猪肝酯酶的同工型的制作方法

专利名称：：猪肝酯酶的同工型的制作方法猪肝酯酶的同工型本发明涉及猪肝酯酶的同工型CyPLE)，涉及含有其运载体以及涉及其在对映异构体富集的醇和酯的生产中的应用。脂肪酶和酯酶可以用作有效的生物催化剂以制备各种各样的光学活性化合物。然而，虽然许多脂肪酶、特别是那些源于微生物的脂肪酶可以商购，但是仅极少的酯酶可以工业规模数量用于外消旋物的拆分[Bornscheuer，U.T.andKazlauskasR丄，HydrolasesinOrganicSynthesis(2005)，2nded,Wiley誦VCH，Weinheim]。由于猪肝酯酶在有机合成中的令人感兴趣的催化性质，本发明特别关注于其[Faber,K.,BiotransformationsinOrganicChemistry(2004)，5thed.Springer,Berlin;Jones,J.B.PureAppl.Chem,(1990),62，1445-1448,Jonesetal.Can.J.Chem.(1985),63，452-456;Lam,L,K,P.et.al.，J.Org.Chem,(1986),51,2047-2050)。尽管已经证实来自猪肝组织的酯酶提取物可以以良好立体选择性部分转化底物，但是这种提取物的应用仍具有许多缺点。除了不同批次之间酯酶比例的波动之外，关于立体选择性的特殊问题可以认为是存在进一步的水解酶(Seebach,D.et.al,25Chimia(1986),40，315-318)。另外的问题是常规的提取物由多种同工酶组成(Farb，D.,et.al，Arch.Biochem.Biophys.(1980)203,214-226)，在一些情况中它们的底物特异性明显不同。Heymann,E.andJunge,W.(Eur.J.Biochem.(1979)，95，509-518;Eur.J.Biochem.(1979),95，519-525)进行了复杂的电泳分离术，从而分离了优选裂解丁酰胆碱、脯氨酸-P-萘胺和丁酸甲酯的级分。相反，其它研究(例如Lam，L.K.P.,etal,J.Am.Chem.Soc.(1988)110,4409-4411)仅示出具有不同活性但是无不同特异性的各个级分。尽管对推定的猪肝酯酶基因的克隆已知有一段时间了(Takahashi,T，et.al.,J.Biol.Chem.(1989),264,11565-11571;FEBSLett,(1991)，280,297-300;FEBSLett.(1991),293,37-41;David,L.et.al,Eur,J.Biochem.(1998)257，142-148)，但是活性猪肝酯酶的功能性重组表达先前仅在毕赤酵母(Pichiapastoris)(Lange，S.etal"ChemBioChem(2001),2,576-582)和大肠杆菌(E.coli)(DE10061864)中描述。另外有文献描述了在大肠杆菌表达期间向培养基中添加物质。向培养基中加入直至3。/。(v/v)的乙醇诱导内源大肠杆菌伴侣蛋白的形成，这是有助于折叠过程并且通常支持正确折叠的酶(Thomas,JQProteinExpressionandPurif(1997),11,289-296)。然而，向培养基中加入3M(v/v)乙醇，猪肝酯酶在大肠杆菌Origami中的表达产生在大肠杆菌中不可检测的活性酯酶表达，但仅是内含体。DE10061864提议特定伴侣蛋白与"/PLE的共表达。以这种方式首次可以从大肠杆菌中产生活性yple。总而言之，可以说尽管天然猪肝酯酶从大肠杆菌中表达是可能的，但是仍未在工业规模确立。因此改良猪肝酯酶的(底物席性对于另外获得改良的系统是有益且必要的，该系统可优选在工业规模用于化学中间体的生物合成制备框架中。因此，本发明的一个目的是相对于现有技术改良的新酯酶。本发明目的在于提供具有改良的活性和域选择性和域稳定性的新酯酶。这些酯酶应优于现有那些酯酶，特别是在空间/时间产率和在转化期间的对映体选择性(enantioselectivivty)以及改变或者扩展的底物特异性方面。这个目的根据权利要求书所述实现。本发明提供了Seq.IDNo.2所示酯酶，其具有选自如下一组的至少一个突变位置氧基酸94E96I97A，G98G101108R113I114P150V154s155T159160A255F257A258G306P307F308A311315P323T480A482F484R其令人惊奇地产生了满足所述目的的种类(spedes)。更特别地，在这些位点的突变可以修饰和改良天然yple的底物特异性、对映体选择性和/或活性。在此所述位置自然是指Seq.IDNo.2的第一个氨基酸。本发明优选Seq.IDNo.4、6、8和10所示酯酶。这些酯酶具有优于天然YPLE的活性和/或选择性和/或稳定性。本发明的酯酶特别在活性、对映体选择性及其它底物特异性方面尤为突出。在另一实施方案中，本发明涉及编码本发明酯酶的分离的核酸。优选的核酸序列是Seq.IDNo.3、5、7和9所示那些序列或者其互补形式。另一方面，本发明涉及具有本发明的一或多个核酸的基因、重组表达系统(例如微生物)或者重组质粒/载体。表达系统是指重组表达本发明的核酸且从而重组产生本发明的多肽的系统。所述产生优选在用相应的核酸序列或载体(见下文所述)转化或者转染的微生物或者其它宿主中发生(根据本发明，术语"转化"和"转染"是同义词，可互换使用)。转化和转染可以根据已知方法进行，例如通过磷酸钙共沉淀、脂染、电穿？L、PEG/DMSO方法、粒子轰击或者病毒/噬菌体感染。本发明的细胞可含有染色体外或者染色体整合形式的重组核酸。换句话说转染/转化可以是稳定的或者瞬时的。转染和转化方案为本领域技术人员所已知(ChanandCohen.1979.HighFrequencyTransformationofBacillussubtilisProtoplastsbyPlasmidDNA.MolGenGenet.168(1》111-5;Kieseretal,2000.PracticalStreptomycesGenetics.TheJohnInnesFoundationNorwich;Sambrooketal..1989.MolecularCloning.ALaboratoryManual,In:seconded..ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor.NY.;IraniandRowe.1997.EnhancementoftransformationinPseudomonasaeruginosaPAOlbyMg2+andheat.Biotechniques22:54-56;Balbas,P.andBolivar,R(1990),DesignandconstructionofexpressionplasmidvectorsinE.coli,MethodsEnzymol.185，14-37;Rodriguez,R丄.andDenhardt，D.T(eds)(1988),Vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,205-225,Butterworth,Stoneham)。对于一般程序而言(PCR、克隆、表达等)，可参考如下的文献和其中引文UniversalGenomeWalkerKitUserManual,Clontech,3/2000;TrigliaT.;Peterson,M.G.andKemp，D丄(1988)，AprocedureforinvitroamplificationofDNAsegmentsthatlieoutsidetheboundariesofknownsequences,NucleicAcidsRes.16,8186。宿主优选是原核生物来源的重组微生物。合适的宿主细胞包括单细胞微生物的细胞如细菌细胞。对此可以提及的微生物是原核生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。可用于表达本发明核酸序列的其它细菌是乳杆菌(Lactobacillus)、芽孢杆菌(Bacillus)、红球菌(Rhodococus)、弯曲杆菌(Campylobacter)、柄杆菌(Caulobacter)、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、Ralstonia、假单胞菌(Pseudomonas)和农杆菌(Agrobacterium)属/种的夷|1些细菌。为此目的优选使用大肠杆菌菌株。特别优选的是大肠杆菌XL1Blue、NM522、JMIOI、JM109、JM105、RR1、DH5a、TOP10-、HBIOI、BL21codonplus、BL21(DE3)codonplus、BL21、Rosetta、Rosetta-gami、MM294、W3110、DSM14459(EP1444367)、Origami。相应的菌株可以由本领域技术人员获得并且至少部分可从国际保藏机构如ATCC或DMSZ获得。也可以应用真核生物例如哺乳动物细胞、昆虫细胞或者植物细胞或者例如酵母如多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)、毕赤酵母属(Pichiasp.)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或者真菌如曲霉(Aspergillussp.)重组产生所述多肽。合适的真核细胞包括CHO细胞、HeLa细胞等等。许多这些细胞可以从保藏机构如ATCC或者DMSZ获得。本发明的多肽也可以在非人宿主中重组制备。所述非人宿主可以是细胞或者多细胞生物体。合适的多细胞生物体包括分子生物学领域熟知的模型系统，如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、斑马鱼或者线虫(Celegans)。转基因非人动物可以通过本领域已知的方法产生。本发明的转基因非人动物可优选具有不同的遗传结构。其可以(i)组成型或者可诱导地过表达本发明核酸序列的基因，(ii)含有失活形式的本发明核酸序列的内源基因，(iii)含有本发明核酸序列的突变基因，该基因完全或者部分置换了本发明核酸序列的内源基因，(iv)具有本发明核酸序列的基因的条件性和组织特异性过表达或者低表达，或者(v)具有本发明核酸序列的基因的条件性和组织特异性敲除。所述转基因动物优选另外含有在使其过表达的启动子控制下的本发明核酸序列的外源基因。或者，本发明核酸序列的内源基因可以通过激活和/或置换内源启动子而被过表达。优选地，本发明核酸序列的基因的内源启动子具有使得所述基因表达增加的遗传修饰。所述内源启动子的遗传修饰包含个别碱基的突变以及缺失和插入突变。在本发明宿主的特别优选的实施方案中，所述宿主是转基因啮齿动物，优选转基因小鼠、转基因兔、转基因大鼠或者转基因绵羊、转基因牛、转基因山羊或者转基因猪。小鼠具有优于其他动物的许多优势。它们易于饲养且其生理学被认为是人类的模型系统。这种遗传操作动物的产生为本领域技术人员所熟知且可以通过常规方法进行(见例如Hogan，B.,Beddington,R.，Costantini,F.andLacy,E.(1994)，ManipulatingtheMouse-Embryo;ALaboratoryManual,2ndedition.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY;WO91/08216)。或者或此外，也可以将细胞培养系统特别是人细胞培养系统用于本发明的非人转基因动物。本发明另一方面涉及具有本发明核酸的完整基因。基因根据本发明是指在分子水平的节段，其主要可以由两个不同区域组成从中通过转录产生单链RNA拷贝的DNA节段，，参与调解这个拷贝过程的所有其它DNA节段。更详细的描述可见于http:〃de.wikipedia.org/wiki/Gen。编码核酸序列可以克隆进常规质粒/载体中，在用这种载体转染微生物或者其它宿主细胞之后在细胞培养物中表达。本领域技术人员可获得为此目的合适质粒或载体。这种质粒和载体可见于例如Studier及其同事(Studier，W.F.;RosenbergA.H.;DunnJ.J.;DubendroffJ.W.;,UseoftheT7RNApolymerasetodirectexpressionofclonedgenes，MethodsEnzymol.1990,185，61誦89)或者Novagen,Promega，NewEnglandBiolabs,Clontech或GibcoBRL的手册。其它优选的质粒和载体可见于Glover，D.M.(1985),DNAcloning:apracticalapproach,Vol.I-III,IRLPressLtd.,Oxford;Rodriguez,R丄.andDenhardt,D.T(eds)(1988),Vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,179-204,Butterworth,Stoneham;Goeddel，D.V"Systemsforheterologousgeneexpression,MethodsEnzymol.1990，185，3-7;Sambrook,J.;Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)，Molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork。可用于将本发明核酸序列或者含有其的基因构建体以非常优选的方式克隆进宿主生物体的质粒是pUC18(RocheBiochemicals)、pKK-177-3H(RocheBiochemicals)、pBTac2(RocheBiochemicals)、pKK223画3(AmershamPharmaciaBiotech)、pKK-233-3(Stratagene)或者pET(Novagen)。对于大肠杆菌而言合适的载体例如是pET-21a(+)，但是也可以使用用于原核单细胞生物体的其它表达载体以及用于真核生物的载体。证实适于酵母的载体的例子是pREP载体和pINT载体。例如已经揭示了杆状病毒载体如EP127839或EP549721中所述那些载体在昆虫细胞中表达，以及例如SV40载体适于在哺乳动物细胞中表达且可常规获得。特别优选的是用于单细胞真核生物体的载体，特别是pET载体，用以转化大肠杆菌细胞，特别是大肠杆菌Origami。在特别优选的实施方案中，已经导入载体中的本发明的核酸序列另外与所述载体提供的组氨酸标记融合。优选将导入的核酸序列克隆进优选的pET载体中，由此转录处于所述载体中存在的IPTG-可调节启动子控制下。或者，也优选应用鼠李糖可调节启动子。除了常规的标记如抗生素抗性基因之外，所述载体可含有进一步的功能性核苷酸序列以调节特别是抑制或诱导ADH基因和/或报道基因的表达。例如优选利用可调节弱启动子如rha启动子或者nmtl启动子，或者可调节强启动子如lac、ara、lambda、pL、T7或T3-启动子。编码DNA片段必须可以从载体中的启动子转录。已确立的启动子的其他例子是在昆虫细胞中表达的杆状病毒多角体蛋白启动子(见例如EP127839)和早期SV40启动子，以及LTR启动子，例如MMTV启动子(MouseMammaryTumourVirus;Leeetal,(1981)Nature,294(5838),228-232)。因此，本发明的基因、载体/质粒可含有进一步的功能性序列区，例如复制起点、操纵基因或者终止信号。在特别有利的实施方案中，本发明涉及重组微生物，其中除了本发明的核酸序列之外，其还含有一或多个克隆的伴侣基因。优选的合适伴侣是GroEL和GroES，特别是在大肠杆菌Origami菌株中。令人惊奇地，尽管其它可选伴侣系统例如通过加入乙醇诱导的内源大肠杆菌伴侣或者其它共表达的伴侣如DnaK、DnaJ和GrpE未成功(DE10061864)，但是所述活性酶的表达在存在这两个折叠辅助蛋白的条件下实现。令本领域技术人员惊奇的是伴侣系统Dnak、DnaJ、GrpE和GroEL、GroES相当共表达或者单独GroEL或GroES与猪肝酯酶在大肠杆菌中的共表达仅导致内含体形式的表达，且在大肠杆菌细胞粗提物中无可检测的活性。因此在任何情况中优选的是伴侣系统GroEL/GroES，是优选的诱导/表达系统，即使宿主生物体中同时存在其它伴侣系统。真核蛋白在大肠杆菌中的功能性表达是一种强挑战，特别是在如果所述蛋白是翻译后糖基化蛋白质的情况中。在猪肝酯酶在大肠杆菌中重组表达的情况中，特定伴侣系统GroEL、GraES的使用显然抵偿翻译后糖基化的缺乏。关于此方面的发展和实施方案可参见DEI02006031600所述。另一方面，本发明涉及本发明(重组)多肽在制备对映异构体富集的醇、羧酸和酯中的应用，特别是从上述化合物的内消旋形式例如任选取代的二羧酸酯如丙二酸二酯进行制备。可以使用固定化形式的酶(SharmaB.R;BaileyL.F.andMessingR.A.(1982),ImmobilisierteBiomaterialien-TechnikenundAnwendungen[Immobilizedbiomaterials画Techniquesandapplications],Angew.Chem.94,836-852)。固定化可以通过冻干法便利地实现(Paradkar，V.M.;Dordick，J.S.(1994),Aqueous-LikeActivityofa-ChymotrypsinDissolvedinNearlyAnhydrousOrganicSolvents,J.Am.Chem.Soc.116,5009-5010;Mori,T.;Okahata，Y.(1997),Avarietyoflipi-coatedglycosidehydrolasesaseffectiveglycosyltransfercatalystsinhomogeneousorganicsolvents,TetrahedronLett.38,1971-1974;Otamiri,M.;Adlercreutz,R;Matthiasson,B.(1992),Complexformationbetweenchymotrypsinandethylcelluloseasameanstosolubilizetheenzymeinactiveformintoluene,Biocatalysis6,291-305)。特另lj优选的是在存在表面活性剂的条件下冻干，所述表面活性剂如AerosolOT或者聚乙烯吡咯垸酮或者聚乙二醇(PEG)或者Brij52(二乙二醇单十六垸基醚)(Kamiya，N.;Okazaki,S.画Y.;Goto,M.(1997),Surfactant-horseradishperoxidasecomplexcatalyticallyactiveinanhydrousbenzene,Biotechnol.Tech.11,375-378)。最优选的是固定化于Eupergit,特别是EupergitC⑧和Eupergit250L(R6hm)(参见E.Katchalski-Katzir,D.M.Kraemer，J.Mol.Catal.B:Enzym.2000，10，157)。也优选组合由附着His标记(六组氨酸)修饰的多肽固定于Ni-NTA(Petty,K.J.(1996)，Metal-chelateaffinitychromatographyIn:Ausubel,RM.etal.eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2,NewYork:JohnWileyandSons)。使用CLEC也是可行的(St.Clair,N.;Wang，Y.-F.;Margolin,A.L.(2000)，Angew.Chem.Int.Ed.39，380-383)。这些措施可以从有机溶剂不稳定的(重组)多肽成功产生可以在水性和有机溶剂混合物中或者完全于有机溶剂中起作用的多肽。优选如下所述使用本发明的多肽转化酯或者羧酸和醇。将多肽以希望的形式(游离的、固定化的、于宿主生物体中或者随机破坏形式)加入适当培养基中，优选水溶液中。向这个混合物中加入底物，同时保持最佳温度范围和最佳pH范围。在完成转化之后，获得的醇或者酯可以通过本领域技术人员已知的方法从反应混合物中分离(结晶、提取、层析)。利用酯酶将酯或者羧酸和醇经酶促转化为对映异构体富集的醇、羧酸和酯的原理为本领域技术人员所已知(见在文中开始处引用的参考文献；图示2)。特别感兴趣的是前述衍生物的内消旋形式的转化。本发明所述转化是有益的，其中对映异构体富集的产物可获得100%收率，而外消旋化合物的正常拆分仅可产生至多50%的特定对映异构体。因此，例如使用特定取代的丙二酸二酯可以产生对映异构体富集的产物，其是化学合成中的重要中间体。以此方式可以有效且容易地产生任选N保护的氨基丙二酸二酯，即相应的对映异构体富集的不对称氨基羧酸单酯。下图示1所示反应顺序也是感兴趣的。图示lR，OC)CPLE'COOF^1.酰胺化2.Cl降解R，OOC,100%收率R，OOCCOOH理论100%收率对于该反应合适的基团可见于下文列出。酰胺化和Cl降解的方法为本领域技术人员熟知(Organikum,VEBDeutscherVerlagderWissenschaften，Berlin1986,pp.388ff，pp.571ff)。图示2:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>本领域技术人员也熟知可以从相应手性酯中根据I.或者VI.制备的或者可用于制备对映异构体富集的酯的对映异构体富集的醇的例子。它们可以由如下通式概括示出-OHFTR,其中R、R，和R"彼此不同，特别是H，(CrQi)-烷基，(d-Cs)-烷氧基，HO-(CrCs)-垸基，(<:2-<:8)-烷氧基烷基,(CVd8)-芳基(C7-Cw)-芳烷基(Q-d8)-杂芳基(Crd9)-杂芳烷基，(d-C8)-垸基-(C6-d8)-芳基，(CrC8)-烷基-(C3-d8)-杂芳基(C3-C8)-环垸基，(CrC8)-烷基-(C3-Cs)-环烷基(C3-C8)-环垸基-(d-C8)-垸基或者R与R，和/或R与R"禾口/或R，与R"形成(CVC5)-亚烷基桥(alkylenebridge)。对映异构体富集的酯或酸的例子可以为如下通式所示，其中R、R'和R"彼此相同或不同，特别是，H,(CrCs)-垸基，(d-Cs)-垸氧基，HO-(d-C8)-垸基，((32-(:8)-垸氧基垸基，(C6-C,8)-芳基(C7-C!9)-芳烷基，(C3-ds)-杂芳基，(Crd9)-杂芳垸基，(CrC8)-垸基-(C6-C!8)-芳基，(CrCs)-烷基-(C3-d8)-杂芳基(C3-Q)-环烷基(CrC8)-烷基-(C3-C8)-环垸基，(C3-C8)-环烷基-(d-C8)-烷基或者R与R'或者R与R"或者R，与R"形成(C3-C5)-亚垸基桥，以及R。R2和R3彼此不同，特别是，H，(C厂C8)-垸基，(d-C8)-烷氧基，HO-(C广C8)-烷基，(CVC8)-垸氧基烷基，环戊二烯基，(C6-C,8)-芳基，(C7-d9)-芳烷基，(C3-ds)-杂芳基，(CVd9)-杂芳烷基，(CrCs)-垸基-(C6-d8)-芳基，(d-C8)-垸基-(C3-C,8)-杂芳基，(CrQ)-环垸基，(CrC8)-垸基-(C3-C8)-环垸基，(C3-C8)-环烷基-(d-C8)-垸基或者与R2和/或与R3和/或R2与R3形成(CrC5)-亚垸基桥。适于本发明使用的是适当缓冲的水性溶剂。然而，也可以使用pH-stat仪器[公司SchottAQMainz,Germany,brandTitroLinealpha]进行反应。优选在0°C至85°C之间、特别优选在3(TC至80。C之间及最优选在大约50°C温度下进行转化。技术人员也可以自由选择反应的pH，且反应可以在固定PH以及pH区间内不同的pH条件下进行。根据本发明目的的最佳反应结果选择pH。优选在pH为pH5到9、优选pH6到8及特别优选pH6.5到7.5条件下进行反应。如上所述，所述多肽可以均质纯化的化合物的天然形式或者作为重组产生的酶而应用。此外，(重组)多肽也可以用作完整客体(guest)生物体的成分或者与任何纯度的宿主生物体的破坏的细胞量结合使用。如果使用的底物在细胞培养物中例如通过应用合适宿主而被转化为希望的产物，则根据使用的宿主生物体或者使用的细胞培养物而选用合适的营养培养基。宿主细胞合适的培养基为本领域已知且可以商购。此外，可以为细胞培养物补充常用的添加剂例如抗生素、生长促进剂如血清(胎牛血清等)以及类似的已知补充剂。进一步优化的反应条件可见于DE102006031600所述。本发明另一应用涉及多肽的制备，所述多肽具有优于SEQ.ID.NO:2多肽的改良的活性和减选择性和域稳定性，通过如下步骤制备i)诱变本发明的核酸，优选诱变Seq.3、5、7、9所示核酸，ii)将可得自i)的核酸序列克隆进合适载体中，随后转化进合适的表达系统中，及iii)检测并分离具有改良的活性和域选择性和域稳定性的所述多肽。通过诱变方法改良本发明的核酸序列或者由其编码的多肽的方法为本领域技术人员所熟知。合适的诱变方法是本领域技术人员为此目的可利用的任何方法。特别是饱和诱变法、随机诱变法、体外重组方法和定点诱变銜Eigen,M.andGardiner,W.，EvolutionarymolecularengineeringbasedonRNAreplication,PureAppl.Chem.1984,56，967-978;Chen,K.andArnold,F.，Enzymeengineeringfornonaqueoussolvents:randommutagenesistoenhanceactivityofsubtilisinEinpolarorganicmedia.Bio/Technology1991，9,1073-1077;Horwitz,M.andLoeb,L.，PromotersSelectedFromRandomDNA-Sequences,ProcNatlAcadSciUSA83,1986，7405-7409;Dube,D.andL.Loeb，MutantsGeneratedByTheInsertionOfRandomOligonucleotidesIntoTheActive-SiteOfTheBeta-LactamaseGene,Biochemistry1989,28，5703-5707;Stemmer,P.C.，RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling,Nature1994，370，389-391andStemmer,P.C.,DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution.ProcNatlAcadSciUSA91，1994，10747-10751)。通过下文所述方法(参见下文)将获得的新核酸序列克隆进宿主生物体中，使用合适的筛选方法检测以此方式表达的多肽并随后分离。合适的检测方法是对于这种多肽产生的分子在原则上任何可能的检测反应。对于产生或消耗的NADH特别适合的检测方法是光量测定法，适合检测由这种酶产生的醇的是HPLC或者GC方法。此外，通过凝胶电泳或者通过抗体的检测方法也适于检测已经通过遗传工程方法修饰的新多肽。光学富集的(Opticallyenriched)(对映异构体富集的)化合物对于本发明是指在具有另一对映体的混合物中一种光学对映体的存在>50mol%。术语核酸序列是指所有种类的单链或者双链DNA以及RNA或者其混合物。因此，本发明的核酸序列可以是DNA分子或者RNA分子。优选所述核酸分子是cDNA分子或者mRNA分子。根据本发明，所述DNA分子也可以是基因组DNA分子。本发明进一步包含其中所述DNA分子是PNA分子或者DNA分子的另一衍生物的实施方案。本发明所用术语"互补"是指互补性延伸至本发明核酸分子的整个区域，无任何缺口。换句话说，根据本发明，优选的是延伸至本发明核酸序列整个区域即从5'末端至3，末端的100%互补性。根据本发明，改良的活性和/或选择性和/或稳定性是指所述多肽更具活性和/或更具选择性，和/或在使用的反应条件下更加稳定。虽然酶的活性和稳定性自然应尽可能地高以适于工业应用，但是关于选择性的改良是指这样的情况，即所述酶的底物选择性降低但是对映体选择性增加。这也同样适用于本发明的所述表达，没有实质降低。对于本发明请求保护的蛋白质序列和核酸序列，本发明还包含与任何这些序列任一具有高于97%、优选高于97.5%、98°/。或者98.5°/。、更优选高于99%或99.5%同源性(除天然简并之外)的那些序列，只要这个序列保留其功能性或者效用即可。如本文所用，术语"同源性"(或者相同性)可以由等式H(。/。)-[l-V/X]X100定义，其中H是指同源性，X是对比序列的核苷酸碱基/氨基酸总数，V是基于对比序列被认为不同的核苷酸碱基/氨基酸的数目。在任何情况中，术语编码多肽的核酸序列包括根据遗传密码的简并性而看起来可能存在的任何序列。本文所用术语"在严格条件下"的含义如Sambrooketal.(Sambrook,J.;Fritsch,E.F.andManiatis，T.(1989),Molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)所述。优选i也，如果在用1XSSC(150mM氯化钠、15mM拧檬酸钠，pH7.0)和0.1%SDS(十二垸基硫酸钠)在50°C、优选在55°C、更优选在62。C以及最优选在68°C洗涤1小时之后，更优选用0.2XSSC和0.1。/oSDS在50。C、更优选在55。C、尤为优选在62。C以及最优选在68°C洗涤1小时之后，阳性杂交信号仍可观测到，则根据本发明认为杂交是严格的。(CrC8)-垸基可以是甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，以及任何其结合异构体。根据本发明的定义范围，(CVC2o)-烷基是具有1直至20个碳原子的相应基团。根据本发明的定义范围，(C3-C2o)-烷基是具有3直至20个碳原子的相应基团。((VC8)-烷氧基相应于(d-C8)-烷基，条件是前者通过氧原子结合。(C2-Q)-垸氧基垸基是指其中烷基链被至少一个氧官能团中断，两个氧原子彼此连接是不可能的。碳原子的数目表示该基团中含有的碳原子的总数。(C3-Cs)-亚烷基桥是具有3到5个碳原子的碳链，该链通过两个不同碳原子与相关分子结合。上述基团可以由卣素和域(d-C8)-烷氧基羰基和/或含有N-、O-、P-、S-、Si-原子的基团单或多取代。后者特别是上述种类的垸基，其链具有一或多个所述杂原子或者其通过这些杂原子之一与分子结合。(C3-C8)-环垸基是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基等。这些可以由一或多个卤素和/或含有N-、O-、P-、S-、Si-原子的基团取代，和/或在其环中可具有N、O、P、S原子，例如l-，2-，3-,4-哌啶基，l-，2-,3-吡咯垸基，2-，3-四氢呋喃基，2-,3-,4-吗啉基。(C3-Q)-环烷基-(d-C8)-烷基是指如上述环烷基，其通过如上述烷基与分子结合。对于本发明，(CrC8)-烷氧基羰基是指如上述具有直至8个碳原子的烷基，其通过O(OO)官能团结合。对于本发明，(d-C8)-酰氧基是指如上述具有直至8个碳原子的垸基，其通过(CK))O官能团结合。对于本发明，(d-C8)-酰基是指如上述具有直至8个碳原子的烷基，其通过(C-O)官能团结合。(C6-C,8)-芳基是指具有6到18个碳原子的芳基。更特别地，其包括这样的化合物，如苯基、萘基、蒽基、菲基、联苯基或者与所述分子退火的上述种类的系统，例如茚基系统，其可任选由(CrQ)-烷基、(d-C8)-烷氧基、(C2-Q)-烷氧基烷基、NH(d-C8)-垸基、N((C,-C8)-垸基)2、OH、0(CrC8)-垸基、N02、NH(C广C8)-酰基、N((d-Q)-酰基)2、F、Cl、CF3、(d-Cs)陽酰基、(Q-C8)-酰氧基、(C7-C,9)-芳垸基、(Q-Q9)-杂芳烷基取代。(C7-d9)-芳垸基是通过(d-C8)-烷基与分子结合的(C6-C8)-芳基。在本发明范围中，(C3-ds)-杂芳基是指具有3到18个碳原子的5、6或7元芳环系统，其环中具有杂原子例如N、O、或者S。这种杂芳族化合物被认为特别是如l-,2國，3-呋喃基，如l-,2誦，3-吡咯基、l-,2-,3-噻吩基、2-,3-,4-吡啶基、2-，3-,4-,5-,6-，7-吲哚基、3-,4-，5-吡唑基、2陽，4-,5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基,2-，4-,5-，6-嘧啶基这样的基团。所述杂芳族化合物可以如上述(C6-d8)-芳基相同方式取代。(C4-d9)-杂芳垸基是指相应于(C7-d9)-芳烷基的芳香杂环系统。合适的卤素(Hal)是氟、氯、溴或者碘。术语水性溶剂是指水或者主要由水组成的溶剂混合物且含有可溶于水的有机溶剂，例如醇，特别是甲醇或乙醇，或者醚如THF或二氧杂环已垸，或者其它共溶剂如DMSO。本文中列举的参考文献被认为也在本发明揭示范围内。序列表中示出的蛋白质序列在C末端另外含有His标记和接头序列。代表活性yple的实际蛋白质序列因此是序列表中所示序列，其在c末端截短21个氨基酸。对于编码所述蛋白质序列的核酸序列也如此。方法mRNA的分离与cDNA合成将新鲜猪肝组织(0.1g)用Trizol⑧试剂(TRIzo1⑧PlusRNAPurificationKit,Invitrogen,CA,USA)处理，均质(在室温进行10分钟；UltraturraxT25，IKA-Labortechnik)，并且根据厂商指导分离RNA。通过分光光度测定法确定RNA浓度。根据厂商的方案通过RT-PCR进行cDNA合成，使用oligo(dT)15引物及具有RNaseH活性的MMLV逆转录酶(Promega,Madison,WI,USA)。PLE基因的扩增与克隆将RT-PCR产物用于扩增PLE基因，使用基于yPLE序列的两个基因特异性引物具有以斜体字标示的Ndel限制性裂解位点的(5'-CACCC4r，GGGCAGCCAGCCTCGC-3'(Seq.IDNo.ll)以及具有以斜体字标示的Xhol限制性裂解位点的5'-CCGCrC04GTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTGC-3'(S叫IDNo.12);下划线处是起始密码子和终止密码子)。正向引物在其5'末端还含有碱基CACC，随后可以克隆进TOPO载体中(见下文所述)。这些引物已经除去了在原始猪基因的N末端附着的18个氨基酸信号序列，及4个氨基酸C末端ER(内质网)滞留信号，从而促进随后在大肠杆菌中的表达(Lange，S，et.al,，ChemBioChem(2001)，2，576-582)。在热f盾环仪(TechneProgene，JepsonBoltonLaboratoryEquipment,"Watford,UnitedKingdom)上进行PCR。根据厂商指导，所述PCR应用PfbPlus聚合酶(Roboklon,Berlin,Germany)以及如下温度程序在95°C变性5分钟之后，进行如下30次循环(在95°C1分钟，在60°C1分钟及在72°C3分钟)，最后在72°C进行7分钟。根据厂商指导，将PCR产物在琼脂糖凝胶中分级分离，纯化并克隆进TOPO/pET101中(ChampionTMpETDirectionalTOPOExpressionKit;Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)。用该构建体混合物转化大肠杆菌TOP10细胞[FmcrAD(mrr-hsdRMSmcrBC)(F801acZDM15)DlacX74recAldeoRaraD139D(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrK)endAlnupG](Invitrogen)并在琼脂平板上分离出。将以此方式获得的重组单克隆单独培养，分离质粒DNA，通过大小测定法或者限制性作图鉴别，并用作PLE序列的PCR扩增模板。然后对扩增的序列测序(MWG-Biotech，Martinsried,Germany)。表达系统的构建根据厂商方案，将各个TOPO/pET101-PLE构建体的质粒DNA用Ndel禾口Xhol消化(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA,USA;Promega,Madison,WI,USA)，将大小为大约1694bp的特定片段插入Ndel/XhoI-消化的、经琼脂糖凝胶纯化的pET15b载体(Novagen,Madison，WI,USA)中，这样为基因添加了额外的N末端His标记。将该连接产物用于转化大肠杆菌DH5a菌株(Novagen,Madison,WI,USA)[supE44AlacU169(①801acZAM15)hsdR17recAlendAlgyrA96thi-lrdA1]，并且通过培养转化的菌株增殖质粒。从重组菌株中分离质粒，再次测序检验。由此获得的pET15b-PLE构建体用于转化大肠杆菌Origami(DE3)菌株[A(ara—leu)7697AlacX74AphoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsLF[lac+laclqpro](DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,StrR，TetR)4](Novagen，Madison,WI，USA)，该菌株先前已经用pGro7质粒(ChaperonePlasmidSet,TAKARABIOInc.,Otsu，Shiga,Japan)转化，这样使得伴侣蛋白GroEL+GroES表达。关于与伴侣蛋白复合物GmEL/ES共表达而表达猪肝酯酶的详细描述见B6ttcher,D,,BrUsehaber，E.，Doderer.K.,Bornscheuer,U.T.(2007)，Functionalexpressionofthegamma-isoenzymeofpiglivercarboxylesteraseinEscherichiacoli，Appl.Microbiol.Biotechnol.，(2007)，73(6)，1282-1289。重组PLE同工酶在大肠杆菌Origami中的表达与GroEL/ES伴侣蛋白复合物共表达将伴侣蛋白与PLE同工酶在含有20吗/mL氯霉素和50pg/mL氨苄青霉素的150ml的LB培养基中共表达以进行质粒选择。伴侣蛋白表达通过加入lmg/mLL-阿拉伯糖立即起始。在OD600=0.5通过加入40pMIPTG诱导PLE产生。24小时后通过离心取出细胞，将其再悬浮于10ml磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)中，使用超声进行破坏。细胞碎片通过离心除去，将上清用于进一步实验中(细胞粗提物)。根据Bradford或者使用pNPA测定法确定蛋白质含量和酯酶活性。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳及用快红染料(FastRed)活性染色将含有重组产生的PLE的粗提物的混合物(5-15pL，相应于pNPA分析的0.05-0.15U)与缓冲液(20。/。(w/v)甘油；在dH20中的0.0025%(w/v)溴酚蓝)(5-l(HiL)混合。将其等份在天然聚丙烯酰胺凝胶(7.5%)上分离。对于活性染色，将凝胶在新鲜制备的ot-乙酸萘酯与快红染料混合物中保温。在产生的a-萘酚与快红染料之间红色复合物的形成表示酯酶的水解活性(Krebs伤nger,N.，et.al,，(1998)EnzymeMicrob.Technol，22，641-646)。然后将该凝胶用考马斯亮蓝染色。酯酶活性在磷酸钠缓冲液(50mM)中通过分光光度测定法确定酯酶活性，使用乙酸对硝基苯酯(10mM，溶解于二甲亚砜中)作为底物。在室温在波长410nm(s=15*103cm")及pH7.5条件下确定产生的对硝基酚的量。1单位(U)定义为酶在分析条件下每分钟能转化liaM对硝基酚的量(Krebs伤nger，N.,et.al,，(1998)EnzymeMicrob.Technol,22，641-646)。酯酶底物特异性在恒定pH下分析。将已知量的酯酶在37°C加入含有酯底物(5Q/o(v/v);三丁酸甘油酯，乙酸乙酯，三油酸酯或者丁酸甲酯)和P可拉伯树胶(2。/。(w/v))的乳状液(20mL)中。在pHstatiometer(Schott，Mainz,Germany)中用O.OlNNaOH自动计数滴定释放的酸以维持恒定pH为7.5。1单位(U)定义为酶在分析条件下每分钟能产生lpM酸的量。仲醇的乙酸酯的酶促水解的立体选择性(见DE10258327A1)在370C在热混合器(thermomixer)(ThermomixercomfortEppendorf,Hamburg,Germany)中的1.5ml反应容器中进行水解。0.5U酯酶粗提物(基于pNPA测定)用于lml底物溶液(在pH7.5磷酸钠缓冲液中lOmM，50mM)。通过用二氯甲烷提取混合物而终止反应，将有机相经过无水硫酸钠干燥。对映异构体纯度和转化通过气相层析确定。变体酶的对映体选择性根据Chen等所述计算(CS.Chen,Y.Fujimoto,G.Girdaukas,C丄Sih，J.Am.Chem.Soc.1982，104，7294)。关于GC分析中底物合成及保留时间的详细描述见Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T""SubstrateSpecificityoftheY國isoenzymeofrecombinantpigliveresterasetowardsacetatesofsecondaryalcohols"J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20，129-133所述。顺式-3，5-二乙酰氧基环戊-l-烯(cis-3，5-diacetoxycyclopent-l-ene)的酶促水解的立体选择性该实验程序与仲醇外消旋物的拆分相同，使用在lml反应混合物中的0.5单位(pNPA)的PLE粗提物，所述反应混合物含有在pH7.550mM磷酸钠缓冲液中的10mM底物。反应在37。C进行，在指定时间取样。转化和产物对映体过量通过气相层析分析。该分析应用在C-R5AChromatopac/IntegratorGC仪器(Shimadzu,Duisburg，Germany)中的Hydrodex-b-3P(heptakis-(2，6-di-0-methyl-3-0-pentyl-b-cyclodextrin)(25m，0.25mm))GC柱(MacheiyNagel,Diiren,Germany)。在110°C柱温等温级分的保留时间是顺式-3，5-二乙酰氧基-环戊-l-烯21.8分钟；3(S)-乙酰氧基-5(尺)-羟基-环戊-1-烯18.2分钟；3(R)-乙酰氧基-5(S)-羟基-环戊-l-烯16.0分钟。结果从猪肝中分离mRNA及RT-PCR分离的RNA的质量在琼脂糖凝胶上检验(图未示出)，并通过分光光度测定法定量所述RNA(2.6pg/Vl);因此，从使用的O.lg组织中获得260pg的RNA。在通过RT-PCR转录为cDNA之后，所述cDNA的质量通过使用其作为模板扩增管家基因p-肌动蛋白进行检验。图1示出所述cDNA使得卩-肌动蛋白基因扩增，并且其质量因此适于进一步实验。图1:通过(3-肌动蛋白基因的扩增进行的cDNA质量控制。模板泳道1:人cDNA(阳性对照)，泳道2:猪肝cDNA;泳道3:水(阴性对照)。PLE基因的扩增与克隆所述cDNA用于使用基于yPLE序列的引物扩增PLE基因。如图2所示，在琼脂糖凝胶中应用PCR之后的反应混合物产生大约1.7kbp的明显条带，相应于yPLE的大小。切下这个条带，分离DNA并且借助于通过正向引物附着的CACC突出端克隆进TOPO载体中。在用这个构建体混合物转化大肠杆菌ToplO细胞之后获得重组克隆。从这些克隆中分离质粒DNA，通过限制性作图检验并测序。图2:从猪肝cDNA中扩增PLE基因。泳道1:作为模板的cDNA;泳道2:lkbp标记物；泳道3:作为模板的水(阴性对照)。测序结果对新PLE基因进行测序表明获得四个新的基因序列，其彼此互不相同且与？PLE不同。在图3的氨基酸序列对比中示出与？PLE序列不同的位置。PLE及其因此存在的基因从1至5编号，PLE1相应于先前揭示的Y-PLE。新PLE与已知，PLE的不同之处可概括如下PLE2:6个核苷酸取代(3个氨基酸取代)[同工酶4]PLE3:35个核苷酸取代(20个氨基酸取代)[同工酶24]PLE4:34个核苷酸取代(20个氨基酸取代)[同工酶39]PLE5:34个核苷酸取代(21个氨基酸取代)[同工酶41]图3:发现的PLE:PLE2、3、4和5的氨基酸序列与^PLE(PLEl)序列的部分对比。蛋白质的表达将发现的5个基因亚克隆进pET15b载体中。用这些构建体及用编码两个伴侣蛋白部分GroES和GroEL的pGro7质粒转化大肠杆菌Origami。对于这个表达系统已经描述了PLE在大肠杆菌中的成功过表达(DE10061864)。将该菌株小规模培养(50ml/150ml)，诱导伴侣分子和PLE构建体的蛋白质表达。此外，将YPLE与用pGm7而非pET载体转化的大肠杆菌Origami共培养以进行对比，诱导蛋白质表达。破坏上清(体积3ml/9ml)，通过离心获得含有可溶细胞内蛋白的粗提物并将其用于随后的实验中。所有粗提物中的蛋白质含量为大约7-9mg/ml(其中形成的大部分蛋白质相应于伴侣蛋白)；根据培养物的大小，粗提物的最终体积为3或9ml。天然凝胶与快红染料染色将所述粗提物应用于天然凝胶，随后将其在快红溶液中保温，a-乙酸萘酯作为底物，由此检验酯酶活性。随后进行考马斯染色(图4:PLE2、克隆12、PLE3、PLE4、PLE5、<yPLE和大肠杆菌OrigamipGro7野生型(阴性对照)的粗提物的天然PAGE。左侧用(X-乙酸萘酯快红染色；右侧随后的考马斯亮蓝染色)。用PLE2、PLE3、PLE4、PLE5和丫PLE可见活性酯酶条带，奇怪的是其具有不同大小及非常重的成片条带(smear)。这可能是由于方法所致，因为天然凝胶不能如变性SDS凝胶那样清楚地运行；然而，也可能是一些粗提物含有三聚体和四聚体PLE构建体，这两种构建体均是活性的。克隆12未示出任何活性。同样，正如所预期的，在无pET15b构建体的大肠杆菌Origami粗提物中无可检测的酯酶活性。考马斯染色中的蛋白质条带明确表明除了YPLE之外，许多伴侣蛋白过表达。通过Bradford确定的蛋白质含量因此主要包含伴侣蛋白且不提供关于yPLE含量的任何信息。基于在快红染色之后进行的考马斯染色不能精确评估过表达程度。与具有伴侣蛋白的野生型大肠杆菌对比，在活性条带区域中无另外可见的蛋白质条带。然而，所述蛋白质在活性染色之后通常不再被考马斯染色。然而，这也可意味着过表达非常低，但是仍提供具有良好活性的蛋白质。对乙酸对硝基苯酯的活性酯酶活性首先通过使用pNPA测定法检验。结果示于表1。表1:PLE变体和表达菌株(具有伴侣质粒pGro7的大肠杆菌Origami)对pNPA的体积活性(U/ml)。所有酯酶均具有N末端His6标记。_粗提物体积活性(U/ml)PLE1(Y孔E)11PLE28PLE321PLE426PLE540大肠杆菌Origami+0.02pGro7所有PLE均示出对pNPA的活性，一些新酯酶甚至比Y-PLE的高2-4倍。对非手性酯的活性新PLE变体对非手性酯的活性使用pHstat检测。在酶纯化后，确定比活性，结果示于表2。表2:新PLE和，PLE对一些非手性酯的比活性，通过在10分钟的测量期间在pHstat在37°C和pH7.5确定。三丁酸甘油酯辛酸乙酯丁酸甲酯乙酸乙酯三油酸酉iPLE1(y孔E)3066357380PLE32246323248PLE41314476259PLE54091441821712仲醇的乙酸酯的外消旋物的拆分研究如下外消旋乙酸酯的水解:OAcOAc1234乙酸(艮S)-l-苯乙酸(KS)-l-苯乙酸(R^S)-l-苯乙酸(KS)小苯基基-l-丙酯基-乙酯基-2-丁酯-2-戊酯气相层析研究产生的结果在表3到6中示出。商购PLE制品的数据得自A.Musidlowska(Musidlowska-Persson,A.andBornscheuer，U.T"J.Mol.Catal.B.Enzym.2002,19-20，129-133.)，加入该数据以进行对比。表3:新PLE变体在1乙酸(尺5>1-苯基-1-丙酯的外消旋物的动力学拆分中的对映体选择性。("FlukaPLE禾卩ChirazymeE2的数据得自Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T.，J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20，129-133。PLE同工酶时间[h]对映体过量[%ees][%eeP]转化[%]E优选PLE1(y孔E)44145484RPLE223849444RPLE312534433SPLE41.551714210RPLE5161934051RFlukaPLE("12128432.2RChirazymeE2(*)0.51827402.1R表4:新PLE变体在2乙酸(尺》-l-苯基-2-乙酯的外消旋物的动力学拆分中的对映体选择性。("FlukaPLE和ChirazymeE2的数据得自Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T.,J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20,129-133。PLE同工酶时间[h]对映体过量[%ees][%eeP]转化[%]E优选PLE1(Y-PLE)274774917RPLE2267814519RPLE31.51824432SPLE4368944266RPLE5279954594RFlukaPLE(*)1.56556547RChirazymeE2。)16156527R表5:新PLE变体在3乙酸(尺0-1-苯基-2-丁酯的外消旋物的动力学拆分中的对映体选择性。C)FlukaPLE和ChirazymeE2的数据得自Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer!U.T.,J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20,129-133。PLE同工酶时间[h]对映体过量〖％ees][%eeP]转化率[%]E优选PLE1(Y孔E)483934772SPLE2467934255SPLE342632452RPLE4365834325RPILE5482894845RFlukaPLEC*)21212491.4SChirazymeE2(*)15840594S表6:新PLE变体在4乙酸(尺5)-l-苯基-2-戊酯的外消旋物的动力学拆分中的对映体选择性。("FlukaPLE和ChirazymeE2的数据得自Musidlowska-Persson,A.andBornscheuer:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>图5再一次以图例证了对映体过量中的不同。图5:不同猪肝酯酶同工酶在底物1-4的外消旋物的动力学拆分中的对映体选择性。商购FlukaPLE的数据得自文献(Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T.，J.Mol.Catal.B.Enzym.2002,19-20，129-133)。顺式-3,5-二乙酰氧基环戊-l-烯的水解表7:新PLE变体、y-PLE(PLEl)和可商购的FlukaPLE对内消旋-顺式-3,5-二乙酰氧基环戊-l-烯的不对称作用。反应用0.5单位(pNPA)粗提物在37°C进行，对映体过量通过气相层析确定。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>图6例证了PLE变体在产物对映体过量中的不同。图6:顺式-3，5-二乙酰氧基环戊-l-烯的水解中不同猪肝酯酶同工酶的产物对映体过量。抑制剂的影响通过用三种酯酶抑制剂的任一种处理粗提物确定新PLE变体的可抑制性。研究苯甲基磺酰氟、氟化钠和毒扁豆碱的影响。在一定时间点取样，通过pNPA测定法确定残余酯酶活性。表8示出结果。表8:在与三种抑制剂-氟化钠、苯甲基磺酰氟和毒扁豆碱-在25。C保温后新PLE同工酶的残余活性[%]。活性通过pNPA测定法确定。___残余活性％抑制剂浓度PLE1(Y-PLE)PLE2PUE3PLE4PUE5NaF1mM5分钟201744648330分钟2115466688苯甲基磺酰氟(PMSF)0.01mM1分钟97877778885分钟858251567630分钟5550772460分钟4636523毒扁豆碱0.01mM1分钟41618390945分钟122581829830分钟7672667权利要求1.Seq.IDNo.2所示酯酶，其具有选自如下一组的至少一个突变位置氧基酸94E96I97A，G98G101L108R113I114P150V154S155T159L160A255F257A258G306P307F308A311L315P323T480A482F484R。2.Seq.IDNo.4、6、8或者10所示的酯酶。3.编码权利要求1和/或权利要求2的酯酶的分离的核酸。4.具有权利要求3的克隆的核酸的基因、载体、质粒和重组微生物。5.权利要求4的重组微生物，其另外含有至少一个克隆的伴侣基因。6.权利要求1和/或2的酯酶在制备对映异构体富集的醇、羧酸和酯中的应用。7.权利要求3的核酸在制备多肽的方法中的应用，所述多肽与SEQ.ID.NO:2多肽相比具有改良的活性和域选择性和域稳定性，所述多肽如下制备i)诱变SEQ.ID.NO:3、5、7或者9，ii)将可得自i)的核酸序列克隆进合适载体中，随后转化进合适表达系统中，及iii)检测和分离具有改良的活性和/或选择性和/或稳定性的所述多肽。全文摘要本发明涉及γPLE的新的突变体，涉及含有其的载体并涉及其在生产对映异构体富集的醇、羧酸和酯中的应用。文档编号C12N9/18GK101641437SQ200880009457公开日2010年2月3日申请日期2008年3月11日优先权日2007年3月23日发明者A·胡梅尔,D·伯特歇尔,E·布吕泽哈贝尔,H·特劳特韦因,K·多德雷尔,U·T·博恩朔伊尔申请人:赢创德固赛有限责任公司