三倍体丹参脱毒新品种的快速选育方法
【专利摘要】本发明涉及一种三倍体丹参脱毒新品种的快速选育方法。包括：取三倍体丹参茎尖或新生幼叶进行脱毒处理后作为组织培养材料，接种在1/2MS培养基上，在20-25℃，光强度3000Lux，光周期14小时/天条件下进行培养，待叶缘切割面分化出丛生芽；进行分瓶扩大繁殖，每瓶3-5棵苗；新根3-5公分时进行瓶苗移栽，按常规三倍体丹参大田种植方法进行田间栽培管理；测定丹参酮ⅡA、丹酚酸B和隐丹参酮含量；根据三倍体丹参脱毒新品种药材产量和主要药物有效成分含量测定结果确定三倍体丹参脱毒新品种的选育结果。本发明二年内可选育出三倍体丹参脱毒新品种，解决了因生物及非生物胁迫而引起的丹参新品种退化问题，理论上讲，这种脱毒三倍体丹参优势可以保持数百年。
【专利说明】三倍体丹参脱毒新品种的快速选育方法
【技术领域】 [0001] 本发明涉及一种植物新品种的选育方法，特别是三倍体丹参脱毒新品种(系)的快速选育方法。
【背景技术】
[0002]丹参miltiorrhiza Bunge)是我国传统医药中应用最早、最广泛的中药之一，是著名的活血化淤药，在临床上被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病。随着我国人口老龄化，心血管疾病成为危害人类健康的主要疾病，发病率逐年上升，对药物需求量增大。目前我国以丹参为原料生产的复方中药有100多种，对优质丹参药材的需求量巨大。自上世纪60~70年代，各地野生丹参转变家种成功后，生产有了较大发展，1978年收购4 000吨，销售6500吨，2007年产量达23000~24000吨，已成为一种重要的栽培药用植物。最近，中药界普遍把丹参视为中药的“模式中药”，中国科学院药用植物研究所还启动了丹参基因组测序工作，突显了丹参作为传统中药研究的地位。然而，随着栽培丹参的发展，凸显我国丹参遗传改良与新品种培育中的问题，主要有:①与其它栽培作物相比栽培丹参尚处在起步阶段，目前我国还没有一个通过杂交选育出来的丹参新品种，现有栽培丹参都是由野生直接变家种来，野生、半野生、栽培丹参之间的遗传相似系数在0.75~0.8之间，说明我国栽培丹参中很少有变异的积累-人工选择；②现在全国还没有一个公认的丹参主栽品种，只有四川从现有混杂的川丹参群体中经过系统筛选分离纯化出了大叶型(SA)和小叶型(SI)两个品种。因此，我国丹参的遗传改良与新品种培育势在必行，寻找一条有效的丹参新品种培育方法已是当务之急。近年来很多单位都已开展了有关丹参杂交育种及其相关的基础研究。高山林(2006)最先培育了丹参四倍体新品种，丹参产量提高了 50%，有效化学成分提高了 50~80%。江苏省从栽培品种混合种植的天然杂交当代(Fl)中选出皱叶、单叶、小叶和原型4个品系新材料，正在扩大种植。河南省从裕丹参变异群体中已选出5个变异类型。山东省在对丹参开花与繁育特性研究的基础上，提出直接利用丹参的自然变异进行系统育种是丹参初期最有效的育种方法。陕西省已筛选到丹参雄性不育系Sh-B的三个不育类型Sh-Bl、Sh-B2、Sh-B3。然而，至今尚未见丹参杂交育种取得突破性进展。
【发明内容】
[0003]本发明提供的是一种三倍体丹参脱毒新品种的快速培育方法，可以克服常规新品种选育周期长，需要5-8年的缺陷。本发明选育周期只需2年。它是建立在本项发明人早先发明的“丹参三倍体培育方法”的基础上，将产生变异的三倍体丹参或由于外界胁迫造成品种退化的三倍体丹参的体细胞作为外植体，采用组织培养快繁与脱毒技术相结合的方法，将其快速繁殖起来。不但第二年就可进行新品种比较试验，而且经过脱毒处理，恢复了三倍体丹参本来就存在的多倍体优势和杂种优势，三倍体丹参脱毒新品种表现生长旺盛(图5)，药材产量和药物有效成分都能获得显着提高。
[0004]本发明提供的是一种三倍体丹参脱毒新品种的选育方.法，包括以下步骤:以三倍体丹参茎尖或新生幼叶为外植体，先进行脱毒处理，然后进行组织培养快繁。要使瓶苗达到一定数量，第2年就可进行三倍体丹参脱毒新品种评比试验，选育出药材产量提高20%以上，药物有效成分丹酚酸B和丹参酮II A提高0.5-1倍以上，综合生物性状好的三倍体丹参脱毒新品种。
[0005]本发明提供的是一种三倍体丹参脱毒新品种的选育方法，包括以下步骤:
⑴取材:以下3种材料来源之一，均可进行三倍体丹参毒新品种的选育工作:①在三倍
体丹参大田中新发现的变异植株茎尖或新生幼叶(图1);②三倍体丹参杂交(2x早X4x古或4x早Χ2χ ?)当代种子幼苗茎尖或幼叶大田生产种植8年以上的三倍体丹参茎尖或新生幼叶；
⑵脱毒处理:在无菌操作条件下先用75%酒精消毒I分钟，再用0.1%升汞消毒10分钟，无菌蒸懼水冲洗5遍；
⑶光照培养:在光照周期14小时/天，光强度3000Lux，室温20-25°C条件下进行培养； ⑷扩大繁殖:待丛生芽生长出1-2片叶时，进行分瓶扩大繁殖，每瓶分装3-5棵苗；
(5)瓶苗移栽:待瓶苗长出新根，根长3-5公分时，进行瓶苗移栽。移栽前2天打开瓶盖进行练苗； (6)移栽苗管理:刚移出的瓶苗要加强管理，成活率可达90%以上；
⑴三倍体丹参脱毒新品系(种)品种评比试验:按常规新品种评比试验要求进行，每个新选育出来的三倍体丹参脱毒新品(种)大田种植面积要达到2-3亩；
⑶三倍体丹参脱毒新品系(种)主要药物有效成分测定:按《药典》规定标准，测定丹参酮II A和隐丹参酮含量。
[0006]⑶三倍体丹参脱毒新品种的确定:根据三倍体丹参脱毒新品系大田种植药材产量和主要药物有效成分含量测定，最后才能确定三倍体丹参脱毒新品种的选育成功。
[0007]按本发明的以上程序，2年内即可选育出药材产量提高20%以上，药物有效成分丹酚酸B和丹参酮II A提高0.5-1倍以上，综合生物性状好的三倍体丹参脱毒新品种，并科学的解决了因生物及非生物胁迫引起的三倍体丹参品种退化而造成的丹参药材减产难题。
[0008]【专利附图】
【附图说明】:
图1:在三倍体丹参大田中发现的变异株。
[0009]图2:三倍体丹参取材与脱毒处理；(a)取材，(b)脱毒。
[0010]图3:三倍体丹参组织培养与克隆快繁。
[0011]图4:三倍体丹参瓶苗移栽。
[0012]图5:三倍体丹参脱毒新品种大田种植生长势。
[0013]图6:三倍体丹参脱毒新品种根部药材。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]本发明突出的特点和显着进步可以从下述实例中得以体现，但它不会对本发明作任何限制。
[0016]本发明提供的是一种三倍体丹参脱毒新品种的选育方法包括以下步骤:
取材是关健，所取的材料必须是新发现的三倍体丹参变异植株茎尖或新生长幼叶、三倍体丹参杂交当代种子幼苗新生长的幼叶或大田生产8年以上出现明显品种退化的三倍体植株茎尖或新生幼叶。
[0017]脱毒处理必须彻底，要严格按着无菌操作手续，彻底消灭接种材料上可能携带的细菌和病毒。在超净台内将切取的材料先用75%酒精消毒I分钟，再用0.1%升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，再将材料接种在1/2MS培养基上，进行培养。
[0018]光照培养，光照培养室除满足光照培养周期14小时/天，光强度3000Lux，室温20-25°C条件外，还要保持光照培养室的湿度在50%左右、通风和清洁卫生，减少外来污染。
[0019]扩大繁殖的空间很大，根据扩大繁殖的数量，时间可能拉的很长。因为取材的数量直接影响着扩大繁殖种苗的数量，为保证三倍体丹参脱毒种苗扩繁15000棵，取材步骤必须有一定数量。
[0020]瓶苗移栽，待瓶苗长出3-5公分新根时，进行瓶苗移栽，移栽前2天打开瓶盖进行练苗。瓶苗移栽方法和营养土对瓶苗移栽成活率有很大影响。移栽前要把培养基洗净，移栽的基质要事先经灭菌灵消毒堆肥发酵处理过的磨菇泥渣与砂土按3:1混合基质，每个营养钵移栽一棵苗。移栽瓶苗要加强管理，移栽第一周50%光照,保持50-70%湿度,成活率可达90%以上。
[0021]三倍体丹参脱毒新品系(种)新品种评比试验，按常规新品种评比试验要求进行。一般农作物新品种评比试验设三亇重复，每个重复0.5-1亩地。药用植物新品种评比试验也可参照此要求进行,设三个重复,每个重复I亩地,每亩5000棵苗。
[0022]主要药物有效成分测定，按《中华人民共和国药典》规定标准，丹参酮II A不得少于0.2 %，丹酚酸B不得少于3.0%。
[0023]三倍体丹参脱毒新品种的确定。三倍体丹参脱毒新品种的确定，要根据药材产量、主要药物有效成分含量和主要生物学性状三方面来确定。一般药材产量增产20%以上，丹参酮II A提高0.5-1倍以上，丹酚酸B提高0.5倍以上，综合生物学性状好，抗生物及非生物胁迫能力强的三倍体丹参脱毒新品系可以确定为三倍体丹参脱毒新品种。
[0024]实施例1 2012年10月在三倍体丹参生产大田中发现2棵发生变异的三倍体丹参植株。我们暂命名为:RY1、RY2。随后，我们采集这2棵变异植株的新生幼叶，进行脱毒处理和组培快繁:首先，用流水冲洗幼叶，洗净泥砂，在超净工作台内，按无菌操作程序，用75%酒精消毒30-60秒一0.1 %升汞消毒15分钟，无菌水冲洗5次，用解剖刀将材料切割成1-2平方厘米大小，接种在1/2MS + 6BA0.5-lmg/L培养基上，直接诱导丛生芽，接种20-30天后，待大量丛生芽产生后，进行试管苗的大量克隆增殖，待丛生芽生长出真叶时，转接到1/2MS + IBAO0 2mg/L培养基上诱导生根，在光照12小时/天，光强度3000Lux，室温25°C条件下培养，待试管苗新根长至1-2厘米时，打开瓶盖，练苗3-5天，进行瓶苗移栽，用长镊子取出瓶苗，洗去培养基，移入事先堆积发酵好的营养土中(营养土为蘑菇泥渣与砂土 3:1混合，用多菌灵消毒，堆积发酵)，移栽苗的管理，移栽的瓶苗前20天，要半遮光，保持50-70 %湿度，成活率可达90%以上。2012年12月-2013年4月移栽的瓶苗放在不加温的温室内，温度保持在5°C以上。2013年4月20日移栽于大田中(图4)，三倍体丹参脱毒新品种表现生长旺盛(图5)。2013年11月11日收获三倍体丹参脱毒新品种。经测算丹参药材产量折合2000公斤/亩，丹参酮IIA、丹酚酸B、隐丹参酮均达到或超过《中华人民共和国药典》规定标准。表1为三倍体丹参脱毒新品系(种)根部药材药物有效成分测定结果:采用高效液相色谱法测定其含量，主要以丹酚酸B、丹参酮II A为测定指标)
表1三倍体丹参脱毒新品系(种)根部药材药物有效成分测定数据
【权利要求】
1.一种三倍体丹参脱毒新品系(种)的快速选育方法，其特征在于包括以下步骤: ⑴取材，选自:①在三倍体丹参大田中新发现的变异植株茎尖或新生幼叶(图1);②三倍体丹参杂交(2x早Χ4χ ?或4x早Χ2χ ? )当代种子幼苗茎尖或幼叶大田生产种植8年以上的三倍体丹参茎尖或新生幼叶； ⑵脱毒处理:在无菌操作条件下，进行材料的脱毒处理； ⑶组织培养:按无菌操作程序，将材料接种在1/2MS培养基上，在20-25 °C，光强度3000LUX，光周期14小时/天条件下进行培养，20天后在叶缘切割面可分化出丛生芽；⑷组培苗克隆繁殖:待丛生芽分化出幼叶时，进行分瓶扩大繁殖，每瓶以3-5棵苗为 且； (5)瓶苗移栽:待新根3-5公分时进行瓶苗移栽，移栽前2-3天先打开瓶盖练苗； (6)移栽苗管理:加强移栽苗管理； ⑴三倍体丹参脱毒新品种评比试验:按通常三倍体丹参大田种植方法进行田间栽培管理； ⑶三倍体丹参脱毒新品系(种)主要药物有效成分测定:按《中华人民共和国药典》规定，对三倍体丹参脱毒新品系(种)丹参酮II A、丹酚酸B和隐丹参酮进行测定； ⑶三倍体丹参脱毒新品种的确定:根据三倍体丹参脱毒新品种药材产量和主要药物有效成分含量测定结果，最后确定三倍体丹参脱毒新品种的选育结果。
2.一种三倍体丹参脱毒新品种的快速选育方法，其特征在于包括以下步骤: ⑴取材:选自以下三种材料来源之一:①在三倍体丹参种植大田中新发现的变异植株的茎尖或新生幼叶；②三倍体丹参杂交(2x早Χ4χ ?或4x早Χ2χ ? )当代种子幼苗之新生幼叶大田栽培生产8年以上三倍体丹参植株茎尖或新生幼叶；按无菌操作程序，在超净工作台上，用解剖刀切取1-2平方厘米大小的叶片，进行脱毒处理； ⑵脱毒处理:在超净台内将切取的材料先用75%酒精消毒I分钟，再用0.1%升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，将材料接种在1/2MS培养基上，在组织培养室中进行光照培养; ⑶光照培养:⑵所述的光照培养是在周期14小时/天，光强度3000Lux，室温20-25°C条件下进行培养；在上述条件下培养，经过20天沿接种材料切割面会产生大量丛生芽；⑷扩大繁殖:待⑶所述的丛生芽生长出1-2片叶时，进行分瓶扩大繁殖，每瓶分装3-5棵苗； (5)瓶苗移栽:待瓶苗长出新根，根长3-5公分时，进行瓶苗移栽；移栽前2天打开瓶盖进行练苗； (6)移栽苗管理:刚移出的瓶苗要半遮光，保持50-70%的湿度，成活率达90%以上； ⑴三倍体丹参脱毒新品种品种评比试验:按常规新品种评比试验要求进行，每个新选育出来的三倍体丹参脱毒新品种大田种植面积要达到1.5-3亩地； ⑶三倍体丹参脱毒新品种主要药物有效成分含量测定:按《中华人民共和国药典》规定标准，测定丹参酮II A、丹酚酸B和隐丹参酮含量； ⑶三倍体丹参脱毒新品种的确定:根据三倍体丹参脱毒新品系大田种植药材产量和主要药物有效成分含量测定，最后确定三倍体丹参脱毒新品种的选育结果。
3.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于所述的取材是选取三倍体丹参种植大田中新发现的变异植株的茎尖或新生幼叶。
4.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于步骤③要保持光照培养室的湿度在50%，并保持通风和清洁卫生。
5.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于步骤④扩大繁殖数量为15000棵。
6.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于步骤(5)所述的瓶苗移栽方法为:移栽前要把培养基洗净，移栽的基质要事先经灭菌灵消毒堆肥发酵处理过的磨菇泥渣与砂土按3:1混合基质,每个营养钵移栽一棵苗。
7.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于步骤⑦所述的评比试验设三亇重复，每个重复I亩地，每亩5000棵苗。
8.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于步 骤(8)主要药物有效成分测定，丹参酮II A不得少于0.2%，丹酚酸B不得少于3.0%。
9.按照权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于步骤⑶所述的三倍体丹参脱毒新品种的确定:药材产量增产20%以上，丹参酮II A提高I倍以上，丹酚酸B提高0.5倍以上。
【文档编号】A01H4/00GK103583367SQ201310582544
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】陈瑞阳 申请人:陈瑞阳