一种榆黄菇新品种选育及配套高产栽培技术研究方法
【专利摘要】一种榆黄菇新品种选育及配套高产栽培技术研究方法，属于食用菌栽培学【技术领域】，涉及怎样在人工条件下培育榆黄菇新品种的方法。主要通过Co60-γ射线辐照诱变，酯酶同工酶电泳试验等方法培育榆黄菇新品种。
【专利说明】一种榆黄菇新品种选育及配套高产栽培技术研究方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食用菌栽培学【技术领域】，涉及怎样在人工条件下培育榆黄菇新品种的 方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 榆黄燕Sing.)色泽艳丽，味道鲜美，因其菌 盖呈黄色，层叠排列，形似皇冠，故而得名金顶侧耳，又称"金顶蘑"、"榆黄蘑"、"玉皇 蘑"或"黄蘑"，营养丰富，具有滋补强壮功能，是著名的珍稀食药用真菌，隶属于担子 菌门（Basidiomycota)、伞菌目（Agaricales)、口蘑科（Tricholomataceae)、侧耳属 。分布于我国东北、河北、四川和云南等地，日本、欧洲、北美洲也有分布，野生 子实体多发生于温暖多雨的夏秋季节，腐生于榆、栎、桦、杨、柳、核桃等阔叶树的枯立木干 基部、伐桩和倒木上。
[0004] 榆黄菇味道鲜美，香味可口，营养丰富，含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素等多 种营养成分。据测定，榆黄菇干燥子实体中粗蛋白含量为41. 5%，Ghosh等人对榆黄菇的蛋 白质量进行了分析，证明其具有很高的营养价值，并且在菌蕾阶段蛋白含量最高；粗脂肪 含量为3. 8%，而且脂肪酸多为不饱和脂肪酸，不仅能降低血脂，多食也不会引起发胖或引发 心血管疾病；氨基酸总含量为28. 7%，包括17种氨基酸，其中有8种含量丰富的人体必需氨 基酸；维生素的含量以B族最高，同时还含有维生素 C、烟酸、泛酸等；此外，应用等离子光 谱结合原子吸收法从榆黄菇中鉴定出12种微量元素，如K、P、Fe、Ca、Na、Mg、Se和Ge等，能 够充分满足人体对矿物元素的需求，其中重金属元素含量极微，不会对人体产生危害。榆黄 菇以其高蛋白、低糖、低脂肪的特点，同其它食用菌一样，已成为人们饮食中必不可少的一 部分。
[0005] 榆黄燕也具有一定的药用价值。据我国的医学文献记载，榆黄燕入药有滋补强壮 之效，可治疗虚弱、萎症、痢疾，民间用于治疗肺气肿。验方中记载，榆黄菇小火焙干，研成细 末，口服可治痢疾；干燥的榆黄菇子实体，用黄酒浸泡9天，9蒸9晒后，小火焙干成黄色，研 末服用，可治疗肌肉萎缩。常食其干菇或鲜菇，能补充赖氨酸不足，有利于病体康复，身体健 壮，并可降低胆固醇。榆黄菇液体培养提取液具有显著的抗疲劳作用及提高机体免疫力作 用下；从子实休中分离出的多糖具有抗肿瘤、增强机体免疫力的作用。张丽萍等研究表明， PC-3经硫酸化后，显著地提高了抗柯萨奇病毒B5活性，而经高碘酸氧化、甲基化，部分酸水 解产物抗柯萨奇病毒B5活性降低。刘晓峰等对榆黄菇的药用活性进行了较详细的研究，证 明其甲醇提取物能显著降低急性高血脂小鼠血清中的血脂和胆固醇含量，具有明显的降血 脂活性。同时榆黄菇水溶性成分一延胡索酸具有平喘活性。另外延胡索酸还具有抗肿瘤、 抗菌、抗电休克，镇痛和镇咳的作用。
[0006] 榆黄菇中的甘露醇能降低颅内压，减轻脑水肿，并具有利尿、止咳平喘功能；尿嘧 啶具有强心活性；烟酸能够促进细胞新陈代谢、降血脂、增强机体免疫力、抗脂质过氧化以 及辅助治疗突发性耳聋和防治急性肾功能衰竭；麦角留醇具有抗佝偻病的作用；微量元 素铁、铜可防治贫血，锰参与造血，锌、锰有抑癌抗癌的作用，硒具有维持人体心脏的正常功 能、防癌抗癌、抗衰老的效用。
[0007] 随着食药用菌产业的发展，关于榆黄菇的研究不断深入。20世纪70年代开始人工 驯化培养，1974年，王柏松等人在长白山区用菇木菌丝分离法获得了其野生菌种，并对其 生物学特性进行观察，此后，在我国东北等地区开始了人工栽培。近年来，在全国范围内已 形成了一定的栽培规模。
[0008] 榆黄菇生长周期约3个月，不耐高温，菌丝生长适温20°C -27°C，最适温度 23°C-27°C。温度达到30°C时，菌丝体的生长受到抑制，生长缓慢且不健壮。32°C时菌丝很 难生长。子实体形成适温15°C -25°C，最适温度为17°C -23°C。温度高于24°C后，产量下降。 栽培榆黄菇的原料来源广泛，可因地制宜，玉米芯、玉米发酵液、蔗渣、稻草、酒糟、棉籽壳等 均可。一般来说，以单一原料作为培养料，生物学效率低，所以多采用混合料进行栽培。培养 料中添加适量的麸皮或米糠，可以提高氮源营养，从而增加产量。其中Ragunathan等人用 各种不同的农业废料栽培榆黄菇，研究培养料与产量及生物有效率之间的关系，结果发现， 以蔗渣为栽培原料时，菌丝体产量最高；以稻草和蔗渣（1:1)混合物为栽培原料时，生长率 和广量达到最商；以稻草为栽培原料时，蛋白质和氣基酸含量最商。此外，Nallathambi等 用不同方式处理侧耳属真菌的栽培基质，观察其对酶活性的影响及与产量间的关系，结果 表明，榆黄菇的栽培基质用化学方法处理后，纤维素酶活性增强，产量增加，同时菌丝体发 生较早。
[0009] 据各地环境条件的不同，栽培方式多种多样，有仿野生覆土栽培法、阳畦栽培法、 瓶栽法、菌块栽法、露地栽培法、床式栽培和大棚畦栽培等方法。其中，仿野生覆土栽培法简 单易行，管理方便，发菌和出菇的湿度极易达到要求，所以产品质量和生物学效率最高，经 济效益最好；阳畦栽培法主料是棉籽壳或玉米芯，具有操作简单，易管理，投资少，效益高的 特点，生物学效率可达100%。杨儒钦根据生产实践，总结出榆黄菇的周年栽培技术，春季、冬 季人为创造适宜的生长环境，夏秋季节可利用自然温度进行，一年四季均可出菇，提高了经 济效益。
[0010] 榆黄菇属于"天然、营养、安全、多功能"食品，既是营养丰富的副食品，又是保健食 品及天然药物的重要原料来源。符合国际上近年来对食品"三低一高"的新要求。榆黄菇 能最大限度利用自然资源，不增加环境负荷，符合生态农业发展的要求。通过对营养成分及 药用成分的大量研究发现，榆黄菇不仅营养丰富，而且富含各种活性成分，使其作为食药用 真菌具有更广阔的发展前景。
[0011] 榆黄菇不仅营养丰富，还具有提高人体免疫功能、抗衰老等作用，是一种很有发展 前途的食药用菌。目前榆黄菇的栽培已经成功，大量栽培榆黄菇既可以调整我国农村的产 业结构，也是广大农村致富的首选项目之一。但一直以来，榆黄菇或者将野生菌株直接用于 生产，或者经过筛选驯化后作生产用菌种，菌种选育研究极少。这势必会阻碍榆黄菇的进一 步开发利用。为促进食用菌产业的可持续发展，改变目前榆黄菇以野生菌种进行商业化生 产的尴尬局面，开发适于生产需要的高产优良品种已经成为当务之急。有必要利用新技术 研究和选育出优质品种，同时对栽培的榆黄菇进行系统的生物学研究，确定质量标准，进一 步实现规范化栽培。
【发明内容】
[0012] 一、在试验菌株资源及收集 试验收集的榆黄菇菌株及来源如下： ① 榆黄菇818,鲁东大学食用菌工程技术研究中心自存； ② 榆黄菇05 - 1，引自中国农业大学食用菌所； ③ 榆黄菇05 - 2,引自黑龙江伊春市食用菌中心。
[0013] 二、试验菌株的筛选与纯化 ①将保藏的榆黄菇菌株接入PDA斜面培养基上，于25°C下培养8 d。
[0014] ②用接种刀切取上述斜面培养基上菌丝最前端部分再接入PDA斜面培养基上，于 25°C下培养6 d，选取长势良好的斜面菌种试验备用。
[0015] 三、Co6°- γ射线辐照诱变 采用尖端菌丝Co6°y射线辐照诱变的方法，以期获得榆黄菇优良菌株。
[0016] 3.1材料与方法 3. 1. 1实验材料：以榆黄燕818为试验出发菌株，Co6°-γ射线福照处理采用山东省农 科院原子能研究所的钴源进行。
[0017] 培养基：PDA斜面培养基。
[0018] 3.1.2 方法 3. 1. 2. 1菌丝培养将榆黄菇菌种接种到试管内的斜面培养基上，放在25°C恒温培 养48h后取出，选择菌丝长势一致的斜面菌种进行辐照处理。
[0019] 3. 1.2.2 Co6°-Y射线辐照处理将试管培养菌种按照不同剂量、不同剂量率分组 进行辐照处理。辐照剂量分别为：300Gy、600Gy、900Gy、1200Gy;每一剂量组再分成2组， 每组剂量率分别为26. lGy/h和43. 5Gy/h。对照组不经辐照处理。
[0020] 3.2.2.3诱变株筛选①将经过辐照处理的斜面菌种在25°C恒温继续培养10d 左右，观察菌丝恢复生长情况，选择菌丝长速、色泽变化或菌丝形态变化的菌株进行拮抗 试验，挑取经过不同辐照处理的菌丝接种于空白平板培养基的一侧，另一侧接种对照菌 丝，置于25°C恒温培养10d，观察拮抗线产生情况。
[0021] ②将拮抗线产生明显的菌株进行扩大培养，收集菌丝进行酯酶同工酶电泳试验， 通过酯酶同工酶谱的差异进一步验证变异株。
[0022] 3. 2结果与分析 3.2. 1 Co6°y射线辐照处理结果 所进行不同剂量辐照后的菌丝均呈现菌丝变色，生长暂停现象，经过一段时间的培养 又萌发出白色菌丝。整体趋势为随着辐照剂量的增加，菌丝重新萌发所需时间延长，初生 菌丝较弱。
[0023] 在本实验条件下，剂量率高的处理均较剂量低相同，但剂量率低的处理恢复生长 快，初生菌丝较壮。在辐照剂量300Gy和600Gy处理的菌丝变色较浅，重新萌发时间短， 恢复生长的菌丝粗壮，呈浓密棉花状，气生菌丝增多。而剂量在900Gy和1200Gy处理的 菌丝变色较深，重新萌发时间明显延长，且恢复生长的菌丝较细弱，这表明在此剂量下菌 丝受辐照损伤较大，严重影响了菌丝生长。因此，采用600Gy的辐照剂量对榆黄菇尖端菌 丝多批诱变。
[0024] 但随着传代次数的增加，菌丝的长速规律发生变化。表1显示了转代10代后的 菌丝长速： 表1 C〇6°Y射线辐照处理结果
【权利要求】
1. 一种采用射线辐射照诱变育种的方法，其特征在于包括 (1) 菌丝培养将榆黄菇菌种接种到试管内的斜面培养基上，放在25°C恒温培养48h 后取出，选择菌丝长势一致的斜面菌种进行辐照处理； (2) Co6°-y射线辐照处理将试管培养菌种按照不同剂量、不同剂量率分组进行辐照 处理，辐照剂量分别为：300Gy、600Gy、900Gy、1200Gy;每一剂量组再分成2组，每组剂量率 分别为26. lGy/h和43. 5Gy/h，对照组不经辐照处理； (3) 诱变株筛选 ① 将经过辐照处理的斜面菌种在25°C恒温继续培养10d左右，观察菌丝恢复生长情 况，选择菌丝长速、色泽变化或菌丝形态变化的菌株进行拮抗试验，挑取经过不同辐照处 理的菌丝接种于空白平板培养基的一侧，另一侧接种对照菌丝，置于25°C恒温培养10d， 观察拮抗线产生情况； ② 将拮抗线产生明显的菌株进行扩大培养，收集菌丝进行酯酶同工酶电泳试验，通过 酯酶同工酶谱的差异进一步验证变异株。
2. -种酯酶同工酶标记榆黄燕菌株的方法，其特征在于包括 (1) 样品的制备挑选榆黄菇菌丝用Tris-HCl缓冲液（0. 1M，pH8.0)研磨，冷冻（_2°C) 离心（1600r/min离心lOmin)，取上清，将上清置于-20 °C冰箱中保存备用； (2) 电泳条件采用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳法，分离胶浓度为7%，pH8. 9,浓缩胶浓度为 2. 5%，pH6. 7,点样量150 μ g (双缩脲法测定蛋白的含量)，电泳缓冲液为Tris-Gly系统（pH 8. 3 )，起始电流10毫安，约1. 5h后，将电流升至48毫安，恒流4-5h，待溴酚兰指示剂迁移至 下端约0. 5cm处停止电泳； (3) 染色照相电泳完毕后，酯酶同工酶用α-萘酯，β-萘酯和坚牢蓝配制的染液，于37 °C染色10_15min，待显出清晰酶带后取出，用蒸馏水漂洗几次，用GIS-2020D全自动数码凝 胶成像分析系统（白光透射）照相。
3. -种DNA分子标记榆黄菇品种鉴定方法，其特征在于包括菌丝体准备、基因组总DNA 抽提和引物、ITS序列的PCR反应、RAPD分析的PCR反应体系和程序，具体步骤为： (1) 采用液体PDA培养基深层培养榆黄菇菌丝体，长好后过滤冷冻备用； (2) 取0. 2g液氮研磨的菌丝体粉末，放入1. 5mL以灭菌的EP管，加入600uL已65°C预 热的2 X CTAB提取液，再加入1. 2 μ L的巯基乙醇，充分混匀，65°C水浴45min，期间定期晃动 混匀，将EP管从水浴中拿出，室温冷却后，再在该EP管中加入600yL的氯仿：异戊醇（24 : 1)，振荡混勻5-10min，8000r/min离心lOmin，取上清，重复抽提两次。
4. 加0. 8倍体积的冷的异丙醇，混匀，-20°C放置15-30min。 5. 10000r/min离心8min去沉淀，70%乙醇清洗2次，风干。
6. 力卩 100yLTE(pH8.0)溶解。
7. 加入 2 μ L RNAase (10mg/mL)，37?温箱中 30min。
8. 加等体积氯仿：异戊醇（24 : 1)，振荡混勻，10000r/min离心10min取上清。
9. 加入2倍的冷的无水乙醇和1/10的3M NaAc，-20°C放置15-30min。 10. 10000r/min 离心 10min。
11. 取沉淀，70%乙醇清洗2次，风干，加20 μ L TE (pH8. 0)溶解，4°C保存。 12. ITS测序引物：ZITS1 TCCgTAggTgAACCTgCg ZITS4 TCCTCCgCTTATTgATATgRAPD 引物。
13. (3)ITS序列的PCR反应在0. 5mLEppendorf管内配制50yL反应体系，混匀，各 反应均加10 μ L石蜡油。
14. 按下述程序进行扩增：①95°C预变性5min ;②94°C变性lmin ;③55°C复性lmin ; ④72°C延伸lmin ;⑤重复步骤②?④32次；⑥72°C延伸lOmin。
15. (4)以Williams等（1990)的RAPD反应体系为基础，设置25 μ L PCR反应体系，对 酶质量及用量、Mg2+浓度、DNA模板浓度、dNTPs浓度等对扩增效果影响较大的因素进行 了对照分析，最后确定反应体系。
16. 反应混合物用20-30 μ L矿物油覆盖后，在PTC-100? PCR仪上进行扩增，根据文 献综合分析，确定以38°C为退火温度，建立反应程序。
【文档编号】A01H1/06GK104041406SQ201310517500
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】蔡德华 申请人:鲁东大学