一种高产多糖的新菌种及其栽培方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种高产多糖的新菌种，所述菌种为裸伞属的新菌种Gymnopilus lepidotus HMGIM?E140524，保藏编号为CCTCC M 2015747。该菌种的栽培方法包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，栽培培养。经证实，本发明提供的新菌种CCTCC M 2015747的提取物具有高的总多糖含量，食用菌多糖是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老、调节免疫的活性多糖，在保健和医药上有着广泛的应用，并且该新菌种的提取物对正常细胞没有杀伤性，具有良好的安全性，这表明本发明的新菌种在食品及医药领域具有重要的开发利用前景。CCTCC：M 201574720151214
【专利说明】
一种高产多糖的新菌种及其栽培方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高产多糖的新菌种，具体涉及一种裸伞属的高产多糖的新菌种。
【背景技术】
[0002] 裸伞属真菌Gymnopilus lepidotus Hesler由Karsten在1879年建立，属于世界分 布属，隶属于真菌界(Fungi)，担子菌门（Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，伞菌 目（Agaricales)，球盖^^々(Strophariaceae)，目前有200多个种，大多数都具有神经毒素 成分，根据文献记载，目前只有条缘裸伞(Gymnopilus liquiritiae)有一定的药用价值。
【发明内容】
[0003] 在第一方面，本发明提供一种高产多糖的新菌种，所述菌种为裸伞属的新菌种 Gymnopilus lepidotus HMG頂-E140524,保藏编号为CCTCC Μ 2015747。
[0004] 本发明提供的高产多糖的新菌种分离自海南省陵水县吊罗山森林公园阔叶树倒 木上，经形态学及分子生物学鉴定为Gymnopilus lepidotus的新菌种，通过进行组织分离 得到原始菌株，命名为HMG頂-E140524,已于2015年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中 心(简称CCTCC，湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学），保藏号为:CCTCC Μ 2015747。
[0005] 本发明提供的新菌种Gymnopilus lepidotus HMGIM-E140524,其子实体水提取物 的总糖含量大于2%，进一步地，大于3%，进一步地，大于4%。
[0006] 在第二方面，本发明提供一种上述高产多糖的新菌种的栽培方法，所述方法包括 组织分离菌种后制作母种，制作原种，栽培培养。
[0007] 在一个优选的实施例中，一种高产多糖的新菌种的栽培方法，包括：
[0008] (1)采集组织分离的菌种HMGM-E140524，将菌种接种至母种培养基，20-28 °C培 养，直至长出菌丝得到母种；
[0009] (2)将母种接种至原种料，20-28Γ培养，直至长出菌丝得到原种；
[0010] (3)将原种接种至栽培料袋中，20-28°C避光培养，直至菌丝长满栽培料袋，去除栽 培料袋的套环，调节空气湿度在60-65%以上，每天100-1501X照射12h，80-90天后得到成熟 子实体。
[0011]在一个优选的实施例中，所述母种培养基包括琼脂20-25g/L、优选为20g/L，土豆 200-250g/L、优选为200g/L，葡萄糖 15-20g/L、优选为20g/L，KH2P04 1.5g/L，MgS〇4 〇.5g/L， 维生素 b微量，蛋白胨10_12g/L、优选为10g/L，其余为水。
[0012] 在一个优选的实施例中，所述原种料按照质量百分比计包括95-98%高粱粒、优选 为98%高粱粒，2-3 %碳酸钙、优选为2%碳酸钙，所述原种料的含水量为60-65 %，优选为 60% 〇
[0013] 在一个优选的实施例中，上述原种料中的高粱粒为煮熟的高粱粒，例如包括将高 粱粒在沸水中煮熟得到。
[0014] 在一个优选的实施例中，所述栽培料按质量百分比计包括棉籽壳73-78%、优选为 73%，麸皮20-25%、优选为25%，碳酸钙2-3%、优选为2%，所述栽培料的含水量为60-65%、优选为65 %。
[0015]在一个优选的实施例中，所述栽培料袋制作方法包括:将栽培料装入栽培袋，盖上 套环。
[0016]在第三方面，本发明还提供采用上述栽培方法得到的高产多糖新菌种。
[0017] 在第四方面，本发明还提供上述高产多糖新菌种用于制备调节免疫或抗衰老的保 健品或药物的应用。
[0018] 在第五方面，本发明还提供上述高产多糖新菌种的提取物用于制备调节免疫或抗 衰老的保健品或药物的应用。
[0019] 经过试验证实，本发明提供的新菌种CCTCC Μ 2015747的提取物具有高的总多糖 含量，食用菌多糖是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老、调节免疫的活性多 糖，在保健和医药上有着广泛的应用，并且该新菌种CCTCC Μ 2015747的提取物对正常细胞 没有杀伤性，具有良好的安全性，这表明本发明的新菌种CCTCC Μ 2015747在食品及医药领 域具有重要的开发利用的前景。
【附图说明】
[0020] 图1是实施例1栽培得到的Gymnopilus lepidotus HMGIM-E140524的子实体整体 图。
[0021] 图2是实施例1栽培得到的Gymnopilus lepidotus HMGIM-E140524的子实体菌盖 图。
【具体实施方式】
[0022]以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0023] 裸伞属的新菌种Gymnopilus lepidotus HMGIM-E140524
[0024] 一种裸伞属的高产多糖的新菌种Gymnopilus lepidotus HMGIM-E140524,分离自 海南省陵水县吊罗山森林公园阔叶树倒木上，经形态学及分子生物学鉴定为Gymnopilus lepidotus的新菌种，通过进行组织分离得到原始菌株，命名为HMG頂-E140524,已于2015年 12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，湖北省武汉市洪山区八一路，武汉 大学），保藏号为:CCTCC Μ 2015747。
[0025] 在一个实施例中，对新菌种CCTCC Μ 2015747的子实体水提取物进行总糖含量测 定，显示其总糖含量大于2%，进一步地，大于3%，进一步地，大于4%，例如4.35%。
[0026] 新菌种CCTCC Μ 2015747的子实体具有以下形态学特征：
[0027]子实体单生或散生于亚热带或热带森林里倒下的树干上；
[0028]菌盖6-32mm，中部凸起，钟形至近脐状突起，表面有纤维状粗糙附着物，或带有直 立、近似直立、匍匐的鳞毛状物质，子实体幼小时，菌盖完全覆盖着一层绵状毛，菌盖干，黄 色、橙黄色或铁锈色，鳞片葡萄酒红色、暗红至铁锈色，菌盖边缘甚至会有短条纹，薄，菌褶 贴生，波纹状，稀疏，边缘稍具毛缘，黄色至橘黄色；
[0029]菌柄9-30*l-5mm，圆柱形，均匀，纤维质，具有纵向条纹，残存着部分绒毛，同菌盖 颜色或具有霜白色，偶尔受到破坏后会变成深红褐色，内部稍空心，填充着一些菌丝；
[0030] 菌幕纤维质，幼小的子实体会稍厚，但随着子实体生长菌幕会渐渐脱落，白色至黄 色；
[0031] 菌肉白色、黄色至金黄色，靠近菌柄位置会显现出红棕色;气味香甜，口感美味；
[0032] 使用氢氧化钾染色处理，菌盖中央会变成葡萄酒红色，菌盖边缘深褐色，菌褶会变 暗褐色直至黑色，菌柄深褐色，菌盖的菌肉会变成微红色，菌柄菌肉会变金黄色，孢子印为 铁镑黄色；
[0033] 孢子5.6-7.6*4-4.8μπι，椭圆形，很少近球形，孢子壁中等厚度，具有疣状突起，无 萌发孔，黄褐色至橙褐色；
[0034]担子20-30 · 4*5 · 6-8μπι，侧囊体22 · 4-39 · 2*5 · 6-9 · 6μπι，尖端2 · 4-3 · 2μπι，一侧膨大， 近似纺锤形，橙色至黄色，缘囊体16-29.6*5.2-8.4μπι，尖端2.4-4.4μπι，烧瓶状，颜色同侧囊 体，子实层菌髓近平行型；
[0035]菌盖菌髓辐射状，菌丝薄，透明至微黄色，无盖囊体，柄生囊状体20-64*4-12.8μπι， 具有锁状联合。
[0036] 提取新菌种CCTCC Μ 2015747的菌丝体DNA，进行ITS序列测序，鉴定其属于裸伞属 Gymnopilus lepidotus Hesler菌种，结合形态学及分子生物学鉴定，其属于裸伞属的新菌 种，，命名为HMG頂-E140524。
[0037] 新菌种CCTCC Μ 2015747的菌丝在普通PDA培养基上生长中速，菌丝生长温度为 20-28 °C，优选温度为25 °C，菌丝生长pH6-7，优选pH6.5，常温保藏菌种即可。
[0038]裸伞属的新菌种HMGIM-E140524的其栽培方法
[0039] 一种新菌种CCTCC Μ 2015747的栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作原 种，栽培培养。
[0040] 在一个优选的实施例中，一种高产多糖的新菌种的栽培方法，包括：
[0041] (1)组织分离菌种后制作母种：
[0042]采集组织分离的菌种HMGM-E140524,将菌种接种至灭菌的母种培养基（例如121 °C高压灭菌25min)，20-28°C (例如25°C)培养，直至长出菌丝得到母种，其中，菌丝覆满培养 基得到母种为宜，通常需要12-20天，例如约12天；
[0043]其中，在一个优选的实施例中，所述母种培养基包括琼脂20-25g/L、优选为20g/L， 土豆200-250g/L、优选为200g/L，葡萄糖 15-20g/L、优选为20g/L，KH2P〇4 1.5g/L，MgS〇4 0.5g/L，维生素 b微量，蛋白胨10-12g/L、优选为1 Og/L，其余为水；
[0044] (2)制作原种：
[0045] 将母种接种至灭菌（例如121°C高压灭菌25min)的原种料，20-28°C (例如25°C)培 养，直至长出菌丝得到原种，其中，以菌丝覆满原种料得到原种为宜，通常需要20-60天，例 如约25-30天；
[0046]其中，原种料按照质量百分比计包括95-98%煮熟的高粱粒、优选为98%煮熟的高 粱粒，2-3%碳酸钙、优选为2%碳酸钙，所述原种料的含水量为60-65%，优选为60% ;
[0047] (3)栽培培养：
[0048]将原种接种至栽培料袋中，20_28°C(例如25°C)避光培养，直至菌丝长满栽培料 袋，去除栽培料袋的套环，调节空气湿度在60%以上，每天100-1501X照射12h，80-90天后 (例如约80天)得到成熟子实体；
[0049] 其中，栽培料按质量百分比计包括棉籽壳73-75 %、优选为73 %，麸皮20-25 %、优 选为25%，碳酸钙2-3%、优选为2%，所述栽培料的含水量为60-65%、优选为65% ;
[0050] 其中，所述栽培料袋制作方法包括:将栽培料充分拌匀后装入栽培袋聚乙烯折角 袋栽培袋，盖上套环，高压灭菌(例如128°C条件下灭菌120min)。
[00511通过本发明提供的栽培方法，可以实现对新菌种CCTCC Μ 2015747的栽培，得到子 实体，其子实体形态学特征如上所述，例如实施例1中栽培得到的子实体，参见图1和图2。
[0052] 裸伞属的新菌种Gymnopilus lepidotus HMGIM-E140524的应用
[0053] 经证实，新菌种CCTCC Μ 2015747含有较高的总糖含量，安全性好，可以用于调节 免疫或者抗衰老，例如用于制备调节免疫或抗衰老的保健品或药物，或者例如将新菌种 CCTCC Μ 2015747的提取物(如水提物或者醇提物)用于制备调节免疫或抗衰老的保健品或 药物。
[0054] 其中，上述新菌种CCTCC Μ 2015747的应用中包括对于新菌种CCTCC Μ 2015747的 子实体、菌丝体、或者它们的提取物，包括水提取物、有机溶剂提取物(例如醇提取物）。 [0055] 一种调节免疫或抗衰老的保健品或者药物，包含新菌种CCTCC Μ 2015747或其子 实体或其菌丝，或它们的提取物包括水提取物、有机溶剂提取物(例如醇提取物），以及药 学上可接受的载体或者保健品上可接受的载体。
[0056] 实施例
[0057] 实施例1:新菌种CCTCC Μ 2015747的人工栽培 [0058] 1、培养基的制作：
[0059] (1)分离培养基：
[0060] 称取琼脂20g，土豆200g，葡萄糖20g，KH2P〇4 1.5g，MgS〇4 0.5g，维生素 b微量，蛋白 胨l〇g，加水定容至lOOOrnl，添加培养基到试管，121°C高压灭菌25min得到分离培养基斜面； [0061 ] (2)母种培养基：
[0062] 称取琼脂20g，土豆200g，葡萄糖20g，KH2P〇4 1.5g，MgS〇4 0.5g，维生素 b微量，蛋白 胨l〇g，加水定容至lOOOrnl，添加培养基到试管，121°C高压灭菌25min得到母种培养基斜面； [0063] (3)原种料：
[0064]称取质量百分比98 %高粱粒，2%碳酸钙，混合均匀，含水量60 %，装入玻璃瓶中， 121°C高压灭菌25min得到原种料；
[0065] (4)栽培料袋：
[0066]称取质量百分比73%棉籽壳，25 %麸皮，2 %碳酸钙，混合均匀，含水量65%，装入 15*35cm折角栽培袋，盖上食用菌套环，128°C条件下灭菌120min，得到栽培料袋。
[0067] 2、组织分离菌种：
[0068]将分离自海南省陵水县吊罗山森林公园阔叶林倒木上的菌种CCTCC Μ 2015747的 子实体，采用组织分离接种在分离培养基试管斜面中，置于25°C恒温培养箱中，7天后得到 组织分离的原始菌株，置于常温避光保存备用。
[0069] 3、制作母种：
[0070]将组织分离的菌株接种至母种培养基，25 °C培养，直至菌丝长满斜面得到母种，约 12天。
[0071] 4、制作原种：
[0072] 将母种接种至原种料，25°C培养，直至覆满菌丝得到原种，约25-30天。
[0073] 5、栽培培养：
[0074]将原种接种至栽培料袋中，25°C避光培养，直至菌丝长满栽培料袋，去除栽培料袋 的套环，调节空气湿度在60%以上，每天照射12h(100-1501x)，约80天后得到成熟子实体， 如图1和图2所示。
[0075]实施例2实施例1栽培得到的菌种CCTCC Μ 2015747子实体的总糖含量测定
[0076] 1、CCTCC Μ 2015747子实体样品中总多糖的提取
[0077] 称取实施例1栽培得到的菌种CCTCC Μ 2015747子实体0.25g，加入10mL蒸馏水，摇 勾后90°C水提3小时，离心5000r/minl0min，无水乙醇沉淀，过夜;离心5000r/minl0min，弃 去上清液，之后沉淀物用去离子水溶解定容于10mL，得到提取液。
[0078] 2、样品多糖含量测定
[0079]制作葡萄糖标准曲线。
[0080] 吸取lmL步骤1得到的提取液于10ml比色管，加苯酚0.5mL、浓硫酸2.5ml摇匀后反 应半小时，冷却后在489nm波长条件下，以试剂空白调零，分别测定A489值。与葡萄糖标准曲 线作对照，得到总多糖含量，如表1所示。
[0081 ]子实体的多糖含量的计算公式如下：
[0083] 其中，C为从标准曲线中计算样品葡萄糖的质量(mg) ;n为稀释倍数;w为样品重量。
[0084] 表1:
[0086] 表1说明，CCTCC Μ 2015747子实体具有很高的总多糖含量。
[0087]实施例3实施例1栽培得到的菌种CCTCC Μ 2015747子实体的安全性测试 [0088] 1、CCTCC Μ 2015747子实体的水提物和醇提物的制备：
[0089] 称取子实体，放入沸水中，持续2-3h，过滤后于60°C旋蒸，得到CCTCC Μ 2015747子 实体的水提取物；
[0090] 称取子实体，按照1:100的比例加入无水乙醇，静置于4 °C冰箱24h，过滤后于60 °C 旋蒸，得到CCTCC Μ 2015747子实体的醇提取物。
[0091] 2、取对数生长期小鼠胚胎成纤维细胞(ΝΙΗ3Τ3细胞），将细胞取置于12孔板中，1.5 X 1〇5个细胞/孔，每孔?〇〇〇μ1;
[0092] 3、称量50mg水提物溶于lml蒸馏水，过滤，稀释浓度分别为0μg/ml，20μg/ml，50yg/ ml，100μg/ml，500μg/ml，700μg/ml，将该不同浓度的水提物溶液分别加入步骤2中加入了细 胞的孔中；
[0093] 4、称量50mg醇提物溶于200μ1二甲基亚砜(DMS0)+100yl乙醇+700μ1杜尔伯科改良 伊格尔培养基DMEM(含10%血清FBS)的溶剂中，用该溶剂配制稀释浓度分别为0μg/ml，20y g/ml，50μg/ml，100μg/ml，500μg/ml，700μg/ml，将该不同浓度的醇提物溶液分别加入步骤2 的加入了细胞的孔中；
[0094] 5、37 °C培养48h，显微镜下观察结果（细胞正常生长，形态无变），这表明：在20到 700μg/ml的浓度范围内，水提物溶液和醇提物溶液对小鼠胚胎成纤维细胞细胞均没有抑制 细胞增长，没有杀伤性。
[0095] 以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种高产多糖的新菌种，其特征在于，所述菌种为裸伞属的新菌种Gymnopi Ius lepidotus HMG頂-E140524,保藏编号为CCTCC M 2015747。2. 根据权利要求1所述的高产多糖的新菌种的栽培方法，其特征在于，所述方法包括组 织分离菌种后制作母种，制作原种，栽培培养。3. 根据权利要求2所述的高产多糖的新菌种的栽培方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 采集组织分离的菌种腿6頂4140524，将菌种接种至母种培养基，20-28°(：培养，直 至长出菌丝得到母种； (2) 将母种接种至原种料，20-28Γ培养，直至长出菌丝得到原种； (3) 将原种接种至栽培料袋中，20-28Γ避光培养，直至菌丝长满栽培料袋，去除栽培料 袋的套环，调节空气湿度在60-65%以上，每天100]^-15011照射1211，80天-90天后得到成熟 子实体。4. 根据权利要求2所述的高产多糖的新菌种的栽培方法，其特征在于，所述母种培养基 包括琼脂20_25g/L，土豆200-250g/L，葡萄糖 15-20g/L，KH2P〇4 1 · 5g/L，MgS〇4 0 · 5g/L，维生 素 b微量，蛋白胨10-12g/L，其余为水。5. 根据权利要求2所述的高产多糖的新菌种的栽培方法，其特征在于，所述原种料按照 质量百分比计包括95%-98%高粱粒、2-3%碳酸钙，所述原种料的含水量为60-65%。6. 根据权利要求2所述的高产多糖的新菌种的栽培方法，其特征在于，所述栽培料按质 量百分比计包括棉籽壳73-78%、麸皮20-25%、碳酸钙2-3%，所述栽培料的含水量为60-65%〇7. 根据权利要求2所述的高产多糖的新菌种的栽培方法，其特征在于，所述栽培料袋制 作方法包括:将栽培料装入栽培袋，盖上套环。8. 根据权利要求2-5中任一权利要求所述的栽培方法得到的高产多糖新菌种。9. 根据权利要求1-7中任一权利要求所述的高产多糖新菌种的应用，其特征在于，所述 菌种用于制备调节免疫或抗衰老的保健品或药物。10. 根据权利要求1-7中任一权利要求所述的高产多糖新菌种的应用，其特征在于，所 述菌种的提取物用于制备调节免疫或抗衰老的保健品或药物。
【文档编号】C12N1/14GK105950479SQ201610316939
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】刘远超, 胡惠萍, 黄龙花, 杨伟君, 史钏, 贺凤, 吴丽霞
【申请人】广东省微生物研究所, 广东粤微食用菌技术有限公司