专利名称：：一种控制大菌生长促进维生素c生产的方法
技术领域：
：一种控制大菌生长促进维生素C生产的方法，属于生物工程
技术领域：
。2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonicacid,2-KGA)，简写为KGA，是维生素C的重要前体物质，本发明涉及一种控制大菌生长促进维生素C生产的方法。通过在大菌生长的对数末期加入一定量溶菌酶，促进小菌生长和KGA生产。
背景技术：
：维生素C，又称抗坏血酸，作为人体必需的一种维生素和抗氧化剂，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中。随着维生素c应用范围的不断扩大，维生素c的市场需求量也在不断的增长。最早实现维生素C工业化生产的工艺是德国Reichstein于1934年发明的五步化学反应和一步生物转化，先将葡萄糖转化为2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-Gulonicacid，2-KGA)，再经酯化生成维生素C。但该法存在能耗高、消耗大量有机溶剂、环境污染严重等缺点。因此需要开发更经济、更具有竞争力的生物转化法或完全生物转化法。与"莱氏法"生产维生素C的六步反应相比，用微生物从D-山梨醇或D-葡萄糖经两步发酵生成2-KGA，再经甲醇酯化生产维生素C的生物技术法具有工艺流程简单、生产周期短、成本低廉，环境友好等优点。鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，作用位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的p-1,4糖苷键。细胞壁肽聚糖主要由NAM、NAG和肽"尾"(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过(3-1,4糖苷键相连，肽"尾"则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽"桥"(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽"尾"与肽"桥"共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架。对于G+细菌与G—细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G—细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌作用不大。维生素C二步发酵中的第二步发酵由氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌共同完成，其中伴生菌巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌为革兰氏阴性菌。普遍认为，伴生菌形成芽孢的过程中释放出活性物质来促进小菌生长或产酸。本发明拟通过添加溶菌酶一方面加速大菌裂解释放出活性物质促进小菌产酸，一方面大菌裂解后不再形成芽孢，减少了发酵后期芽孢萌发所消耗的营养成分。
发明内容本发明的目的是促进维生素c生产。在混菌发酵过程中，当大菌生长到对数末期后加入一定量溶菌酶，研究溶菌酶的添加对维生素c发酵过程的影响。本发明的技术方案一种控制大菌生长促进维生素C生产的方法，是在发酵过程中，当巨大芽孢杆菌Sac!7/^megflten'wm，俗称大菌达到对数末期时，即发酵开始后12-15h，添加100000U/mL-200000U/mL浓度的溶菌酶破坏大菌细胞壁，使大菌迅速裂解释放胞内物质促进氧化葡萄糖酸杆菌G/wo"o^"wo;^&w，俗称小菌生长和产酸；使混菌中小菌的生物量提高20%，KGA产量提高10%，发酵周期縮短14h。禾lj用巨大芽孢杆菌(万fl"7/i^，俗称大菌，)为生产菌株；发酵培养基以g/L计山梨糖80，尿素12，碳酸钙5，玉米浆粉5，磷酸二氢钾1，MgSO40.1;pH6.7-7.0;摇瓶培养条件将30。C、200rpm下培养18h的混菌种子以10%的接种量转入发酵培养基于30'C、200rpm条件下培养54-58h。发酵过程中添加溶菌酶后，维生素C发酵的KGA产量达到77.9g/L，发酵周期縮短14h。1、菌株巨大芽孢杆菌ATCC21916(BacW/i^wegaten'Mm,俗称大菌)、氧化葡萄糖酸杆菌ATCC15163(G/wco"okz"ero;q>Y/a"s，俗称小菌)，购自美国典型微生物菌种保藏中心。2、培养基种子或斜面培养基(g/L):山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，玉米浆粉0.15，尿素1，碳酸钙1，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1;斜面培养基中添加琼脂20，pH6.7-7.0。发酵培养基以g/L计山梨糖80，尿素12，碳酸钙5，玉米浆粉5，磷酸二氢钾1，MgSO40.1;pH6.7-7.0;3、摇瓶培养将30°C、200rpm下培养18h的混菌种子以10。/。的接种量转入发酵培养基于30°C、200rpm条件下培养，发酵开始后12-15h，添加100000U/mL-200000U/mL浓度的溶菌酶，发酵时间由原来的68-72h，縮短至54-58h。4、发酵罐培养将30°C、200rpm下培养18h的混菌种子以10%的接种量转入3L发酵罐培养基中于30°C、200rpm条件下培养，发酵开始后12-15h，添加100000U/mL-200000U/mL浓度的溶菌酶，发酵时间由原来的68-72h，縮短至54-58h。发酵培养基以NaOH调节pH值为7.0。KGA浓度的测定高效液相色谱(HPLC)。仪器Agilent1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器和工作站)。色谱条件色谱柱AminexHPX-87H(300mmx7.8mm);流动相0.4mmol/LH2S04;流速0.5mL/min;柱温35°C;检测器UV:210nm;进样体积5pL。样品制备精确吸取0.1mL的发酵液加入0.9mL去离子水中，混匀，按发酵液:ZnS04(72g/L):K4Fe(CN)6'3H20(36g/L)=l:l:l的比例混合均匀，13000r/min离心10min，过滤，进样。本发明的有益效果本发明利用溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁作用效果的差异，在发酵过程中添加一定浓度的溶菌酶，利用溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的破坏作用，使大菌迅速裂解释放胞内物质促进小菌生长和产酸。发酵过程中添加不同浓度的溶菌酶发现，添加100000U/mL及以上溶菌酶使发酵周期縮短13h左右，同时，KGA的平均生产速率由1.1g/(L，h)增加到1.3g/(L-h)左右。在3L发酵罐中，添加200000U/mL溶菌酶使发酵周期由68h縮短为54h，縮短14h，KGA产量提高约10。/Q，且混菌中小菌的细胞生长与未添加溶菌酶相比提高20%。图1添加不同浓度溶菌酶对维生素C发酵的影响A发酵周期；BKGA平均生产速率。图2添加200000U/mL溶菌酶对细胞生长的影响(12h添加溶菌酶)□氧化葡萄糖酸杆菌，0U/mL溶菌酶；國氧化葡萄糖酸杆菌，200000U/mL溶菌酶；△巨大芽孢杆菌，0U/mL溶菌酶；A巨大芽孢杆菌，200000U/mL溶菌酶。图3添加200000U/mL溶菌酶对KGA生产和山梨糖消耗的影响□0U/mL溶菌酶，KGA生产；■200000U/mL溶菌酶，KGA生产；△0U/mL溶菌酶，山梨糖消耗；▲200000U/mL溶菌酶，山梨糖消耗。具体实施例方式实施例l:不同浓度溶菌酶对维生素C发酵的影响5在发酵过程中，当大菌生长到对数末期(约15h)，添加溶菌酶浓度分别为0U/mL、50000U/mL、100000U/mL、200000U/mL禾n400000U/mL，考察不同浓度溶菌酶的添加对维生素C发酵的影响。在大菌生长的对数末期添加不同浓度溶菌酶(图1)，均可以使维生素c的发酵周期縮短，且KGA的平均生产速率都有所提高。其中，当溶菌酶的浓度达到100000U/mL及以上时，发酵周期由原来的69h縮短到56h;添加200000U/mL溶菌酶时KGA平均生产速率最高，达到1.3g/(L-h)。实施例2:在3L发酵罐中添加200000U/mL溶菌酶对维生素C发酵的影响在实施例1的基础上，确定溶菌酶的最佳添加浓度为200000U/mL。在3L发酵罐中考察添加溶菌酶对维生素C发酵过程的影响。在混菌发酵过程中，当大菌巨大芽孢杆菌生长到对数末期(12h)后，加入200000U/mL溶菌酶，发现添加溶菌酶后，混菌中的大菌在3h内迅速裂解释放胞内物质，之后的发酵液中很难观察到大菌的存在，而未添加溶菌酶组中大菌细胞缓慢下降，几乎整个周期都能观察到大菌的存在；添加溶菌酶促进大菌的裂解释放胞内物质，该物质促进小菌细胞生长和KGA生产，使KGA的产量提高约10%，发酵周期缩短14h。未添加溶菌酶与添加溶菌酶特征发酵参数对比如表1所示。表1未添加溶菌酶与添加溶菌酶特征发酵参数的》<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种控制大菌生长促进维生素C生产的方法，其特征是在发酵过程中，当巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium，俗称大菌达到对数末期时，即发酵开始后12-15h，添加100000U/mL-200000U/mL浓度的溶菌酶破坏大菌细胞壁，使大菌迅速裂解释放胞内物质促进氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans，俗称小菌生长和产酸；使混菌中小菌的生物量提高20％，KGA产量提高10％，发酵周期缩短14h。全文摘要一种控制大菌生长促进维生素C生产的方法，属于生物工程
技术领域：
。本发明利用溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁作用效果的差异，在发酵过程中添加一定浓度的溶菌酶，利用溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的破坏作用，使巨大芽孢杆菌，俗称大菌迅速裂解释放胞内物质促进氧化葡萄糖酸杆菌，俗称小菌生长和产酸。发酵过程中添加不同浓度的溶菌酶发现，添加100000U/mL及以上溶菌酶使发酵周期缩短13h左右，同时，KGA的平均生产速率由1.1g/(L·h)增加到1.3g/(L·h)左右。在3L发酵罐中，添加200000U/mL溶菌酶使发酵周期由68h缩短为54h，缩短14h，KGA产量提高约10％，且混菌中小菌的细胞生长与未添加溶菌酶相比提高20％。文档编号C12P39/00GK101475977SQ20081024267公开日2009年7月8日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者杰刘,刘立明,静张,坚陈申请人:江南大学