于阴性对照2倍以上者可-见为阳性。4)细胞克隆化培养将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人膀胱癌单克隆抗体杂交瘤细胞抹，该杂交瘤细胞系于2008年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2393。实施例2:DTB单克隆抗体的制备和纯化将上述杂交瘤细胞DTB接种至小鼠腹腔，制备腹水，再从腹水中提取单抗。单抗DTB的纯化采用ProteinG亲和层析法。首先制备ProteinG亲和层析柱，用PBS平衡柱子后，取含DTB单抗的腹水过柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以0.2M的甘氨酸-HC1溶液(pH2.8)洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析浓缩后用于制备免疫偶联物。实施例3:DTB单克隆抗体的性质鉴定按常规方法对人膀胱癌组织切片进行免疫组化染色，结果如图1、2所示。结果表明，人膀胱癌组织经DTB单抗、二抗及底物染色后呈阳性反应，而人正常膀胱组织经DTB单抗、二抗及底物染色后呈阴性反应。用DTB单抗，按常规方法对膀胱癌细胞E-J和其它细胞进行免疫荧光。结果如图1、2所示。结果表明，DTB单抗与E-J细胞呈强阳性反应，与其它非膀胱癌细胞无交叉反应。表1DTB单抗与人细胞系的反应性<table><row><column>细胞系</column><column>DTB单抗</column></row><table><table><row><column>E-J</column><column>+++</column></row><row><column></column><column>293T</column><column>—</column></row><row><column></column><column>HepG2</column><column>—</column></row><row><column></column><column>Jurkat</column><column>—</column></row><row><column></column><column>K562</column><column>—</column></row><row><column></column><column>Lovo</column><column>—</column></row><row><column></column><column>MCF-7</column><column>—</column></row><table>实施例4:抗人膀胱癌的导向药物DTB-RA的制备免疫组织化学和免疫荧光法证明，DTB抗体与人膀胱癌组织及膀胱癌细胞E-J呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织和其它非膀胱癌细胞无交叉反应。表明抗膀胱癌单克隆抗体DTB特异性强，是理想的导向载体。蓖麻毒素A链(RA)是由完整的蓖麻毒素经还原及亲和层析分离纯化得到具有酶活性A链。蓖麻毒素A链能直接灭活真核生物细胞核糖体大亚基中的28SrRNA,从而阻断蛋白质合成，导致细胞死亡。抗人膀胱癌导向药物DTB-RA是由抗人膀胱癌单克隆抗体DTB与蓖麻毒素A链(RA),通过异型双功能交联剂SPDP化学偶联制备而成。方法1)蓖麻毒素的制备(1)蓖麻籽去壳，捣碎，研磨；用乙醚脱脂后，加入的醋酸水溶液溶解沉淀，用Tris-HCl(0.1M/pH8.4)透析，即为粗毒；(2)制备Sepharose-6B亲和层析柱，用Tris-HCl平衡柱子后，取粗毒过柱，然后用用Tris-HCl洗脱杂蛋白，至OD值接近于零，用含0.2M半乳糖的Tris-HCl緩冲液洗脱毒素蛋白，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液。)2)制备蓖麻毒素A链完整的蓖麻毒素经还原及亲和层析完整的蓖麻毒素与Sepharose-6B柱孵育后，用200mM的DTT洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析浓缩后用于制备免疫偶联物，分离纯化得到具有酶活性蓖麻毒素A链(RA)。3)交联蓖麻毒素A链与摩尔比10倍过量的交联剂SPDP反应，用醋酸緩冲液(0.02M,pH4.5)透析过夜，加入终浓度为50mM的二碌,苏糖醇(DTT)，室温搅拌30分钟，用PBS透析过夜。DTB单抗与摩尔比10倍过量的交联剂SPDP反应，室温搅拌30分钟，用PBS透析过夜。分别将透析好的蓖麻毒素A链与DTB单抗以等摩尔比例混合，室温搅拌过夜，加样于G-100凝胶过滤柱上。上样后收集各洗脱峰，第一峰即为导向药物DTB-RA,第二峰为DTB抗体，第三峰为蓖麻毒素A链(RA)，将DTB-RA过滤除菌，-20°C冻存。实施例5:抗人膀胱癌的导向药物DTB-RA的鉴定采用细胞杀伤结晶紫染色法分别将人膀胱癌细胞E-J和人直肠癌Lovo细胞(中国协和医科大学基础医学院细胞中心)接种于96孔板，细胞密度为1()S个/ml，37。C培养过夜。在起始孔内加入终浓度为1(T6M的导向药物DTB-RA,混匀，依次进行10倍梯度稀释。将96孔板放入培养箱，37°C、5%C02,培养24-48小时；弃去上清，每孔加入50)il染色液(50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定溶至100ml结晶紫)，室温放置30分钟；流水冲去染色液，吸干残留水分，每孔加入lOOpl脱色液，室温放置3-5分钟；测定波长570nm，结果如图3所示，对E-J细胞的半抑制浓度(IC5Q)为1.0x10—UM,而对Lovo细胞的半抑制浓度为1.2xl(T9M。实施例6:膀胱癌免疫诊断试剂的制备(1)膀胱癌细胞系E-J细胞裂解液酶标板的制备将107个新鲜培养的膀胱癌细胞E-J用1ml三去污裂解液(50mMTris-HCl,pH8.0;150mMNaCl;0.02%叠氮钠；0.1%SDS;100[ig/mlPMSF;l(ig/mlAprotinin;l%NP-40;0.5%脱氧胆酸钠)裂解，提取总蛋白，用pH7.4的0.1M磷酸盐緩冲液稀释至10ml,按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按200μl/孔加入含有1%明胶的0.1MpH7.4的磷酸盐緩冲液，37℃封闭2小时，洗涤甩干，再加入20%蔗糖磷酸盐緩冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。(2)膀胱癌抗原标准溶液的制备将1(f个新鲜培养的膀胱癌细胞E-J用lml三去污裂解液裂解，提取总蛋白；用稀释液(0.1MpH7.4的磷酸盐緩沖液)按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128倍数进行梯度稀释，加入1%BSA和50%甘油，-20℃保存备用。实施例7:膀胱癌免疫i貪断试剂的应用(1)样品4全测分别收集膀胱癌病人(I期、II期、III期)和健康人各50份新鲜尿液，每份50ml，离心后耳又细胞沉淀，加入100μl三去污裂解液裂解细胞，提取总蛋白，并与lmg/mlDTB单抗等体积混合，室温反应10分钟；以100μl/孔的体积加样，同时用膀胱癌抗原标准溶液作对照，37℃孵育1小时；甩去液体，用洗涤液(0.1MpH7.4的磷酸盐緩冲液，0.05%Tween-20)洗涤5次；甩干，加入辣才艮过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(Sigma公司)，100μl/孔，37℃孵育1小时；甩去液体，用洗涤液洗涤5次；加入底物(四曱基联苯胺，H202)100μl/孔，室温避光孵育10-20分钟；加入2MH2S0450μl中止反应；在酶标仪上测定OD值(450nm)。(2)结果分析标准溶液的OD最小值/OD临界值-0.5,得到OD临界值-OD最小值x2，根据OD临界值，判断其灵敏度为86%,特异性为92%,符合率为89%。结果如表2所示。表2膀胱癌免疫诊断试剂与膀胱癌病人和健康人的检测结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤DTB，其特征在于所述杂交瘤的亲本细胞是以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫的小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞。2、根据权利要求1所述的杂交瘤DTB,其特征在于所述杂交瘤由下述方法制备而得以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫小鼠，将致敏的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养，用ELISA方法筛选阳性克隆后，用有限稀释法进行克隆，经过2-3轮克隆化培养，获得所述能够产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞。3、权利要求1或2所述杂交瘤DTB用于制备抗人膀胱癌单克隆抗体DTB的用途。4、一种制备权利要求1或2所述杂交瘤的方法，其特征在于所述制备方法包括下述步骤以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫小鼠，将致敏的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基进行选4奪性培养，用ELISA方法筛选阳性克隆后，用有限稀释法进行克隆，经过2-3轮克隆化培养，获得能够产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞。5、一种抗人膀胱癌的单克隆抗体DTB,其特征在于所述单克隆抗体由权利要求1或2中任一权利要求所述的杂交瘤所产生。6、一种抗人膀胱癌的导向药物，其特征在于所述导向药物的抗体部分是权利要求5所述的抗人膀胱癌的单克隆抗体DTB。7、根据权利要求6所述的抗人膀胱癌的导向药物，其特征在于所述导向药物所述的抗人膀胱癌的单克隆抗体DTB和蓖麻毒素A链连接而成。8、一种制备权利要求7所述的导向药物的方法，其特征在于所述制备方法包括下述步骤完整的蓖麻毒素经还原及亲和层析，分离纯化得到具有酶活性蓖麻毒素A链(RA)。蓖麻毒素A链与摩尔比过量的交联剂SPDP反应，透析。DTB单抗与摩尔比过量的交联剂SPDP反应，搅拌，透析。分别将透析好的蓖麻毒素A链与DTB单抗以等摩尔比例混合，搅拌，过G-100凝胶过滤柱。上样后收集的第一洗脱峰即为导向药物DTB-RA,将DTB-RA过滤除菌，冻存。9、一种膀胱癌免疫诊断试剂，其特征在于所述诊断试剂由包被在酶标板上的人膀胱癌细胞系E-J细胞裂解液和抗人膀胱癌单克隆抗体DTB组成，采用竟争ELISA法检测尿脱落细胞中的膀胱癌抗原。全文摘要本发明涉及产生抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤，所述杂交瘤的亲本细胞是以人膀胱癌细胞系E-J细胞免疫的小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞。本发明还涉及所述杂交瘤的用途及制备方法，由所述杂交瘤所产生的单克隆抗体，抗膀胱癌的导向药物及膀胱癌免疫诊断试剂，以及所述导向药物的制备方法。其中，所述导向药物的抗体部分是所述抗人膀胱癌的单克隆抗体。所述诊断试剂由包被在酶标板上的人膀胱癌细胞系E-J细胞裂解液和抗人膀胱癌单克隆抗体DTB组成，采用竞争ELISA法检测尿脱落细胞中的膀胱癌抗原。本发明的抗体特异性强；本发明的导向药物杀伤肿瘤的作用强，不会有耐药性，特异性好；本发明的诊断试剂具有非损伤性，高灵敏度，高特异性，方便快捷的特点。文档编号C12N5/20GK101343623SQ20081010013公开日2009年1月14日申请日期2008年5月26日优先权日2008年5月26日发明者强侯,翀李,刚栗,王德朋申请人:翀李