诊断、分类和治疗子宫内膜癌和初癌的方法

专利名称：诊断、分类和治疗子宫内膜癌和初癌的方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断、分类和治疗子宫内膜癌的方法和试剂盒。
背景技术：
子宫内膜癌为美国女性生殖道最常见的诊断出的恶性肿瘤。据估计在2007年在 美国将诊断出39，080例新子宫体(uterine corpus)癌，并且7，400名妇女将死于该疾病 (Jemal A, Siegel R, Ward Ε, MurrayT, Xu J, Thun MJ. CA Cancer J Clin 2007 Jan-Feb ； 57(1) :43-66)。大多数患有子宫内膜癌的妇女用子宫切除术外科手术治疗；然而，约15% 的妇女证明宿存或复发的肿瘤对于目前的化疗难以治愈。对于这些患有晚期、进展性或复 发性疾病的妇女，存活率差，这是因为没有证明有效的辅助治疗。复发后的平均存活时间为 10 个月(Jereczek-FossaB, Badzio A, Jassem J. , Int J Gynecol Cancer 1999Jul ；9 (4) 285-94)，对于已经复发的病人而言5年存活率仅为13% (Creutzberg CL, van Putten WL, Koper PC，等，Lancet 2000 Apr22 ；355 (9213) :1404_11)。恶性肿瘤通常在多个癌基因和肿瘤抑制基因上显示突变，在数以百计的基因的表 达方面展示改变，并且包含各种染色体异常。尽管该基因组复杂性，靶向特异性分子异常 已经显示产生人类肿瘤的快速消退，如使用选择性酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Imatinib) (Gleevec)和吉非替尼(Gefitinib) (Iressa)所示。为了解释该现象，Bernardffeinstein 引入术语"癌基因依赖(oncogene addiction)"。他提出肿瘤细胞的信号传导线路在癌 基因活性的存在下被重新编程，以致于肿瘤细胞就细胞存活和生长依赖于该癌基因活性 (ffeinstein IB. Science 2002 Jul 5 ；297 (5578) :63_4)。实际上，实验和临床数据支持癌 基因依赖的这一概念，并且此外还暗示癌基因活性的多种机制，包括突变、重排、过度表达， 可以参予癌基因依赖(Weinstein IB，JoeAK.，Nat Clin Pract Oncol 2006 Aug ；3 (8) 448-57)。在子宫内膜癌方面已经报道了各种体细胞基因缺陷。良好或中等分化的子宫 内膜样子宫内膜癌占子宫癌的约80%。它们的特征在于在以下方面高频率的失活突变 PTEN (26-80 %)、激活KRAS2突变(13-26%)和功能获得性β-联蛋白突变(25-38%) (Hecht JL,Mutter GL. ,JClin Oncol 2006 Oct 10 ；24(29) :4783_91，Shiozawa T,KonishiI.，. Int J Clin Oncol 2006 Feb ；11(1) :13_21)。在各种颅缝早闭综合症和软骨发育异 常综合症上已经报道了在FGFR1，2和3上的生殖细胞系功能获得性突变。在这些疾病中的 基因型/表型的关系是复杂的，具有超过14种不同的临床综合症与这三种受体之一的突变 相关，以及几种临床综合症，例如单核白细胞增多(Pfeiffer)和颅面骨发育不全综合症与 f 同;(Crouzon Syndrome) (Passos-Bueno MR, Wilcox WR, Jabs Eff, Sertie AL, Alonso LG and Kitoh H. (1999)，Hum Mutat 14 :115_125，Wilkie AO, Patey SJ, Kan SH, van denOuweland AM and Hamel BC. (2002)，Am J Med Genet 112 :266_278.)。虽然在理解癌症的生物学基础及在其诊断和治疗方面已经取得许多进展，在美国 其仍然是死亡的主要原因之一。在其它因素中，在诊断和治疗癌症上的固有困难包括许 多不同癌亚型的存在，合适的治疗策略的相从变动(concomitant variation)以最大化有 利的患者预后(outcome)的可能性。此外，在疾病进展上存在各种子宫内膜癌亚型和变化。 为了合适地治疗子宫内膜癌以及为了最大化成功治疗的机会，尽可能早地鉴定出子宫内膜 癌的种类或亚型是重要的。因此，目前存在检测和分类子宫内膜癌的方法的需求，以选择合适的和最优治疗 方案。一旦被检测和分类，还存在基于子宫内膜癌的类型治疗子宫内膜癌的改进的方法的 需求，以最大化成功治疗或抑制受试者中疾病复发的机会。

发明内容
本发明提供诊断、分类和治疗子宫内膜癌的方法。通过鉴定成纤维细胞生长因子 受体2(FGFR2)激活突变和并将其与子宫内膜癌相关联，本文本发明人提供用于诊断、分类 和治疗受试者中的子宫内膜癌的有用工具。在一种实施方式中，本发明为检测和诊断受试者、优选人类受试者中的子宫内膜 癌或初癌的方法。该方法优选包括在包含子宫内膜细胞的生物样品中检测FGFR2中的受体 突变，其中所述突变与FGFR2受体激活相关。在FGFR2中的一个或多个激活突变的存在为 受试者中子宫内膜癌或初癌的症状。该激活突变为错义突变、缺失、插入，或同时缺失和插 入，并且经常导致增强的配体结合、异位配体结合(promiscuousligand binding)(例如允 许受体被不能与野生型受体正常结合的配体结合和激活)、组成性受体二聚化、导致信号传 导增加的受损的受体再循环、延迟降解、过度表达或激酶活化。在优选的实施方式中，FGFR2 为组成性活性突变体，其可能仍然需要配体刺激以用于最优化信号传导。优选地，检测步骤包括在基因组DNA、RNA或cDNA中的至少一种核酸就至少一个核 苷酸FGFR2突变筛选生物样品。在特定实施方式中，激活突变导致FGFR2中的至少一个氨 基酸取代。在优选的实施方式中，FGFR2激活突变包括选自以下至少一种的突变在免疫球 蛋白样(Ig)结构域II和III之间的连接处的突变(例如，在252位S突变为W，F或L ；在 253位P突变为R ；在263位P突变为L ；在267位S突变为P，所有突变均为SEQ ID NOS 2 或3的)；在Ig III结构域中的突变(例如，在276位F突变为V ；在278处C突变为Y或 F ；在281位Y突变为C ；在288位I突变为S ；在289位Q突变为P ；在290位Y突变为C， G.或R ；在292位K突变为E ；在310位K突变为R ；在315位A突变为T ；在321位D突变 为A ；在328位Y突变为C ；所有突变均为SEQ ID N0S2或3的)；在Ig III结构域和跨膜(TM)结构域之间的连接处的突变(例如，在354或353位S突变为C或T ；在359或358位 V突变为F ；在362或361位A突变为S ；在372或371位S突变为C ；在375或374位Y突 变为C ；在373或372位S突变为C ；在376或375位Y突变为C ；所有均分别为SEQ ID NOS 2或3的)；TM结构域的突变(例如，在380或379位G突变为R ；在383或382位C突变为 R ；在384或383位G突变为R ；在392或391位M突变为R ；所有突变均分别为SEQ ID NOS 2或3的)；在TM结构域和酪氨酸激酶结构域I之间的连接处的突变(例如，IVS10+2A > C 剪接突变)；在酪氨酸激酶结构域I中的突变(例如，在538或537位I突变为V ；在540位 N突变为K ；在548或547位I突变为V ；在549或548位N突变为H ；在550或549位N突 变为K;在565或564位E突变为G ；所有突变均分别为SEQ ID NOS 2或3的)；在酪氨酸激 酶结构域II中的突变(例如，在641或640位K突变为R ；在650或649位K突变为E ；在 659或658位K突变为N ；在660或659位K突变为E ；在663或662位G突变为E ；在678 或677位R突变为G ；所有突变均分别为SEQ IDNOS 2或3的；由SEQ ID NO :1的2290-91 位处的核苷酸C和T的缺失引起的阅读框移位突变)。Ig III结构域优选激活突变的其它实例包括，例如在331位N突变为I ；在337位A 突变为P ；在338位G突变为P或R ；在340位Y突变为C或H ；在341位T突变为P ；在342 位C突变为F，G，R，S，W或Y ；在344位A突变为G或P ；在347位S突变为C ；在351位S 突变为C ；上述突变都为SEQ IDNO :2的；还包括在SEQ ID NO :3中的相应突变(equivalent mutation)。重要的是注意在生物样品中可以检测出超过一个FGFR2激活突变，例如在特定实 施方式中检测出至少两个FGFR2受体激活突变。检测的子宫内膜癌可为任何亚型，例如浆液性、粘液性和子宫内膜样组织亚型；然 而，在优选的实施方式中，检测的癌为子宫内膜样组织亚型。此外，本发明提供诊断或分类受试者中子宫内膜癌的方法，其包括评估测试受试 者中FGFR2信号转导通路的活性水平，并将其与对照受试者中的活性水平比较，其中与对 照受试者相比测试受试者中FGFR2通路的活性增加表示子宫内膜癌。该通路的活性水平可 以例如通过评估FGFR2蛋白的表达或活性水平的增加来评估。作为选择，该表达或活性水 平可以例如通过确定编码FGFR2、优选导致受体激活的突变FGFR2的mRNA的量来评估。例 如，在一种实施方式中，子宫内膜癌与由于基因组扩增导致的FGFR2的过度表达相关，并且 该检验被特异设计成检测FGFR2的过度表达。本发明还涉及用于诊断或分类子宫内膜癌的试剂盒，包括与FGFR2基因的突变位 点特异性杂交或相邻的寡核苷酸，该FGFR2基因的突变导致被该基因编码的FGFR2蛋白的 活性增加，以及用于诊断子宫内膜癌的说明书。突变位点可以例如包括选自以下的核苷酸 SEQ ID NO 1 的 755,929,943,1118，1147，1642，1650，1978 和 2290-91 位核苷酸，以及 SEQ ID NO 7的相应核苷酸(equivalent nucleotide)。在优选的实施方式中，该试剂盒包括至 少一种包含突变位点的探针。本发明进一步涉及用于诊断或分类子宫内膜癌的试剂盒，包括特异性识别FGFR2 蛋白中的突变的抗体，以及使用说明书。任选地，与未突变FGFR2蛋白，例如SEQ ID NOS 2和3的蛋白相比，该突变导致活性增加。优选地，所述抗体针对选自以下的特异性FGFR2 蛋白突变在免疫球蛋白样(Ig)结构域II和III之间的连接处的突变；在Ig III结构域中的突变；在Ig III结构域和跨膜(TM)结构域之间的连接处的突变；在TM结构域中的突 变；在TM结构域和酪氨酸激酶结构域I之间的连接处的突变；在酪氨酸激酶结构域I中的 突变；或在酪氨酸激酶结构域II中的突变。更优选所述抗体针对选自以下的突变(a)在 SEQ IDNOS 2 (NP_075259. 2)或 3 (NP_000132. 1)的 252 位 S 突变为 W ； (b)在 SEQ ID NOS 2或3的310位K突变为R ； (c)在SEQ ID NOS :2或3的315位A突变为T ； (d)在SEQ ID NO :2 的 373 位或 SEQ ID NO 3 的 372 位 S 突变为 C ； (e)在 SEQ ID NO 2 的 376 位或 SEQ ID NO 3 的 375 位 Y 突变为 C ； (f)在 SEQ ID NO 2 的 383 位或 SEQ ID NO 3 的 382 位 C 突 变为 R ； (g)在 SEQ ID NO 2 的 392 位或 SEQ ID NO 3 的 391 位 M 突变为 R ； (h)在 SEQID NO 2 的 548 位或 SEQ ID NO 3 的 547 位 I 突变为 V ； (i)在 SEQ ID NO 2 的 550 位或 SEQ ID NO 3 的 549 位 N 突变为 K ；或(j)在 SEQ ID NO 2 的 660 位或 SEQ ID NO 3 的 659 位 K突变为E。本发明还提供治疗受试者中子宫内膜癌或初癌的方法。优选该受试者为感染有 子宫内膜癌(例如，浆液性、粘液性和子宫内膜样组织亚型)的人类。该方法优选包括与 药学上可接受的载体一起施用有效量的FGFR2抑制剂给患有特征在于FGFR2激活的子宫 内膜癌或初癌的受试者，所述FGFR2激活例如以配体非依赖或配体依赖方式组成性激活的 FGFR2突变形式，其中所述FGFR2抑制剂抑制FGFR2的表达或活性，由此有效地抑制受试者 中子宫内膜癌的生长或增殖。FGFR2抑制剂优选诱导子宫内膜癌细胞的细胞周期阻滞和 /或细胞凋亡。在一种实施方式中，FGFR2抑制剂在子宫内膜癌的外科治疗后施用给受试 者，以抑制手术后子宫内膜癌的复发。在另一实施方式中，所述抑制剂施用给患有宿存性 (persistent)或复发性子宫内膜癌同时不受手术切除的影响的患者。使用的FGFR2抑制剂可以抑制FGFR2基因或FGFR2表达产物的表达。在一种实 施方式中该试剂为FGFR2反义核酸，优选与SEQ ID NO :1的片段杂交的反义核酸，所述SEQ ID NO 1包括至少一个选自以下的取代在929位A被G取代；在1650位T被G取代；在 943位G被A取代；在755位C被G取代；在1650位T被A或G取代；在1127位A被G取 代；在1175位C被G取代；在1642位A被G取代；在1978位A被G取代；在内含子IOA > C+2 ；或在2290-91位CT的缺失，以及SEQ ID NO 7的相应取代。在另一实施方式中，FGFR2抑制剂通过阻断FGFR2结构域来抑制FGFR2活性。例 如，FGFR2抑制剂为针对以下的抗FGFR2抑制剂抗体FGFR2的在免疫球蛋白样(Ig)结构 域II和III之间的连接子区域；FGFR2的Ig III结构域；FGFR2的在Ig III结构域和跨膜 (TM)结构域之间的连接处；TM结构域；FGFR2的在TM结构域和酪氨酸激酶结构域I之间的 连接处；FGFR2的酪氨酸激酶结构域I，或FGFR2的酪氨酸激酶结构域II。例如，在一种实施 方式中，FGFR2抑制剂干扰FGFR2折叠、FGFR2的三维结构、配体结合或底物结合，例如ATP。优选的实例包括特异性识别包括选自以下突变的FGFR2氨基酸序列的抗体(a) 在 SEQ ID NOS 2 (NP_075259. 2)或 3 (NP_000132. 1)的 252 位 S 突变为 W ； (b)在 SEQ ID NOS :2或3的310位K突变为R ； (c)在SEQ ID NOS :2或3的315位A突变为T ； (d)在SEQ ID NO 2 的 373 位或 SEQID NO :3 的 372 位 S 突变为 C ； (e)在 SEQ ID NO 2 的 376 位或 SEQ ID NO 3 的 375 位 Y 突变为 C ； (f)在 SEQ ID NO 2 的 383 位或 SEQ ID NO 3 的 382 位 C 突 变为 R ； (g)在 SEQ ID NO 2 的 392 位或 SEQ ID NO 3 的 391 位 M 突变为 R ； (h)在 SEQ ID NO 2 的 548 位或 SEQ ID NO 3 的 547 位 I 突变为 V ； (i)在 SEQ ID NO 2 的 550 位或 SEQID NO 3 的 549 位 N 突变为 K ；或(j)在 SEQ ID NO 2 的 660 位或 SEQ ID NO 3 的 659 位 K突变为E。在优选的实施方式中，所述抗体针对在SEQ ID NOS :2或3的252位S至W的突 变。在另一优选实施方式中所述抗体为人源化抗体，并优选为单克隆抗体。在作为选择的实施方式中，FGFR2抑制剂为小抑制RNA(smallinhibitory RNA) (siRNA)、小发夹RNA (shRNA)、微RNA(miRNA)、或核酶。在优选的实施方式中FGFR2抑制剂为 shRNA，优选靶向FGFR2的外显子2 (SEQ ID NO 4)和/或FGFR2的外显子15的shRNA (SEQ ID NO :5)。在另一特定的非限制性实施方式中，FGFR2抑制剂为PD173074。本发明还提供分类子宫内膜癌的方法。该方法允许用户合适的分类子宫内膜癌的 类型，以使基于受试者具有的子宫内膜癌的类型使用特定和合适的治疗。该方法包括筛选 子宫内膜癌细胞中的FGFR2突变；当在子宫内膜癌细胞中发现FGFR2激活突变时，将子宫 内膜癌的类型分类为FGFR2激活诱导的子宫内膜癌。优选地，FGFR2激活突变为如上鉴定 的FGFR2突变的一种或多种。在特定实施方式中，该方法还包括确定FGFR2突变是否诱导 TOFR2激活。


图 IA-E 显示 ANC3A 和 MFE296 细胞中 shRNA 介导的 FGFR2 的击倒(knockdown)，导 致子宫内膜细胞的细胞死亡。图IA和IB显示FGFR2shRNA对子宫内膜癌细胞的细胞增殖 的影响。AN3CA(图1A)或MFE296(图1B)细胞用空载体，未沉默的，或两个独立的靶向两 个不同的FGFR2的外显子(X2或XI5)的FGFR2 shRNA构建体来转导，使用SRB检测评估对 细胞增殖的影响。使用FGFR2 shRNA的治疗抑制两个细胞系的增殖。未沉默的对照shRNA 对细胞增殖没有效果。图IC FGFR2击倒对ERK1/2和AKT的激活的影响。shRNA转导后， AN3CA细胞在0. 2% FBS中血清饥饿培养18小时，或保持在包含10% FBS的完全生长培养 基中。收集裂解产物并通过Western印迹分析ERK1/2和AKT的FGFR2表达和激活。FGFR2 的击倒导致在0. 2%和10% FBS中ERK1/2激活降低，在10% FBS中AKT磷酸化中等降低， 在0. 2% FBS中对AKT激活没有影响。图ID :FGFR2击倒后的细胞死亡。AN3CA细胞用未沉 默的siRNA(NS)对照或FGFR2 siRNAX2使用Lipofectamine 2000转染试剂来转染。转染 后48小时，收集细胞，用500ng/mL膜联蛋白V-FITC和1 μ g/mL碘化丙啶染色，并通过流式 细胞仪就膜联蛋白-FITC阳性细胞进行分析。FGFR2的击倒导致膜联蛋白V阳性细胞的增 加，指示细胞凋亡。通过western印迹分析来分析30 μ g的全蛋白裂解产物来确认FGFR2 击倒。该击倒使用siRNA而不是shRNA构建体来实现，这是因为后者还表达GFP，其与FITC 具有重叠的发射光谱。图IE显示子宫内膜癌细胞系中的PTEN表达。收集子宫内膜癌细胞 裂解产物并通过Western印迹分析就PTEN表达进行评价。图2A-B表达激活的FGFR2的子宫内膜癌细胞对PD173074，一种全TOFR抑制剂 (pan-FGFR inhibitor)敏感。六种子宫内膜癌细胞系的剂量效应曲线。添加PD173074后 72小时用SRB检测测定细胞的活力。AN3CA和MFE296细胞携带N550K FGFR2突变。HEClA, Ishikawa, KLE和RL952对于FGFR2为野生型。与表达野生型FGFR2的细胞系相比，PD173074 对表达突变体FGFR2的细胞系的细胞活力具有深刻的负效应。PD173074IC50值AN3CA = 61. 7nM ；MFE296 = 284. 3nM ；HEClA > 3000nM ；Ishikawa = 2920. 7nM ；KLE > IOOOnM ；RL952> ΙΟΟΟηΜ。图2B显示PD173074处理后PLCg的激活状态。细胞在0. 2% FBS中血清饥饿培养18小时，然后用增加浓度的PD173074处理3小 时。收集裂解产物并通过Western印迹分析就PLCg的激活评价。图2C显示不存在FGF2 时的细胞增殖和应答于FGF2的细胞增殖。组成性活性FGFR2激酶结构域突变N550K导致 在不存在(-FGF2)和存在(+FGF2)外源FGF2配体时增殖比通过野生型受体(WT)诱导的增 殖都增加。这些数据暗示当N550K被组成性激活时，其还需要配体以全活性。图3A-B 通过PD173074的FGFR2抑制在具有激活的FGFR2的子宫内膜癌细胞中诱 导细胞死亡和细胞周期阻滞。(图3A)膜联蛋白染色揭示用全FGFR抑制剂，PD173074处理 后AN3CA细胞的细胞死亡。以2. 5x10s细胞/孔的密度铺平板的AN3CA细胞用DMSO (溶剂 对照(vehiclecontrol))或 ΙμΜ PD173074 处理。48，72 或 96 小时后，收集细胞，用 500ng/ mL膜联蛋白-FITC和lug/mL碘化丙啶染色，一式三份地就膜联蛋白(armexin)阳性细胞 通过流式细胞仪分析。PD 173074处理的细胞显示与单独用DMSO处理的细胞相比，膜联蛋 白-V染色增加，指示细胞凋亡。(图3B)PD173074导致AN3CA细胞中Gl细胞周期阻滞。将 细胞在6孔平板上一式三份地铺平板，用1 μ M PD173074处理。添加PD 173074后72小时 通过碘化丙啶染色和流式细胞仪测定细胞周期。图4.用增加浓度的PD173074处理后关键信号传导分子的激活状态。细胞用在 10% FBS中增加浓度的PD173074处理3小时。收集裂解产物并通过Western印迹分析就 ERK1/2, AKT, STAT3和p38的激活进行评价。PD173074处理导致ERK1/2激活的抑制、AKT 磷酸化的中等抑制，但对AN3CA和MFE296细胞中的STAT3或p38激活没有影响。PD173074 对HEClA细胞中的ERK1/2，AKT, STAT3或p38激活没有影响。图5A-B. PD173074处理后随时间关键信号传导分子的激活状态。(图5A)用在 10% FBS中的ΙμΜ PD173074处理细胞0至72小时的指定时间。收集裂解产物并通过 Western印迹分析就ERK1/2，AKT，STAT3和p38的激活进行评价。PD173074处理导致ERK1/2 激活的抑制以及AKT磷酸化的部分抑制，但对AN3CA和MFE296细胞中的STAT3或p38激活 没有影响。PD173074对HEClA细胞中的ERKl/2，AKT，STAT3/5或ρ 38激活没有影响。(图 5B)细胞在0. 2% FBS中饥饿培养过夜，然后用在0. 2% FBS中的ΙμΜ PD173074处理0至 72小时的指定时间。收集裂解产物并通过Western印迹分析就ERK1/2，AKT, STAT3和p38 的激活进行评价。PD173074处理导致在AN3CA和MFE296细胞中ERK1/2激活的抑制以及 AKT磷酸化的中等抑制。PD173074对HEClA细胞中的ERK1/2或AKT激活没有影响。图6为FGFR2突变的示意性表示。将FGFR2突变映射到(mapped to)功能性结构 域。在原发性子宫内膜癌和细胞系中鉴定出的体细胞突变在上述蛋白的示意性表示上呈现 并相对于FGFR2b(SEQ ID NO 2 ；NP_075259. 2)编号。生殖细胞系突变与各种颅缝早闭综合 症相关并相对于FGFR2c(SEQ ID NO 3 NP_000132. 1)编号。虽然之前在生殖细胞系中未报 道，四个体细胞FGFR2子宫内膜突变，在骨骼软骨发育不良中具有与报道的FGFR3C中的平 行位置(paralogous position)中相同的错义变化(用**表示)。新的突变用下划线表 示。aIVS10+2A>C突变可能导致与+VT剪接型成比例的相对增加。bFS是指2290-91 CT 的2bp缺失，导致移码和未成熟切断(premature truncation)。
具体实施例方式现在将参考本发明的优选实施方式来描述本发明，以仅用于示例性地说明本发 明。本领域技术人员将理解可以根据例示的实施方式进行许多改进或变化而不背离本发明 的意图和范围。本发明部分基于以下发现诱导受体激活的FGFR2受体中的突变可以用于有效地 检测和分类受试者中的子宫内膜癌或初癌。本发明还基于以下发现FGFR2基因或其表达 产物的抑制在治疗子宫内膜癌上是有效的。如本文所用，术语"子宫内膜癌"包括该疾病的所有形式和亚型，包括，例如浆液 性、粘液性和子宫内膜样组织亚型。子宫内膜癌为起始于子宫内膜，子宫(子宫(womb))的 内膜的癌症。在本发明上下文中，FGFR2基因包括优选为人源的基因，其为SEQID N0S:1，7所示 的编码核酸序列，或包括等位基因变异体和直系同源物的同源物。FGFR2蛋白包括同样优 选为人源的蛋白，其具有SEQ IDNOS :2或3所示的氨基酸序列，或包括其直系同源物的同源 物。图6显示FGFR2蛋白的FGFR2结构域的功能性结构域，以及与功能性结构域相关映射 的FGFR2突变。FGFR2属于由四种不同基因编码的结构相关的酪氨酸激酶受体家族(FGFRs 1-4) 0 FGFR2为由三个细胞外免疫球蛋白样(Ig)结构域、跨膜结构域、断裂酪氨酸激酶结构域 (split tyrosine kinase domain)组成的糖蛋白。Ig III结构域中的替代剪接为在FGF/ FGFR结合和信号传导中的冗余(redimdany)和特异性二者的模式的主要决定因子。该剪接 事件为组织特异的，并且产生拥有独特配体特异性的FGFR1-FGFR3的IIIb和IIIc受体同 工型(Mohammadi M, Olsen SK and Ibrahimi OA. (2005)，Cytokine Growth Factor Rev 16 107-137, Ornitz DM andltoh N. (2001). Genome Biol 2 =REVIEffS 3005)。对于 FGFR2，上皮细 胞谱系的细胞仅表达由内含子8编码的〃 IIIb"同工型(FGFR2b ；SEQID NO 2 ；NP_07529. 2)， 而间充质衍生的细胞仅表达利用内含子9的〃 IIIc"同工型(FGFR2c ;SEQ ID NO 3 ； NP_000132. 1)(Scotet E andHoussaint Ε. (1995). Biochim Biophys Acta 1264:238—242)。 FGFR2b同工型主要结合FGFl，FGF3, FGF7和FGF10，而FGFR2c不结合FGF7和FGF10，但是高 亲合性地结合 FGFl, FGF2, FGF4, FGF6 和 FGF8 (Ibrahimi OA, Zhang F, Eliseenkova AV, Itoh N, Linhardt RJand Mohammadi Μ. (2004)，Hum Mol Genet 13 2313-2324)。在测试受试者或生物样品中FGFR2的"增加的活性"或"激活突变"与对照相 比在测试受试者或生物样品中更高的总FGFR2活性，所述对照例如健康受试者或标准样 品。优选地，尽管不必须，活性在测试受试者或生物样品中比在对照中高至少10%，更优选 至少50%，还更优选至少100%，仍更优选至少150%。增加的活性，可以例如由增加的基 础FGFR2活性、延长的刺激、延迟的降解或过度表达引起，例如由于增强的配体结合、错杂 的(promiscuous)或不合适的配体结合、组成性受体二聚化、受损的再循环，导致信号传导 的增加、延迟的降解或激酶激活。FGFR2的更高表达水平可由例如在FGFR2基因的非编码区中的突变或在参予 FGFR2转录或翻译的编码或非编码基因中的突变引起。FGFR2的表达水平可以由例如以下 来确定通过比较测 受试者和对照，例如通过比较肿瘤和正常子宫内膜(例如正常相邻 的子宫内膜样品)的FGFR2mRNA或FGFR2蛋白水平。
“功能保守变异体”为蛋白或酶中的给定氨基酸残基已经变化但没有改变多肽 的总体构象和功能的那些，包括但不限于，氨基酸被具有类似性质(例如，极性、氢键能 (hydrogen bonding potential)，酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸取代。具有类似 性质的氨基酸在本领域是已知的。例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸为亲水性碱性氨基酸，可以 互换。类似地，为疏水性氨基酸的异亮氨酸，可以被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸取代。预期 此类变化对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点几乎没有或没有影响。在蛋白质或酶中除了称为保守的那些氨基酸之外的氨基酸可以不同，从而类似功 能的任何两种蛋白质之间的蛋白或氨基酸序列相似性百分比可以变化，并且可以为，例如 从70%至99%，按照比对方案例如通过聚类法(Cluster Method)来确定，其中相似性基于 MEGALIGN算法。“变异体〃还包括通过BLAST或FASTA算法确定的具有至少60%氨基酸 同一性，优选至少75%、最优选至少85%、还更优选至少90%、仍更优选至少95%的多肽或 酶，并且与要比较的天然或亲本蛋白或酶具有相同或基本上类似的性质或功能。特别的变 异体为“功能获得性”变异体，其是指其中蛋白质或酶中至少一个给定氨基酸残基改变的多 肽变异体，该改变提高了多肽的特定功能，包括但不限于蛋白质活性。氨基酸残基的改变可 以用具有类似性质的氨基酸取代氨基酸。如本文所用，术语"同源"和"相似"是指拥有"相同进化起源"的蛋白质之间 的关系，包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白和来自不同物种的同源蛋白。 此类蛋白(及其编码基因)具有如其序列相似性所反映的序列同源性，无论根据百分比相 似性或作为保守位置的特定残基或基序的存在。在特定的实施方式中，当在DNA序列的规定长度上按照序列比对算法，例如 BLAST，FASTA，DNA Strider等确定的至少约80%、最优选至少约90%或至少95%的核苷酸 匹配时，两种DNA序列为“基本上同源或相似”。术语"突变体或突变"是指在例如DNA的遗传物质或任何处理机制上任何可检 测的变化，或此类变化的结果。当与对照材料比较时，此类变化可称为“异常”。这包括基因 突变，其中结构(例如基因的DNA序列改变，由任何突变过程产生的任何基因或DNA，以及由 改性基因或DNA序列表达的任何表达产物(例如，蛋白质)。术语"变异体"还可用于表示 改性或变化的基因、DNA序列、酶、细胞等，S卩，任何种类的突变体。如本文所用，“序列特异性寡核苷酸"是指相关的寡核苷酸组，其可用于检测 FGFR2基因中特定的变异或突变，优选FGFR2激活突变。“探针”是指核酸或寡核苷酸，由于探针中的至少一个序列与受试者的靶蛋白中的 序列的互补性导致其与靶区域中的序列形成杂交结构。本发明提供可用于抑制FGFR2表达的反义核酸(包括核酶)。“反义核酸" 优选为单链核酸分子，其当在细胞质条件下与RNA或DNA分子中的互补碱基杂交时， 抑制后者的作用。如果RNA为信使RNA转录产物(transcript)，反义核酸为反转录物 (countertranscript)或mRNA干扰互补核酸。如目前所用，“反义〃广泛地包括RNA-RNA 相互作用、RNA-DNA相互作用、核酶、RNA-诱导的沉默配合物以及RNASe-H介导的阻滞。反 义核酸分子可由用于在细胞中表达的重组基因编码(例如，美国专利No. 5，814，500 ；美国 专利No. 5，811，234)，或作为选择它们可以合成地制备(例如，美国专利No. 5，780，607)。合 成的寡核苷酸适合用作反义用途。
诊断方法根据本发明，可以检测诱导受体激活的FGFR2受体的突变，包括过度表达和延迟 降解，来诊断或分类受试者中的子宫内膜癌或初癌。如本文所用，“受试者"为可能发展子宫内膜癌的人类或非人类哺乳动物，例如， 灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类。在所有实施方式中优选人类受试者。优选 地受试者为怀疑患有子宫内膜癌、已经诊断患有子宫内膜癌、或具有子宫内膜癌的家族史 的人类。用于鉴定怀疑患有子宫内膜癌的受试者的方法可以包括物理检查、受试者的家族 病史、受试者的病史、子宫内膜活组织检查、或许多成像技术例如超声波成像、计算断层照 相法、磁共振成像、磁共振光谱分析或正电子发射断层显像。用于子宫内膜癌的诊断方法和 子宫内膜癌的临床描绘对医疗领域的技术人员而言是已知的。因此，诊断方法可以包括例如，检测FGFR2基因中的突变，其中所述突变导致增加 的FGFR2受体活性。FGFR2突变可以尤其影响FGFR2基因的编码区域，例如，在FGFR2基因 的IgII或Ig III结构域中的突变。所述突变可为错义突变，优选导致核酸取代或缺失或 二者组合的错义突变。优选地，所述突变导致一个，以及有时多个氨基酸取代或缺失，例如 参见以下表2。本发明的诊断方法还包括检测FGFR2蛋白中的突变，特别是导致FGFR2蛋白的活 性增加的突变。优选地突变为选自以下组的FGFR2中的至少一种突变在免疫球蛋白样 (Ig)结构域II和III之间的连接处的突变；在Ig III结构域中的突变；在Ig III结构域 和跨膜(TM)结构域之间的连接处的突变；在TM结构域中的突变；在TM结构域和酪氨酸激 酶结构域I之间的连接处的突变；在酪氨酸激酶结构域I中的突变；或在酪氨酸激酶结构 域II中的突变。更优选突变诱导FGFR2中的氨基酸取代，例如SEQ ID NOS :2或3的252 位S突变为W ；或SEQ ID NO 2的550位或SEQ ID NO 3的549位N突变为K。在另一实施 方式中，FGFR2中的氨基酸取代为SEQ ID NOS :2或3的310位K突变为R ；或SEQ ID NO 2的392位或SEQ ID NO :3的391位M突变为R。在一非限制性实施方式中，突变由以下 组成:SEQ ID NO :1 (NM-02297. 2)的 2290-91 位的核苷酸 C 和 T 的缺失；SEQ ID NO :7 ；或 IVS10+2A > C剪接突变。典型地，检测出的FGFR2受体激活突变通过例如以下增加受体的激活增强配体 结合、改变的(错杂的)配体亲和性、组成性受体二聚化、延迟的降解、来自细胞膜的受损的 再循环、过度表达、或激酶激活，从而激活FGFR2受体。如本文所用，术语"诊断"是指在任何发展阶段的疾病的鉴定，还包括确定受试 者发展该疾病或复发的倾向(predisposition)。本发明还提供确认和分类子宫内膜癌的类 型的方法。术语"生物样品"是指从其可以获得DNA的任何细胞来源。优选地，生物样品获 自子宫区域或其附近，以确保作为子宫内衬的子宫内膜细胞存在于生物样品中。在一种实 施方式中，生物样品以血液的形式，例如来自月经或绝经后测定位点的子宫血液。在另一实施方式中，受试者中子宫内膜癌的诊断包括评估在测试受试者子宫内膜 细胞中的FGFR2蛋白的表达、延迟降解或活性的水平，并将其与对照受试者中的表达或活 性的水平相比较，其中与对照受试者相比，测试受试者中FGFR2蛋白的表达和/或活性增加 表示子宫内膜癌或初癌。
FGFR2的表达或延迟降解水平可以通过确定编码生物样品中FGFR2蛋白的mRNA 的量，或通过确定生物样品中FGFR2蛋白的浓度来评估。FGFR2活性的水平可以通过确定 FGFR2信号传导通路信号传导通量中的活性水平，例如通过如本文所述测定样品或受试者 中FGFR2活性来评估。基于核酸的检验根据本发明，FGFR2核酸，即以FGFR2 DNA或以其转录产物的突变形式，以及FGFR2 的失控表达(deregulated expression)，例如过度表达，或FGFR2通路的其它组分可以通 过各种合适的方法检测。可以使用用于分析和测序生物样品中包含的核酸以及用于诊断遗传异常的标准 方法，并且用于基因型分析的许多策略对本领域技术人员而言是已知的。在优选的实施方式中，FGFR2基因中突变的确定包括使用核酸序列例如特异性寡 核苷酸，来检测生物样品中FGFR2基因组DNA或mRNA的突变。此类寡核苷酸可以特异性地 与FGFR2核酸中存在的突变位点，或与该突变位点相邻的区域杂交。还可以使用允许扩增 FGFR2全部或部分的引物。作为选择，或与此技术组合，本文描述的或本领域技术人员已知 的的寡核苷酸测序可以用于检测FGFR2突变。本领域技术人员可以使用固相法使用溶液和实施方式中的杂交探针。在包括固相 法的实施方式中，测试核酸被吸收，或否则被固定在所选的基质或表面上。固定的单链核酸 然后与所选探针进行特异性杂交。在另一实施方式中，本领域技术人员可以使用扩增技术、例如PCR或反向PCR(" 反向聚合链反应")中的寡核苷酸探针，来分别特异性地扩增可能存在于生物样品中的靶 DNA 或 mRNA。可用的寡核苷酸包括允许扩增FGFR2外显子的引物。本发明更特别涉及在体外诊断子宫内膜癌或初癌的方法，包括以下步骤a)使包含DNA的生物样品与允许扩增FGFR2基因全部或部分的特异性寡核苷酸， 在允许所述探针与包含于生物样品中的DNA杂交的条件下接触，在生物样品中包含的所述 DNA已经被赋予适合杂交的可及性；b)扩增所述DNA ；c)检测扩增产物；d)将获得的扩增产物与用正常对照生物样品获得的扩增产物比较，并由此检测 FGFR2基因中的可能异常。在特定实施方式中，生物样品中的DNA无需扩增直接测序。在这些实施方式中，测 序的DNA与对照序列比较以用于检测FGFR2基因中的可能异常。本发明方法还适用于例如通过RT-PCR，例如通过扩增包含于生物样品中的mRNA， 检测FGFR2基因的转录产物中的异常。因此本发明的另一主题为在体外诊断子宫内膜癌的方法，如上所述包括以下步 骤a)从包含于生物样品中的mRNA产生cDNA ；b)使所述cDNA与允许扩增FGFR2基因转录产物的全部或部分的特异性寡核苷酸， 在允许所述探针与所述cDNA杂交的条件下接触；
c)扩增所述 cDNA ；d)检测扩增产物；e)将获得的扩增产物与用正常对照生物样品获得的扩增产物比较，并由此检测 FGFR2基因的转录产物中的可能异常。对照可以为本领域技术人员已知的任何正常子宫内膜对照样品，例如正常的子宫 内膜附近的样品或获自血液或颊粘膜拭子(buccalswab)的正常DNA。对于RNA分析，生物样品可以为如上所述的任何细胞来源，例如活组织检查组织， 从其使用本领域已知的标准方法例如硫氰酸胍_苯酚-氯仿提取(Chomocyznski等，Anal. Biochem.，1987，162 156)。然后分离的RNA通过聚合酶链反应(RT-PCR)，使用对所选位点 特异的特异性寡核苷酸引物，进行偶合地逆转录和扩增。选择引物退火的条件以确保特异 的逆转录和扩增，这样，扩增产物的出现为特定遗传变异的存在的症状。在另一实施方式 中，RNA被逆转录和扩增，其后通过例如直接测序鉴定扩增序列。在另一实施方式中，获自 RNA的cDNA可以被克隆并测序以鉴定突变。本发明的FGFR2核酸还可用作例如治疗和诊断检验中的探针。例如，本发明提供 包括基本上纯的寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸包括具有能够与不同于野生型基因(SEQ ID N0S:1和7)的FGFR2基因的区域特异性杂交的核苷酸序列的区域，例如突变或多态区 域。然后此类探针可以用于特异性检测在取自受试者的样品中存在FGFR2基因的何种突 变。突变或多态区域可以位于FGFR2基因的启动子、外显子或内含子序列。特别优选本发明的探针具有许多足以允许与靶核苷酸序列特异性杂交的核苷酸。 因此，依赖于预定的应用，就特异性的合适水平，本领域技术人员可以构建和测试合适长度 的探针，所述探针基于SEQID NOS :1-3并与本文提供的突变体序列互补。其中靶核苷酸序 列以DNA的大片段形式存在，例如几十或几百k碱基的基因组DNA片段，与用于检测以DNA 的较短片段形式存在的靶序列的探针相比，探针的大小可能必须较长，以提供充分的特异 性杂交。例如，在某些诊断方法中，FGFR2基因的部分可以被首先扩增，并进而从其余的染 色体DNA分离，然后与探针杂交。在此类情况下，较短的探针可能提供充分的杂交特异性。 例如，具有约10个核苷酸的核苷酸序列的探针可能是足够的，虽然优选约15个核苷酸、还 更优选20个核苷酸的探针。在优选的实施方式中，探针或引物还包括连接至其的优选能够被检测的标记。标 记可以例如选自放射性同位素、荧光化合物、酶、酶辅因子。在本发明另一优选实施方式中，用作例如探针或引物的分离的核酸，被改 性以变得更稳定。改性的示例性的核酸分子包括DNA的氨基磷酸化、硫代磷酸化 (phosphothioate)、甲基膦酸化类似物(analogs)(还参见美国专利Nos. 5，176，996 ； 5，264，564 和 5，256，775)。在另一实施方式中，可以使用HPLC或变性HPLC (DHPLC)技术来分析FGFR2核 酸。当观察到在部分变性温度下进行HPLC分析时(所述部分变性温度即足以使在碱基 对错配位点处的异源双链体变性的温度)，显影(deVel0pe)DHPLC，同源双链体可以从具 有相同碱基对长度的异源双链体分离(Hayward-Lester，等，Genome Research, 1995, 5 494 ；Underhill，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93 193 ；Doris，等，DHPLC Workshop, 1997，Stanford University)。这样，使用 DHPLC 应用于突变检测(Underhill，等，GenomeResearch, 1997,7 996 ；Liu，等，核酸 Res.，1998，26 ；1396)。DHPLC 可以区分少至仅一个 碱基对区别的异源双链体。如美国专利Nos. 6，287，822或6，024，878所述，“Matched Ion Polynucleotide Chromatography “ (MIPC)， 或 “Denaturing Matched Ion Polynucleotide Chromatography" (DMIPC)为也可以连同本发明一起使用的分离方法。作为选择，可以使用DGGE法(变性梯度凝胶电泳)或SSCP法(单链构象多态 性)以用于检测FGFR2基因中的异常。DGGE为使用通过包含各种浓度的变性剂的凝胶的 电泳，在少至仅有单个碱基对变化的序列差异的基础上，用于分辨相同长度的两个DNA片 段的方法(Guldberg 等，Nuc. Acids Res. 1994，22 :880)。SSCP 为用于检测两个 DNA 之间 的序列差异的方法，包括两种物质(species)杂交以及通过凝胶电泳的随后错配缺失检测 (Ravnik-Glavac等，Hum. Mol. Genet. 1994，3:801)。还可使用"热裂解"，其为用来检测两 个DNA之间的序列差异的方法，包括两种物质(species)杂交以及通过化学裂解的随后错 配缺失检测(Cotton，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988,85:4397)。此类方法优选在直接 测序后。有利的是，RT-PCR可以用于检测FGFR2转录产物中的异常，因为其允许将剪切突 变的结果例如由于隐蔽位点的激活导致的外显子跳跃或异常剪接可视化。同样优选此类方 法在直接测序后。也可有利地实施使用微阵列的技术，优选允许高通量筛选的微阵列技术，以用于 检测FGFR2基因中的异常或用于检测FGFR2基因的表达或导致如本文所述信号传导增加 的FGFR2通路中其它组分的基因。微阵列可以如此设计以使同一套相同的寡核苷酸与微 阵列的至少两个选择的离散区域连接，从而可以容易地将与阵列的所述选择区域之一接 触的正常样品，和与所述另一选择区域接触的测试样品比较。这些检测使用微流体管道 (microfluidic conduits)，避免正常样品和测试样品的混合。有用的微阵列技术包括由 Nanogen, Inc (San Diego, Calif.)等发展的那些和由Affymetrix发展的那些。然而，也被 称为“基因芯片”或“DNA芯片”的微阵列的所有类型，可以适合于鉴定突变。此类微阵列在 本领域是已知的。在其上连接寡核苷酸的固相载体可由玻璃、硅、塑料(例如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯 酰胺、硝基纤维素或其它材料制成。用于将核酸连接到表面的一种方法为通过在玻璃板上 印刷，大体如Schena等，Science 1995，270 :467_470所述。该方法对于制备cDNA的微阵列 而言尤其有用。还参见 DeRisi 等，Nature Genetics 1996，14 :457_460 ;Shalon 等，Genome Res. 1996,6 :639_645 ；and Schena 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995,93 :10539_11286。还可使用用于制备微阵列的其它方法，例如通过掩膜(Maskos andSouthern, Nuc. Acids Res. 1992,20 :1679_1684)。原则上，可以使用任何种类的阵列，例如在尼龙杂交膜 ± WSE^EP (参见 Sambrook 等,Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989)，尽管如本领 域技术人员所意识到的，由于杂交体积将变小，优选非常小的阵列。对于这些检测，选择杂 交和洗涤条件，以使连接的寡核苷酸"特异性结合"或"特异性杂交"到测试样品中存在 的FGFR2基因的至少部分，即所述探针与具有互补核酸序列的FGFR2位点(locus)杂交、形 成双链或结合，但不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如本文所用，当如果较短的多核苷 酸少于或等于25个碱基时，使用标准碱基配对规则不存在错配，或如果较短的多核苷酸多 于25个碱基，存在不超过5%的错配时，则认为一个多核苷酸序列与另一个互补。优选地，多核苷酸完全互补(没有错配)。通过进行包括阴性对照的杂交检测可以容易地证明特异 性杂交条件导致特异性杂交(参见，例如，Shalon等，supra, and Chee等，Science 1996， 274 610-614)。可以获得各种方法以用于检测和分析杂交事件。依赖于用于标记DNA探针的报告 基团(importer group)(荧光团、酶、放射性同位素等)，荧光分析地，比色分析地或通过放 射自显影地进行检测和分析。通过观察和测定发射的放射，例如荧光放射或粒子发射，可以 获得关于杂交事件的信息。当使用荧光标记的探针时，在转录阵列的各位点的荧光发射可以优选通过扫描共 聚焦激光显微镜来检测。在一种实施方式中，进行使用合适激发线的分离扫描以用于所用 的两种荧光团的每一种。作为选择，可以使用允许在对两种荧光团特异的波长下同时发生 试样照亮(simultaneous specimen illumination)的激光，并且可以同时分析来自两种荧 光团的发射(参见 Shalon 等 Genome Res. 1996,6 :639_695)。基于蛋白的检验作为分析FGFR2核酸的替代方案，可以基于蛋白质中的突变、或蛋白质的失控产 物(dysregulated production),例如生产过剩(overproduction)来评价 FGFR2。在优选的实施方式中，通过免疫检验检测FGFR2。例如Western印迹允许检测特定 的变异、或FGFR2的存在或不存在。特别是，免疫检验可以检测FGFR2蛋白的特定(野生型 或突变体)氨基酸序列。还可使用其它免疫检验形式代替Western印迹，如下所述以用于 生产抗体。这些中之一为ELISA检验。在ELISA检验中，针对FGFR2(FGFR2的表位片段)的抗体，被固定在所选的表面， 例如，能够结合蛋白质的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。洗涤以除去未完全吸收的多 肽后，非特异性的蛋白例如胎牛血清白蛋白(BSA)的溶液可以结合到所选表面。这允许阻 断在固定表面上的非特异吸收位点，从而降低由抗血清非特异结合到表面上的背景。然后 固定表面(immobilizing surface)与样品接触，从而以有助于免疫复合物(抗原/抗体) 形成的方式来测试。这可以包括用稀释剂例如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸盐缓冲 生理盐水(PBS)/Tween的溶液。然后使该样品在约25至37摄氏度下孵育2至4小时。孵 育后，洗涤与样品接触的表面以除去未免疫复合的材料。洗涤方法可以包括用溶液，例如 PBS/Tween或硼酸盐缓冲液洗涤。在测试样品和结合抗体之间形成特定的免疫复合物后，随 后洗涤，免疫复合物形成的出现和平均量可以通过使免疫复合物遭受针对FGFR2突变体的 二抗来确定，所述二抗识别蛋白质上的突变表位。为了提供检测方法，二抗可以具有相关的 活性，例如酶活性，所述酶活性例如将在与合适的发色底物一起孵育时产生显色。然后可以 通过使用例如可视光谱分光光度计测定颜色产生的程度来实现定量。典型地，检测抗体缀合到酶，例如过氧化物酶；蛋白质通过添加可溶发色团过氧化 物酶底物例如四甲基联苯胺，然后添加IM硫酸来测定。测试蛋白浓度通过与标准曲线比较 来确定。这些策略在 Current Protocols in Molecular Biology，V. 2Ch. 11 禾口 Antibodies, a Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)pp 579-593 中详细描述。作为选择，可以使用生化检验来检测FGFR2的表达或累积，例如通过检测通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的样品中带的存在或不存在；通过高效液相色谱(包括反相、离子 交换和凝胶渗透)中任一种分析的样品中色谱峰的存在或不存在；通过分析毛细管电泳色 谱(analyticalcapillary electrophoresis chromatography)中的 FGFR2 的存在或不存 在；或任何本领域已知的其它定量或定性的生化技术。上述讨论的免疫检验包括使用针对FGFR2蛋白或其片段的抗体。此类抗体的生产 描述于以下。抗-FGFR2抗体此类抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段、Fab表达文库和例 如人源化抗体。本领域已知的各种方法可以用于生产针对FGFR2多肽或其衍生物或类似物的多 克隆或单克隆抗体。对于抗体的生产，可以通过使用抗原性多肽注射来免疫各种宿主动物， 包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。为了制备针对FGFR2多肽的单克隆抗体，可以使用任何通过在培养基中的连续 细胞系生产抗体分子的技术。这些技术包括但不限于由Kohler和Milstein等最早开 发的杂交瘤技术(Nature 256 =495-497,1975)，以及三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技 术(Kozbor 等，Immunology Today 4 :72，1983 ；Cote 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 80 2026-2030,1983)和EBV-杂交瘤技术，以生产人单克隆抗体(Cole等，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR. Liss，Inc.，ρρ· 77-96，1985)。在本发明其它实施 方式中，可以在无菌动物中生产单克隆抗体(国际专利
发明者P·古德费洛, P·波洛克 申请人:翻译基因组学研究院;华盛顿大学