一种培养基、生物转化菌丝体、提取物和用图
【专利摘要】本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种培养基、生物转化菌丝体、提取物和用途，所述培养基包括如下重量份的组分：麦麸490～350份，玉米面140～100份，谷糠63～45份，白糖7～5份，葛根300～500份，水400～600份；生物转化菌丝体的制备方法为：将猴头菌类菌株接种至所述的培养基中，在20～27℃下，猴头菌培育30～40天，烘干得到；提取物的制备方法为：将生物转化菌丝体进行水提，得到提取液，将提取液减压浓缩，抽真空干燥，得到提取物；所述提取物具有显著的解酒醒酒效果，因此可应用于制备保肝护肝药物或解酒醒酒保健食品。
【专利说明】
一种培养基、生物转化菌丝体、提取物和用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种培养基、生物转化菌丝体、提取物和 用途。
【背景技术】
[0002] 我国的一项抽样调查结果显示，我国脂肪肝患者大约有1亿多人，而酒精性脂肪肝 的患病率已高达23.34%。长期饮酒可导致肝细胞反复发生变性、坏死和再生，最终导致肝 纤维化和肝硬化。研究表明，酒精性脂肪肝发病的基本原理是乙醛对肝细胞的毒性作用。患 者长期饮酒，可有轻度不适，全身倦怠、易疲劳、食欲不振、腹部胀满、恶心、呕吐、左上腹及 脐周或剑突下痛等；少数患者有低热、腹泻和尿色深等症状;有的还出现肥胖现象。同时由 于生活环境不佳(如：空气污染），毒素容易进入体内者，工作环境不佳(如:从事有毒作业） 者，应酬繁多，经常饮酒者，经常吸烟者、被动吸烟者，经常服用药物者等容易有化学性肝损 伤危险。迫切需要一种对化学性肝损伤有治疗作用同时毒副作用又小的药品或保健食品， 但是，现在市场上还没有真正出现这样一个产品。
[0003] 肝脏是乙醇代谢的主要器官，饮酒后，乙醇在胃肠很快被吸收，90%的乙醇经过肝 脏作用变为乙醛。乙醛对肝脏的主要毒性作用为：（1)降低肝脏对脂肪酸的氧化；（2)影响肝 脏微管系统，使微粒蛋白分泌减少，造成脂质和蛋白质在肝细胞中沉积；（3)在肝脏代谢过 程中，由于氧化、还原平衡失调，乙醇可使磷酸甘油浓度升高，抑制三羧酸循环，使脂肪酸氧 化分解降低，脂肪酸和磷酸甘油是合成TG的原料，故肝内TG合成增加。
[0004] 猴头菌，性味甘平，入脾、胃、肾三经，功能补益脾胃，补肾填髓。《新华本草纲要》记 载："全草，味甘，性平，有利五脏、助消化、养肝扶肝、抗癌"等功能。含有多糖、多肽外，还含 有多种维生素，18种氨基酸，蛋白质含量达20%以上，而这些物质正是饮酒后所消耗的元 素。其中富含维生素 PP(尼克酰胺），尼克酰胺是合成氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD + )的原料，尼克酰胺(维生素 PP)越多，NAD+越多，乙醇脱氢酶的活性就越强，代谢成乙醛就 越快；同理，乙醛脱氢酶的辅酶也为氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，尼克酰胺(维 生素 PP)越多，体内合成的NAD+就越多，乙醛脱氢酶的活性就越强，代谢成无毒的乙酸就越 快，这样就解除了乙醛和乙醇对机体的毒性作用。加速乙醇和乙醛的代谢，代谢成无毒性乙 酸，达到解酒扶肝的目的。猴头菌中维生素 C含量高达26mg/100g，维生素 C具有抗氧化，清除 自由基的功能。乙醇和乙醛在代谢过程中都会产生自由基，而自由基对机体会造成极大损 伤。维生素 C清除自由基，保护机体免受自由基的损伤，达到解酒扶肝的目的。
[0005] 葛根，性甘、辛、凉，归肺、脾、胃经，功效能发表解肌，透疹，生津止渴除烦，升阳止 泻，活血疗疮，解酒。葛根在唐代已用来"解酒毒"，如《千金要方》以鲜葛根捣汁给治醉不醒 者。宋代《本草衍义》以葛根取粉治酒醉者，曰："病酒及渴者，行之甚良"。饮酒过度者多烦 渴，损伤脾胃者又可出现纳差、呕吐等症。葛根能"主呕吐"（《神农木草经》）、"开胃下食…… 止烦渴"（《药性论》），故对醉酒者，有对症之效。葛根提取液能明显降低四氯化碳和乙醇所 致的小鼠 SGPT升高，抑制肝细胞脂质过氧化物丙二醛(MDA)的生成，提高四氧化碳所致的肝 糖元降低，减轻肝脏病理改变，提示葛根对肝损伤有防护作用。有研究发现葛根提取液对低 剂量乙醇中毒引起的小鼠中枢神经系统兴奋有明显的抑制作用，而对高剂量乙醇中毒引起 的大鼠与小鼠中枢神经系统抑制现象，则有一定对抗性，说明葛根有解酒毒和醒酒的作用。
[0006] 生物转化"菌丝体"是指利用菌丝体(包括真菌）的代谢功能，使有机物分解的生物 化学反应过程。以适宜的培养基为营养，通过菌丝体的生长代谢和生命活动产生丰富的次 生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养 基进行菌丝体转化，不同菌株诱变"次生"代谢不同的生物活性成分，再实行"定向培养、双 向转化"生物转化工艺，可获得不同生物活性物质原料，目的是产生新的、增强功效或者降 低单一药物不良作用。
[0007] 为了增强葛根的解酒效果，目前采用的技术方案通常为将葛根和猴头菌进行混 合，并结合其他物质制成组合物，如中国专利公开号CN 102451225A、CN 101683157A和CN 1736261A。如中国专利公开号CN 1736261A公开了一种解酒保肝保健食品，由以下组分及重 量比构成:猴头菌35-45份，葛根25-35份，牡蛎16-24份，甘草8-12份，白芍8-12份，香附8-12 份。其解酒效果还有待加强。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在克服现有技术的不足，跨学科创新，结合微生物学、中药学等多学科， 提供一种培养基、生物转化菌丝体、提取物和用途，所述制备方法简单，成本较低，所述提取 物具有解酒效果，用于制备保肝护肝药物或解酒醒酒保健食品。
[0009] 本发明所述培养基包括如下重量份的组分：
[0010] 麦麸490~350份，玉米面140~100份，谷糠63~45份，白糖7~5份，葛根300~500 份，水400~600份。
[0011]优选的，所述培养基包括如下重量份的组分：
[0012]麦麸420份，玉米面120份，谷糠54份，白糖6份，葛根400份，水500份。
[0013] 本发明还提供一种生物转化菌丝体，制备方法为:将猴头菌类菌株接种至所述的 培养基中，在20~27°C下，猴头菌培育30~40天，烘干，得到生物转化菌丝体。
[0014] 本发明的猴头菌为猴头菌科真菌猴头菌(Hericium erinaceum(Bull .ex Fr.) Pers ·) 〇
[0015] 所述生物转化菌丝体是猴头菌科真菌猴头菌（Hericium erinaceum(Bul 1. ex Fr. )Pers.)的菌丝体与其附生含有葛根成份的固体培养基的干燥混合物。
[0016] 本发明还提供一种提取物，制备方法为：
[0017] (1)将生物转化菌丝体进行水提，50-70°C下用水浸泡，水的重量为生物转化菌丝 体重量的6~10倍，得到提取液；
[0018] (2)将上述提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70°C条件下抽真空干 燥，得到提取物。
[0019] 优选的，水浸泡或抽真空干燥的温度为60°C。
[0020] 本发明还提供一种提取物在制备保肝护肝药物或解酒醒酒保健食品中的用途。
[0021] 本发明的葛根，别名:干葛、甘葛、粉葛、葛葛根、葛麻茹、葛子根、葛条根、鸡齐根， 为豆科植物葛的块根。
[0022] 本发明的有益效果是，本发明低温水浸泡生物转化菌丝体，在50-70°C下水浸泡， 无温度破坏，既能溶解有效成分但又不破坏有效成分;50-70°C减压浓缩，不会破坏有效成 分，特别是活性酶类物质;为了不影响有关活性物质，本发明优选采用60°C条件下抽真空干 燥。
[0023] 本发明采用猴头菌发酵的方式得到生物转化菌丝体，然后对其进行提取，得到提 取物，在动物实验和人体试用下都具有良好的解毒效果。
【具体实施方式】 [0024] 实施例1
[0025] -种生物转化菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0026] (1)取农副产品麦麸490g、玉米面140g、谷糠 63g、白糖7g，以及中药材葛根粗粉(葛 根)300g，混匀，加入约500g水拌匀，即得培养基。再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在27°C条件下 转化培养40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
[0027] (2)取生物转化菌丝体，60 °C水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为生物转化菌 丝体重量的6倍；
[0028] (3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0029] 实施例2
[0030] -种生物转化菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0031] (1)取农副产品麦麸420g、玉米面120g、谷糠 54g、白糖6g，以及中药材葛根粗粉(葛 根)400g，混匀，加入约500g水拌匀，即得菌丝体培养基;再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20°C 条件下转化培养35天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
[0032] (2)取生物转化菌丝体，60 °C水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为生物转化菌 丝体重量的8倍；
[0033] (3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0034] 实施例3
[0035] -种生物转化菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0036] (1)取农副产品麦麸350g、玉米面100g、谷糠 45g、白糖5g，以及中药材葛根粗粉(葛 根)500g，混匀，加入约500g水拌匀，即得菌丝体培养基;再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在25°C 条件下转化培养30天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
[0037] (2)取生物转化菌丝体，60 °C水浸泡3次，每次浸泡4小时，水的重量为生物转化菌 丝体重量的10倍；
[0038] (3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0039] 实施例4
[0040] 葛根掺入比例对比试验
[0041]猴头菌丝体生物转化产业化培养已经很成熟，原料投料以干料计，比率固定为:麦 麸70%、玉米粉20%、谷糠9%、白糖1 %，本发明把中药材葛根作为培养基之一，中药材葛根 参入的比率分别占30 %、40 %、50 %，设计实验方案，总投料5000g，分别按葛根参入的比率 30 %、40 %、50 %配制培养基，加水混匀、灭菌、接种、培养，平行对照，培养条件完全一致，培 养过程中观察菌丝体生长状况、生长周期、污染情况、生长速度，挖瓶后烘干称重，挖瓶后菌 丝体干燥样品分别标注为邪-1、邪-2、邪-3，检测样品中的纤维素酶、麦角留醇含量(考察转 化是否彻底）、葛根素含量。试验结果统计如下表：
[0043]试验结果表示：葛根占50%时污染率高、生长速度慢、生长周期长、纤维素酶麦角 甾醇含量低，生物转化不彻底;而葛根占30%时生长速度较快、生长周期短，但葛根素含量 低;葛根占40 %比率时最为合适，菌丝体生长情况较好，兼顾各优势，为最佳比率。
[0044] 实施例5
[0045] 化学性肝损伤动物试验
[0046] 1材料和方法
[0047] 1.1样品：猴头菌丝体生物转化产业化培养已经很成熟，原料投料以干料计，比率 固定为:麦麸70 %、玉米粉20 %、谷糠9 %、白糖1 %，本发明把中药材葛根作为培养基之一， 中药材葛根参入的比率分别占30%、40%、50%，设计实验方案，总投料500(^，分别按葛根 参入的比率30 %、40 %、50 %配制培养基，培养、提取后得到提取物，分别标注为TH-1、TH-2、 TH-3〇
[0048] 取猴头菌丝体、葛根，分别60°C水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为猴头菌丝 体或葛根重量的8倍;将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条 件下抽真空干燥，即得提取物。提取物样品分别标注为HTJ、GG。
[0049] 本试验前，各样品临用时用蒸馏水作溶剂配制成所需浓度。
[0050] 1.2无水乙醇:分析纯，由重庆川东化工(集团）有限公司生产，批号:20140416。
[0051] 1.3试验动物：由四川抗菌素研究所实验动物中心提供的雄性SD大鼠70只，体重为 180-220g，合格证号为：川实动质2014-004清洁级。试验动物房为SPF级，使用合格证号为川 实动管0143,温度为20-25 °C，相对湿度40-70 %。
[0052] 1.4实验分组及剂量设计:将SD大鼠随机分成七组，每组10只，样品共5个，实验设 210mg/kg统一一个剂量(分别相当于人体推荐量的5倍），另设蒸馏水阴性对照组和50%乙 醇模型对照组。用乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，乙醇浓度为50%(以蒸馏水稀释），灌胃量 12ml/kg · bw(折合乙醇的剂量为6000mg/kg · bw)。
[0053] 1.5实验方法:采用酒精性肝损伤模型，选用雄性SD大鼠70只，分5个样品组和一个 阴性对照组、一个模型对照组。5个样品组均每日灌胃给予受试物，阴性对照组和模型对照 组给予蒸馏水，按lOml/kg. bw每天一次经口灌胃，连续给予30天，每周称两次体重，以此调 整给药量。实验结束时将模型对照组和5个样品组一次灌胃给予50 %无水乙醇12ml/kg. bw， 阴性对照组给予蒸馏水，禁食16h后处死动物取肝脏，称重并计算脏体比，用肝脏进行生化 指标检测及组织病理学检查。
[0054] 2检测指标
[0055] 2.1肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)及肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)均 使用由南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定，肝匀浆中的甘油三酯(TG)由四川省迈 克科技有限责任公司提供的试剂盒测定，以上指标的测定均采用生物梅里埃半自动生物测 定仪进行分析。
[0056] 2.2肝脏称重及脏体系数。
[0057] 2.3肝脏组织病理学诊断标准
[0058] 2.3.1病理学观察材料:从动物肝左叶中部做横切面取材、冰冻切片、苏丹ΙΠ 特殊 染色、镜下观察脂滴在肝脏中的分布、范围和面积。
[0059] 2.3.2病理观察方法:每例动物肝组织用40倍物镜连续观察整个组织切片，每个视 野根据阳性细胞多少和分布的范围，按〇、1、2、3、4分进行评分。将所得分数的平均值作为该 例肝组织的脂肪染色评分。
[0060] 2.3.3病理诊断标准:病理组织学观察以肝细胞脂肪染色作为观察指标，并根据病 理改变程度"〇"、"Γ、"2"、"3"、"4"量化，进行肝损伤程度的评价。
[0061] 2.3.4肝细胞脂肪染色共分为5级： 肝细胞内脂滴散在、稀少 0分 含脂滴的肝细胞不超过1/4 1分
[0062] 含脂滴的肝细胞不超过1/2 2分 含脂滴的肝细胞不超过3/4 3分 肝组织几乎被脂滴代替 4分
[0063] 2.4实验数据统计:实验数据统计采用SPSS11.0 for windows软件包处理。对照组 及样品组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnett法 进行两两比较;若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用 Dunnett's T3法进行两两比较。阴性对照组与模型对照组则采用T检验。
[0064] 3实验结果
[0065] 3.1提取物对大鼠体重、肝脏重、肝体比值的影响
[0066] 表1提取物对大鼠体重、肝脏重、肝体比值的影响（7 土s)
[0068] 由表1可见，提取物各样品组大鼠的初始体重与阴性对照组比较，经方差齐性检 验，方差齐(P>〇.05)，且方差分析结果(P>0.05)，即各组初始体重是均衡的。各组动物中期 体重、结束体重、肝重及脏体比值与模型对照组比较无显著性差异(P>〇.05)，在整个实验期 间，动物生长良好，体重持续增长，未见动物出现中毒症状及死亡。
[0069] 3.2提取物对肝匀衆1?^、63!^6含量的影响（1±3)
[0070] 表2生物转化"菌丝体"对肝匀衆MDA、GSH、TG含量的影响（? 土S)
[0071]
[0072] 注:^表示与阴性对照组比较P〈0.01 表示与模型对照组比较P〈0.05 ;#P〈0.01 [0073]由表2可见，模型对照组肝匀浆中MDA、GSH/TG含量与阴性对照组比较均有显著性 差异(P〈0.01)，表明该模型是成功的，实验系统可靠。提取物3个样品的GSH与模型组比较由 升高趋势且TH-2组有极显著性升高(？〈0.01)，提取物3个样品的1?从、了6与模型对照组比较 均有下降趋势且低，TH-2组有显著性降低(P〈0.05，P〈0.01) ATJ和GG组都有提高GSH并降低 MDA和TG的效果，但和模型对照组对比没有显著性差异。
[0074] 3.3肝脏组织病理学检查结果
[0075] 结果见表3、表4,模型对照组脂肪染色评分高于阴性对照组(P〈0.01)，表明该模型 是成功的，实验系统可靠。受试物5个样品组肝细胞脂肪评分与模型组比较有显著性降低(P <0·01，Ρ〈0·05)。
[0076] 表3提取物对大鼠肝脏病理变化观察记录
[0077]
[0078] 表4提取物对大鼠肝脏组织病理学检查结果
[0079]
[0080] 注:^表示与阴性对照组比较Ρ〈0.01 表示与模型对照组比较Ρ〈0.05 ;#Ρ〈0.01 [0081 ] 4 小结
[0082] 提取物连续30天经口灌胃给予动物后，对动物的体重、肝重及肝体比值无明显影 响，TH-2组肝匀浆中GSH有显著性升高，TH-1、TH-2、TH-3组的MDA、TG有下降趋势且低、TH-2 组组有显著性降低(P〈〇.05，P〈0.01)，组织病理学检查结果为阳性。由此可判定，提取物对 动物酒精性肝损伤具有辅助保护功能。
[0083]实施例6人体试食预期效果
[0084] 将实施例2得到的提取物制作成干浸膏，灌装成胶囊，包装，样品提供给人群试食， 作为试食组。按照中国专利公开号CN 1736261A公开的一种解酒保肝保健食品制作成保健 食品，提供给人群试用，作为对比组，试食情况总结如下：
[0085] 1)试食组:男性134例，女性16例;试食人员年龄在18~68岁之间。对比组:男性132 例，女性18例;试食人员年龄在18~68岁之间。
[0086] 2)食用方法:酒前10~30分钟服用4~6粒。
[0087] 3)评价方法:对试食组和对比组人员发放信息反馈单，按一下指标评价产品显效、 有效、无效;显效:本产品能够增加酒量，醒酒快，能够缓解酒精对胃的刺激，缓解酒后各种 不适;有效:本产品有一定的醒酒作用，缓解酒精对胃的刺激;无效:服用本产品与不服用没 什么区别。
[0088] 4)试食结果如下：
[0090] 通过试食和对比结果看出，本产品显效率达68.67 %，总有效率达94.7 %，显著高 于对比产品，本产品确实能够解酒醒酒，对酒精性肝损伤有辅助保护作用。
【主权项】
1. 一种培养基，其特征是，包括如下重量份的组分： 麦麸490~350份，玉米面140~100份，谷糠63~45份，白糖7~5份，葛根300~500份，水 400 ~600份。2. 如权利要求1所述的培养基，其特征是，所述培养基包括如下重量份的组分： 麦麸420份，玉米面120份，谷糠54份，白糖6份，葛根400份，水500份。3. -种生物转化菌丝体，其特征是，制备方法为:将猴头菌类菌株接种至如权利要求1 或2所述的培养基中，在20~27°C下，猴头菌培育30~40天，烘干，得到生物转化菌丝体。4. 一种提取物，其特征是，制备方法为： (1) 将如权利要求3所述的生物转化菌丝体进行水提，50-70°C下用水浸泡，水的重量为 生物转化菌丝体重量的6~10倍，得到提取液； (2) 将上述提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70°C条件下抽真空干燥， 得到提取物。5. 如权利要求4所述的提取物，其特征是，水浸泡或抽真空干燥的温度为60°C。6. -种如权利要求4或5所述的提取物在用于制备保肝护肝药物或解酒醒酒保健食品。
【文档编号】C12R1/645GK105950477SQ201610261325
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】何述金, 周代俊, 周邦维
【申请人】湖南新汇制药股份有限公司