专利名称：使用光学和电学测量方法检测分析物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测一个或多个分析物、特别是用于检测蛋白或
DNA的方法。具体而言，本发明涉及用于检测分析物的方法，所述方法 同时包括对经标记的分析物的光学检测和电学检测。
背景技术：
用于检测分析物的方法在生化分析领域内是公知的。在传统方法中， 通常用荧光标记物来标记分析物以便鉴定所述分析物，所述荧光标记物 能够通过例如荧光检测而被检测到。
过去几年在DNA检测领域中，使用了纳米颗粒作为标记物。这些标 记物将可能用于任何允许进行标记并涉及结合的体系，因而可以用在活 细胞体系以及蛋白和核酸中。已发现纳米颗粒能克服荧光标记物的一些 局限性，包括成本、易用性、灵敏度和选择性(Fritzsche W， Taton T A, Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal麵oparticles as labels, for heterogeneous, chip-based DNA detection")。金纳米颗粒已经成功用在 DNA杂交的检测中，所述检测基于胶体金标记物(tag)的电化学溶出检 观!l(Wang J, Xu D， Kawde A, Poslky R， Analytical Chemistry (2001), 73, 5576-5581 "Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization")。半导体纳米晶体(也称作 量子点)和金纳米颗粒的使用也已成功地作为荧光标记物用于DNA杂交 石开究(West J， Halas N， Annual Review of Biomedical Engineering, 2003， 5: 285-292 "Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications: Improving Sensing, Imaging and Therapeutics")。
尽管通过在DNA检测方法中使用纳米颗粒替代此前的荧光标记物 而发现了所述优点，但是仍然需要改善所述检测方法的灵敏度和选择性。虽然各个检测方法均具有一定程度的灵敏度和选择性，但它们各自具有 不同的局限性并产生了不同的不准确度。
除了在分析物的检测方法中需要改善的灵敏度和选择性以外，还越
来越需要快速、廉价和简便的检测方法，特别是用于DNA的检测方法。
发明内容
本发明的目的是克服与上述现有技术相关的问题。具体而言，本发 明的目的是提供一种具有改善的灵敏度和选择性的用于检测分析物的方 法，并且所述方法的实施快速、廉价和简便。
于是，本发明提供了一种用于检测分析物的方法，其中，所述分析 物由与该分析物有关的一个或多个标记物进行标记，所述方法包括
a) 在经标记的所述分析物上进行光学检测方法以便从所述一个或 多个标记物获得光学数据；
b) 在经标记的所述分析物上进行电学检测方法以便从所述一个或 多个标记物获得电学数据；和
c) 由所述光学数据和电学数据确定所述分析物的身份和/或数量。 本发明还提供了一种用于检测多个分析物的方法，其中，各个不同
的所述分析物由与该分析物有关的一个或多个不同标记物进行标记，所 述方法包括
a) 在多个经标记的分析物上进行光学检测方法以便从所述标记物 获得光学数据；
b) 在所述多个经标记的分析物上进行电化学检测方法以便从所述 标记物获得电学数据；和
c) 由所述光学数据和电学数据确定所述多个分析物的身份和/或数
本发明的突出之处在于光学检测方法和电学检测方法都在一个或多 个经标记的分析物上进行。本发明人惊人地发现如果先进行光学方法再 进行电学方法，则光学检测方法和电学检测方法都能在一个或多个经标 记的分析物上进行。本发明人还惊人地发现在一个优选实施方式中，使用适用于光学检 测和电学检测的标记物使得所述经标记的分析物在光学检测后处在能成 功地用于电学检测的状态。
本发明的方法的优点在于它们改善了结果的灵敏度和选择性。当要 检测多个不同分析物时，本方法增加了检测分析物的准确度和数目。这 些优点是由使用来自光学检测方法的光学数据和来自电学检测方法的电 学数据以确定 一个或多个分析物的身份和/或数量所直接产生的。
虽然在本领域内已知的是对分析物分别使用光学检测方法和电学检 测方法，但从未有教导或甚至建议在一个或多个经标记的分析物上同时 使用两种方法。
在本发明的一个优选方面中，所述一个或多个标记物适用于光学检
测和电学检测，并且所述方法的用于步骤(a)中的所述一个或多个标记物 与用于步骤(b)中的所述一个或多个标记物相同。这更容易使得能将来自
光学方法和电学方法的数据用于确定一个样品中的一个或多个分析物的 身份和/或数量。
在本发明的一个 替代性 方面中，步骤(a)中的所述一个或多个标记物 适用于光学检测而步骤(b)中的所述一个或多个标记物适用于电学检测， 并且步骤(a)中的所述一个或多个标记物与步骤(b)中的所述一个或多个标 记物不同。由于当在不同标记物上进行光学检测和电学检测时这样提供 了更多数据，因而这是有利的。
与进行光学检测方法或进行电学检测方法相比，本发明的方法fe灵 敏度和选择性得到显著改善。
此外，本发明的方法可以快速、廉价和简便地实施。
下面将参照附图对本发明进行进一步详细说明，在所述附图中 图1显示了本发明的方法的示意图。所述方法可以用于检测包括 DNA或RNA在内的任何分析物。
图2显示了以用于步骤(a)和步骤(b)的不同标记物来标记一个或多个分析物的不同途径的流程图。
图3显示了以用于步骤(a)和步骤(b)的不同标记物来标记一个或多个 分析物(当其为核酸时)的方法的示意图。
图4显示了仅带有探针的电极(黑色圆圈)、带有以100nM的互补靶
标杂交的探针的电极(黑色三角)和带有除去靶标后的探针的电极(白色三 角)的Nyquist图。
图5显示了仅带有探针的电极(黑色圆圈)和以100nM的非互补靶标 杂交后的电极(黑色三角)的Nyquist图。
图6显示了从杂交有互补靶标或非互补靶标的电极测量的荧光。误 差条显示了整个电极上的像素强度的标准偏差。
具体实施方式
， 在本方法中用于检测的分析物优选包括选自细胞、蛋白、多肽、肽、 肽片段、氨基酸、DNA和RNA的一种或多种化合物。本发明的方法对 DNA和RNA检测特别有用。
本发明的方法可以用于检测一个分析物或多个不同分析物。当所述 方法用于检测多个不同分析物时，各个不同分析物可以由与该分析物有 关的一个或多个不同标记物进行标记。作为另一种选择，可以通过空间 分离(如通过在表面上排列一组用于分析物的探针)来检测多个分析物。多 个不同分析物的检测也称作多路检测(multiplexing)。
标记
在本发明的一个优选实施方式中，所述一个或多个标记物选自纳米 颗粒、单分子、靶标的固有成分(如特定的核酸或氨基酸)和化学发光酶。 合适的化学发光酶包括HRP和碱性磷酸酶。 -
在本发明的一个实施方式中，其中，所述方法的步骤(a)所用的一个 或多个标记物与步骤(b)所用的一个或多个标记物不同，步骤(a)所用的一 个或多个标记物可以为例如荧光团，而步骤(b)所用的标记物可以为纳米 颗粒、单分子和化学发光酶。
所述标记物优选为纳米颗粒。在本发明的一个实施方式中(其中步骤(a)所用的一个或多个标记物与步骤(b)所用的一个或多个标记物相同)， 纳米颗粒特别有利，这是因为所述纳米颗粒可成功运行在光学检测方法 和电学检测方法中。纳米颗粒与表面的接近不是特别重要，这使得所述 检测更加灵活。在一个优选实施方式中，所述纳米颗粒包括一组分子的 集合，因为与使用单分子时相比，这样能在光学检测方法和电学检测方 法中产生更大的信号。
优选的是，所述纳米颗粒选自金属、金属纳米壳(nanoshell)、金属 二元化合物和量子点。优选的金属或其它元素的实例是金、银、铜、镉、 硒、钯和铂。优选的金属二元化合物和其它化合物的实例包括CdSe、 ZnS、 CdTe、 CdS、 PbS、 PbSe、 Hgl、 ZnTe、 GaAs、 HgS、 CdAs、 CdP、 ZnP、 AgS、 InP、 GaP、 GalnP和InGaN。
金属纳米壳是包含由薄金属壳包围的核心纳米颗粒的球形纳米颗 粒。金属纳米壳的实例是由薄金壳包围的硫化金或二氧化硅核心。'
量子点是半导体纳米晶体，它们是具有高度光吸收性的发光纳米颗. 粒(West J， Halas N, Annual Review of Biomedical Engineering, 2003， 5: 285-292 "Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications: Improving Sensing, Imaging and Therapeutics")。量子点的实例是CdSe、 ZnS、 CdTe、 CdS、 PbS、 PbSe、 Hgl、 ZnTe、 GaAs、 HgS、 CdAs、 CdP、 ZnP、 AgS、 InP、 GaP、 GalnP和InGaN纳米晶体。
可以将任何上述标记物附加到抗体上，例如见图1，其中显示了以 纳米颗粒标记的抗生物素。
所述标记物的尺寸优选为直径小于200 nm，更优选为直径小于100 nm，进一步优选为直径2 nm 50 nm，进一步更优选为直径5 nm 50 nm， 再进一步更优选为直径10 nm 30 nm，最优选为15 nm 25 nm。
当本发明的方法用于检测多个分析物时，各个不同分析物由与该分 析物有关的一个或多个不同标记物进行标记。在本发明的这一方面，所 述标记物可以因其组成和/或类型而不同。例如，当所述标记物为纳米颗 粒时，所述标记物可以为不同的金属纳米颗粒。当所述纳米颗粒为金属 纳米壳时，核心和壳层的尺寸可以变化以便产生不同的标记物。此外，或者作为另一种选择，所述标记物具有不同的物理性质，例如尺寸、形 状和表面粗糙度。在一个实施方式中，所述标记物可以具有相同的组成 和/或类型以及不同的物理性质。
用于不同分析物的不同标记物优选在光学检测方法和电学检测方法 中可以相互区分。例如，所述标记物可以具有不同的发射频率、不同的 散射信号和不同的氧化电位。
标记分析物
在本发明的一个优选实施方式中，所述方法在步骤(a)之前还包括以
一个或多个标记物来标记所述分析物以形成经标记的分析物的步骤。 用于标记分析物的手段不受特别限制并且在本领域中公知有许多合
适的方法。例如，当分析物为DNA或RNA时，可以通过结合有标记物 的引物的酶促延伸、在配体或反应性位点处的杂交后标记或未标记靶标 与标记物-寡核苷酸偶联探针的"夹心(sandwich)"杂交来标记所述分析物 (Fritzsche W, Taton T A， Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection")。
在本领域内已知有许多不同的方法用于将寡核苷酸与纳米颗粒偶 联，例如巯基修饰的寡核苷酸和二硫键修饰的寡核苷酸自发地结合到金 纳米颗粒表面、二硫键及三硫键修饰的偶联物、寡巯基-纳米颗粒偶联物 和来自Nanoprobe的膦修饰纳米颗粒的寡核苷酸偶联物(见Fritzsche W, Taton T A, Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection"中图2)。
图1显示了整合到DNA或RNA分子内的生物素。当发生与互补探 针的结合时，双螺旋被抗生物素抗体标记，而抗生物素抗体由适用于光 学检测和电学检测的纳米颗粒标记。
在一个实施方式中，可以将DNA或RNA链都进行生物素标记。可 以将经生物素标记的靶标链与寡核苷酸探针涂覆的磁珠杂交。然后可以 将链霉亲和素涂覆的金纳米颗粒与所捕获的靶标链结合(Wang J， Xu D, Kawde A， Poslky R, Analytical Chemistry (2001), 73， 5576-5581 "Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection ofDNAhybridization")。所述磁珠使得能以磁性方式除去未杂交DNA。
在本发明的一个实施方式中(其中步骤(a)所用的所述一个或多个标 记物与步骤(b)所用的一个或多个标记物不同)，可以如下标记一个或多个 分析物，例如步骤(a)用一个或多个荧光团标记物，而步骤(b)用一个或多 个纳米颗粒标记物。步骤(a)中的所述荧光团适用于光学检测而步骤(b)中 的所述纳米颗粒适用于电学检测。可以将所述分析物以所述两个不同标 记物同时进行标记，或将所述分析物分为两个等分试样并分别标记。光 学数据和电学数据的测量在一个芯片或不同芯片上获得。在图3的流程 图中显示了以不同标记物来标记一个或多个分析物的步骤，其中所述分 析物为核酸，所述荧光团用于步骤(a)的光学检测而所述金/银纳米颗粒用 于步骤(b)中的检测。
在图3中显示了在该实施方式中用于以不同标记物来标记一个或多 个核酸分析物的特别优选的方法。该方法采用了以适用于电学检测的标 -记物来标记的引物。所述引物与靶标核酸序列结合并用合适的酶(逆转录 酶用于RNA， DNA聚合酶用于DNA)来延伸。用于所述引物延伸的一个
或多个核苷由一个或多个用于光学检测的标记物(例如荧光团)进行标记。 因此，延伸步骤在所述寡核苷酸中引入了一个或多个光学标记物。延伸 步骤的最终产物含有两个不同标记物。 光学检测方法
光学检测方法优选地选自光发射检测、光吸收检测、光散射检^、 光谱位移检测、表面等离子共振成像和来自吸附染料的表面增强拉曼散 射。
在一个优选实施方式中，所述光学检测方法是光发射检测，并且包
括用能够激发标记物的光照射经标记的分析物并检测来自所述标记物的
的光发射的频率和强度的步骤。所述频率和/或强度的光学数据能够用在
本发明的方法的步骤(c)中以提供关于存在的分析物的身份和/或数量的 梓自
I Fl 'S、 o
在该优选实施方式中，如果使用多个不同标记物来标记不同的分析 物，则各个标记物优选具有不同的发射频率。所述标记物的类型、组成、
12尺寸、形状和粗糙度将决定来自所述标记物的发射的共振频率。因此， 可以改变标记物的所有这些性质来将发射频率"调谐"至期望频率。这 样，可以在多路检测方法中采用相同材料类型但不同尺寸(或相同尺寸但 不同材料)的标记物。
在本发明中，在光学检测方法中采用的光不受特别限制，只要它能 够充分激发所述一个或多个标记物即可。通常对嵌入的经标记的分析物 进行曝光所用的光是激光。所述光的频率也不受特别限制，并且可以采 用紫外光、可见光或红外光。
在一个优选实施方式中，当所述标记物为金属纳米颗粒或金属纳米 壳时，所采用的光是白光。
在另一个优选实施方式中，当所述标记物是单分子或量子点时，所 采用的光是激光。
用于进行其它光学检测方法的方法在本领域内是公知的，包括光吸 收检测、光散射检测、光谱位移检测、表面等离子共振成像和来自吸附
染料的表面增强拉曼散射(Fritzsche W， Taton T A， Nanotechnology 14
(2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based
DNA detection")。
在一个优选实施方式中，所述光学检测方法在芯片上进行。 电学检测方法 -电学检测方法优选地选自电阻检测和电化学检测。 电阻检测方法在本领域内是公知的(Fritzsche W， Taton T A，
Nanotechnology 14 POO" R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for
heterogeneous, chip-based DNA detection")。
优选的是，所述电学检测方法是电化学检测。在一个实施方式中，
所述电化学检测包括下列步骤
(i) 将经标记的分析物置于包含两个电极的溶液中从而所述一个或 多个标记物溶解到该溶液中；
(ii) 在这些电极上施加沉积电位从而所述一个或多个标记物沉积到
这些电极中的一个之上；和(m)检测来自这个电极的电化学信号。
在步骤(i)中，所述溶液不受特别限制，只要它适用于溶解所述一个 或多个标记物即可。所述溶液优选含有酸以便使得所述一个或多个标记 物溶解。该步骤通常会破坏所述分析物和标记物。因此，光学检测方法 必须在电学检测方法之前进行。
在步骤(ii)中，施加电位以便将所述标记物镀覆到所述电极上。沉积 时间不受特别限制，但优选大于l秒，更优选大于30秒，再更优选大于
l分钟且最优选为2分钟。
沉积步骤通常为慢速步骤，它受到溶解的标记物扩散通过溶液并与 发生氧化还原电镀反应的电极表面接触所需的相对较长时间的控制。由 于该步骤缓慢，所获得的信号可能相对较弱，并且可能不适用于测量目 的。因此，在一个优选实施方式中，步骤(ii)还包括在所述电极上施加第 二电位以便使所述电极上沉积的标记物发生第二氧化还原反应的步骤。 这样产生了信号。所述第二氧化还原反应可以是所述沉积的标记物的氧 化。该第二氧化还原反应更快，因为它不再受扩散控制。这样产生了强 得多的信号，即更高的灵敏度。
在一个实施方式中(其中所述标记物为金属纳米颗粒(例如金))，所 述第二氧化还原反应是所镀金属的氧化。
如果使用多个不同标记物来标记不同分析物，各个标记物优选对于 电化学检测方法具有不同的氧化电位，因而在所获得的数据中产生不同 的信号峰。例如，当金属纳米颗粒用作不同分析物的标记物时，可以对 各分析物使用具有不同氧化电位的不同金属。
在所述电化学检测方法的步骤(ii)中，所述沉积电位优选为-0.1 V -1.0 V,且更优选为-0.5 V -0.8V。
在步骤(ii)的优选实施方式中(其中步骤(ii)还包括对所述电极施加第 二电位以使所沉积的标记物发生氧化还原反应)，所述第二电位为+1.0 V +2.0V，且优选为+1.2 V +1.8 V。
在本发明的优选的电化学检测方法中，所述标记物优选为一组物种 的集合的纳米颗粒。这确保了在所述电化学检测中产生的信号大到足以被准确且灵敏地检测。当使用单分子纳米颗粒时，这提供了非常低的电 流因而检测灵敏度低。
在一个优选实施方式中，所述电学检测方法在芯片上进行。所迷芯 片可以是用于光学检测方法的同一芯片或不同的芯片。在本发明的一个
实施方式中(其中在用于光学检测的步骤(a)中和在用于电学检测的步骤 (b)中使用了 一个或多个不同的标记物)，当 一个或多个分析物同时由不同
标记物进行标记时，光学检测和电学检测可以在一个芯片上进行(见图
2)。作为另一种选择，当所述一个或多个分析物被分为两个等分试样并 分别标记时，可以将它们在标记后合并用于在一个芯片上进行光学检测 和电学检测，或可以在两个不同芯片上分别进行光学检测和电学检测(见 图2)。
在本发明的一个实施方式中(其中所述一个或多个分析物为核酸且 使用经标记的引物和利用经标记的核苷的引物延伸来进行所述标记步骤 (见图3))，经标记的延伸引物可以与用于光学检测和电学检测的探,十一杂 交(见图3)。由于这使得用于电学检测的一个或多个标记物能被置于^于 检测的电极的近距离内因而特别有利，如图3所示。
由光学数据和电学数据确定分析物的身份和/或数量
在本发明的方法的步骤(c)中，从步骤(b)中所获的光学数据和电学数 据确定一个或多个分析物的身份和/或数量。
例如，当使用光发射检测作为光学检测方法时，可以使用来自标记 物的光发射的强度来提供关于存在的分析物的身份和/或数量的信息。
例如，当使用电化学检测作为电学检测方法时，可以通过伏安法来 对存在的标记物的量进行定量。可以通过积分(即对产生的各个信号峰确 定谱图下方的面积)来从信号峰获得定量数据。
以纳米颗粒标记DNA分析物
按照常规技术，使RNA逆转录，引入以纳米颗粒标记的核苷酸。 光学检测和电化学检测
按照常规方法，用给定波长的光激发标记物，并在预定波长处检测 其发射。然后在来自光学检测方法的经标记的分析物上进行电化学检测。，将 所述经标记的分析物溶解在酸性溶液中。将电极插入溶液且沉积电位为
-0.8 V。在2分钟的沉积时间后，施加+1.2V的第二电位以使沉积的纳米 颗粒氧化。对电化学信号进行检测。
下面将以仅仅举例的方式对本发明进行进一步说明。
实施例
实施例1——方案 清洁金电极
用电化学脉冲法在1.4 V (相对Ag/AgCl参比电极)在磷酸盐缓冲液 (PBS)中将金电极清洁30秒。然后在室温用超纯水洗涤电极5分钟。将 电极在室温的氮气流下干燥1分钟。
75聚体巯基修饰的ssDNA (HCV探针)的固定化
在固定化前，用30分钟使用5 mMTCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)的 PBS溶液从巯基化寡核苷酸中除去二硫键保护基，接着用MicroSpin G-25柱进行纯化。将寡核苷酸(HCV探针=5' - GGC AAT TCC GGT GTA CTC ACC GGT TCC GCA GAC CAC TAT GGC TCT CCC GGG AGG GGG GG - 3'， [5，] = SH) (10 75聚体巯基修饰的ssDNA)在PBS (10 mM， 137mMNaCl， 2.7mMKCl， pH 7.4)中的洁净金电极上在30°C 温育16小时。以PBS、 NaCl (1 M)和PBS先后洗涤电极三次，每次10 分钟。将电极在室温的氮气流下干燥1分钟。在使用前，将电极储存在4'C 的2xSSC缓冲液中。
电化学表征和光学表征
在含10 mM [Fe(CN)6f"-的2xSSC (电化学缓冲液(EB))中使用叠加 在相对Ag/AgCl参比电极的0.24 V直流电压上的100 KHz 100 mHz的 频率窗内的10 mV交流电压进行电化学阻抗谱分析。然后将电极用水在 室温洗涤(l分钟)并在氮气流下干燥(l分钟)。对于与HCV靶标的杂交， 将电极在55。C的2xSSC缓冲液中与100 nM DNA靶标(A或B)—起温育 2小时A:互补HCV耙标=5' - CCC CCC CTC CCG GGA GAG CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG G - 3， ， [5'] = Cy3
B:非互补HCV靶标=5， - AGT GTT GAG GGC CGT AAG CGT GTT GTG TCC GAC GCT GCC TGC GCA CTG CCG GTG CGT GTC GTCCCACGGTATTTG國3'， [5'] = Cy3
杂交后，在室温以2xSSC和0.2xSSC先后洗涤电极10分钟。在微 阵列扫描仪(Tecan LS Reloaded)中用534 nm的激发和570 nm的发射来测 定荧光(见下文)。通过在90。C的水中洗涤3分钟来实现了将靶标从电极 中溶出。
结果
为了评价单杂交实验的电化学检测和光学检测的结果，使用Tecan LS Reloaded微阵列扫描仪通过电化学阻抗谱(见图l)和荧光强度测定(见 图2)进行了电子转移阻抗(Ret)的检测。在互补靶标DNA杂交后能看到 -Ret的10 的显著增加以及荧光强度的显著增加(见电极1)。仅带有探 针的电极的荧光强度值在27士57a.11.(任意单位)范围内。与非互补靶 标一起温育导致了明显减小的信号变化(见电极2)并且能与互补靶标事件 清楚地区分。注意，以不同电极来完成对不同靶标的结合效果的评价以 便排除交叉污染。
电极1电极+探针 (无靶标)互补靶标非互补耙标
荧光[a.u.]27 ±57*2743 ±891未测
Ret ,25.2936.3未测
*探针覆盖的电极的荧光强度值，其中以不同电极来完成以便排除 检测过程对实际实验的任何干扰电极2电极+探针 (无靶标)互补靶标非互补靶标
荧光27 ±57*未测78士46
Ret [kn]7.97未测6.2
*探针覆盖的电极的荧光强度值，其中以不同电极来完成以便排除 检测过程对实际实验的任何干扰 -
权利要求
1.一种用于检测分析物的方法，其中，所述分析物由与该分析物有关的一个或多个标记物进行标记，所述方法包括a)在经标记的所述分析物上进行光学检测方法以便从所述一个或多个标记物获得光学数据；b)在经标记的所述分析物上进行电学检测方法以便从所述一个或多个标记物获得电学数据；和c)由所述光学数据和电学数据确定所述分析物的身份和/或数量。
2. 如权利要求l所述的方法，其中，所述一个或多个标记物适用于 光学检测和电学检测，并且步骤(a)中的所述一个或多个标记物与步骤(b) 中的所述一个或多个标记物相同。
3. 如权利要求2所述的方法，其中，在步骤(a)之前，所述方法还包括用所述一个或多个标记物来标记所述分析物以形成经标记的所述分析 物的步骤。
4. 如权利要求l所述的方法，其中，步骤(a)中的所述一个或多个标 记物适用于光学检测而步骤(b)中的所述一个或多个标记物适用于电学检 测，并且步骤(a)中的所述一个或多个标记物与步骤(b)中的所述一个或多 个标记物不同。
5. 如权利要求4所述的方法，其中，在步骤(a)之前，所述方法还包 括用步骤(a)中的所述一个或多个标记物和步骤(b)中的所述一个或多个标 记物来同时地或分别地标记所述分析物以形成经标记的所述分析物的步 骤。
6. —种用于检测多个分析物的方法，其中，各个不同的所述分析物 由与该分析物有关的一个或多个不同标记物进行标记，所述方法包括a) 在多个经标记的分析物上进行光学检测方法以便从所述标记物 获得光学数据；b) 在所述多个经标记的分析物上进行电化学检测方法以便从所述 标记物获得电学数据；和C)由所述光学数据和电学数据确定所述多个分析物的身份和/或数量。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述一个或多个标记物适用于光 学检测和电学检测，并且步骤(a)中用于各分析物的所述一个或多个标记 物与步骤(b)中用于各分析物的所述一个或多个标记物相同。
8. 如权利要求7所述的方法，其中，在步骤(a)之前，所述方法还包 括用所述一个或多个标记物来标记所述多个分析物以形成所述多个经标 记的分析物的步骤。
9. 如权利要求6所述的方法，其中，步骤(a)中的所述一个或多个标 记物适用于光学检测而步骤(b)中的所述一个或多个标记物适用于电学检 测，并且步骤 a)中用于各分析物的所述一个或多个标记物与步骤(b)中用 于各分析物的所述一个或多个标记物不同。 '
10. 如权利要求9所述的方法，其中，在步骤(a)之前，所述方法还 包括用步骤(a)中的所述一个或多个标记物和步骤(b)中的所述一个或多个 标记物来同时地或分别地标记所述多个分析物以形成所述多个经标记的 分析物的步骤。
11. 如任一前述权利要求所述的方法，其中，所述标记物选自纳米颗 粒、单分子、化学发光酶和荧光团。
12. 如权利要求11所述的方法，其中，所述标记物是包含一组分子 和/或原子的集合的纳米颗粒。
13. 如权利要求12所述的方法，其中，所述纳米颗粒选自金属、金 属纳米壳、金属二元化合物和量子点。
14. 如权利要求13所述的方法，其中，所述纳米颗粒是选自CdSe、 ZnS、 CdTe、 CdS、 PbS、 PbSe、 Hgl、 ZnTe、 GaAs、 HgS、 CdAs、 CdP、 ZnP、 AgS、 InP、 GaP、 GalnP和InGaN的金属化合物。
15. 如权利要求13所述的方法，其中，所述纳米颗粒选自金、银、 铜、镉、硒、钯和铂。
16. 如权利要求11 15中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒 的直径小于100 nm。
17. 如权利要求16所述的方法，其中，所述纳米颗粒的直径为5nm 50 nm。
18. 如权利要求17所述的方法，其中，所述纳米颗粒的直径为10 nm 30 nm。
19. 如权利要求6 18中任一项所述的方法，其中，用于各个不同分析物的所述一个或多个标记物具有不同的物理性质。
20. 如权利要求19所述的方法，其中，所述物理性质选自尺寸、形 状和表面粗糙度中的一种或多种。
21. 如权利要求6 20中任一项所述的方法，其中，用于各个不同分析物的所述标记物具有不同的组成。
22. 如权利要求6 21中任一项所述的方法，其中，用于各个不同 分析物的所述标记物的类型不同。
23. 如任一前述权利要求所述的方法，其中，所述光学检测方法选 自光发射检测、光吸收检测、光散射检测、光谱位移检测、表面等离子 共振成像和来自吸附染料的表面增强拉曼散射。
24. 如权利要求23所述的方法，其中，所述光学检测方法是光发射 检测，并且包括用能够激发所述标记物的光照射所述经标记的分析物并 检测来自所述标记物的光发射的频率和强度的步骤。
25. 如权利要求24所述的方法，其中，所述光为激光。
26. 如权利要求24或25所述的方法，其中，所述光选自红外光、 可见光和紫外光。
27. 如权利要求26所述的方法，其中，所述光为白光。
28. 如任一前述权利要求所述的方法，其中，所述电学检测方法选 自电阻检测和电化学检测。
29. 如权利要求28所述的方法，其中，所述电学检测方法是电化学 检测方法，并且包括下列步骤 '(i) 将所述经标记的分析物置于包含两个电极的溶液中从而所述一 个或多个标记物溶解到该溶液中；(ii) 在这些电极上施加沉积电位从而所述一个或多个标记物沉积到这些电极中的一个之上；和(iii)检测来自这个电极的电化学信号。
30. 如权利要求29所述的方法，其中，所述沉积电位是-0.1 V 1.0V。
31. 如权利要求30所述的方法，其中，所述电位是叠加在直流电压 上的交流电压。
32. 如权利要求31所述的方法，其中，所述交流电压是叠加在约0.24 V的直流电压上的约10 mV交流电压。
33. 如权利要求29 32中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)还包括 对这些电极施加第二电位以便使沉积的所述标记物发生氧化还原反应的步骤。
34. 如权利要求33所述的方法，其中，所述第二电位为+1.0 V +2.0V。
35. 如权利要求33或34所述的方法，其中，所述氧化还原反应是 沉积的所述标记物的氧化。
36. 如任一前述权利要求所述的方法，其中，所述分析物包含二种 或多种选自细胞、蛋白、多肽、肽、肽片段、氨基酸、DNA和RNA的 化合物。
37. 如权利要求5或权利要求10 36中任一项所述的方法，其中， 所述分析物是DNA或RNA，并且所述用步骤(a)中的所述一个或多个标 记物和步骤(b)中的所述一个或多个标记物来标记一个或多个分析物的步 骤包括下列步骤i，将引物与所述DNA或RNA结合，其中，所述引物由适用于步骤 (b)中的电学检测的一个或多个标记物进行标记；和ii.用核苷来酶促延伸所述引物，其中， 一个或多个所述核苷由适用 于步骤(a)中的光学检测的一个或多个标记物进行标记。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测分析物的方法，其中，所述分析物由与该分析物有关的一个或多个标记物进行标记，所述方法包括a)在经标记的所述分析物上进行光学检测方法以便从所述一个或多个标记物获得光学数据；b)在经标记的所述分析物上进行电学检测方法以便从所述一个或多个标记物获得电学数据；和c)由所述光学数据和电学数据确定所述分析物的身份和/或数量。本发明还提供了一种用于检测多个分析物的方法，其中，各个不同的所述分析物由与该分析物有关的一个或多个不同标记物进行标记，所述方法包括a)在多个经标记的分析物上进行光学检测方法以便从所述标记物获得光学数据；b)在所述多个经标记的分析物上进行电化学检测方法以便从所述标记物获得电学数据；和c)由所述光学数据和电学数据确定所述多个分析物的身份和/或数量。
文档编号C12Q1/68GK101600807SQ200880002780
公开日2009年12月9日 申请日期2008年1月25日 优先权日2007年1月25日
发明者安德鲁·芒特, 彼得·迦扎尔, 科林·坎贝尔, 约翰·贝蒂, 蒂尔·巴赫曼 申请人:Iti苏格兰有限公司