定量测定小而密ldl胆固醇的方法和试剂盒的制作方法

专利名称：定量测定小而密ldl胆固醇的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定小而密LDL中胆固醇的方法和试剂，这对于动脉硬化的诊断是重 要的。
背景技术：
胆固醇是细胞的一种重要组分，也是临床上重要的组分，因为过高水平的胆固醇 导致在内皮下间隙中的巨噬细胞摄取胆固醇后使巨噬细胞转化为泡沫细胞(foam cell)并 继而导致动脉硬化的原发病灶的发展。低密度脂蛋白(LDL)在血液的胆固醇运输中起主要 作用并且是动脉硬化的危险因素。已知小而密LDL，其在LDL中粒度特别小并且与标准LDL 相比密度更高，具有多于正常LDL数倍水平的致动脉粥样化的能力。小而密LDL的增加是动 脉硬化的主要危险因素之一。因此在临床上进行此类小而密LDL的分级测定(fractional measurement)是非常重要的用于测定小而密LDL的常规方法的实例包括超速离心法、电泳法以及使用高效液 相色谱的方法。由于这些方法需要昂贵的设备和大量测量时间，因此并不方便。一种利用自动分析仪测量小而密LDL的方法的实例是以下方法(参见日本专利公 布(Kokai)第2003-28882A号)，该方法涉及利用离子强度差异将小颗粒LDL悬浮或溶解， 然后利用吸光度差异对小颗粒LDL进行测定。然而，吸光度差异依照上述方法是基于浊度 测定的。因此不能测定小而密LDL中胆固醇，因而特异性和准确度不足。此外，已知一种方法(参见国际专利公布W02004/053500)，该方法涉及通过使用 包含聚阴离子和二价阳离子的分离剂与适合于自动分析仪的试剂的组合来测量小而密LDL 中的胆固醇或三酰甘油。该方法能够比超速离心法或电泳法更方便地测量小而密LDL中的 脂质组分。此外，该方法的特异性和准确度极好。但是该方法需要预处理试样并需要将LDL 分离成小而密LDL和除这种LDL之外的LDL的步骤。本发明的公开内容本发明要实现的目标本发明的一个目标是提供一种适用于自动分析仪的分级测定小而密LDL的方法 以及用于此类测定的试剂，所述方法和试剂能够在无需预处理试样下进行具有良好特异性 的、快速且方便的分析。实现该目标的手段作为集中研究的结果，本发明人完成了一种用于测量小而密LDL的新方法。具体 而言，当利用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶测量含各种脂蛋白的样品中的胆 固醇时，酶对除小而密LDL之外的LDL的反应速率增加的程度大于酶对小而密LDL的反应 速率增加的程度，这是由于利用了磷脂酶特异性地与特定底物反应。因此，通过利用过氧化 氢酶和4-氨基安替比林可清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇并将其排除在反应体 系之外。其后，使用用于胆固醇测定的酶进行酶反应，以便可对LDL中、特别是小而密LDL 中的胆固醇进行测定。此外，当在将除小而密LDL之外的LDL排除在反应体系之外的反应前或反应后加入与除LDL之外的脂蛋白(例如HDL和VLDL)反应的特定表面活性剂时，所 述特定表面活性剂与除LDL之外的脂蛋白(例如HDL和VLDL)反应，致使可通过过氧化氢 酶或4-氨基安替比林清除HDL或VLDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外。用于清除 除小而密LDL之外的LDL的此类反应和用于经由脂蛋白(例如HDL和VLDL)与特定表面活 性剂的反应清除HDL或VLDL中的胆固醇的反应可同时进行，以便可将除小而密LDL之外的 脂蛋白清除并将其排除在反应体系之外。由此剩余的小而密LDL与用于胆固醇测定的酶反 应，致使可成功地分级并单独测定小而密LDL中的胆固醇。此外，指定表面活性剂的类型和 酶的浓度以便可使以下两种反应在同一溶液中顺利进行用于清除除小而密LDL之外的上 述脂蛋白以将其排除在反应体系之外的反应和用于清除HDL和VLDL中的胆固醇以将其排 除在反应体系之外的反应。因此，本发明得以完成。本发明为如下所述。[1] 一种用于定量测定样品中的小而密LDL胆固醇的方法，该方法包括以下步骤(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇，以及随后(2)定量测定小而密LDL中的胆固醇。[2]根据[1]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤⑴中采用的磷 脂酶与至少鞘磷脂和/或磷脂酰肌醇具有高反应性，其为存在于脂蛋白中的磷脂。[3]根据[1]或[2]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤⑴中使 用的磷脂酶的浓度范围为0. lU/mL-100U/mL。[4]根据[1]_[3]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其在中步骤 (2)中在至少作用于小而密LDL的表面活性剂的存在下加入用于胆固醇测定的酶。[5]根据[4]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤⑵中使用的 至少作用于小而密LDL的表面活性剂是作用于所有脂蛋白的表面活性剂。[6]根据[4]或[5]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤⑵中 使用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物、或 HLB为11以上且小于14的聚氧乙烯衍生物。[7]根据[1]_[6]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，所述方法还 包括在胆固醇酯酶存在下清除样品中除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(a)，该步骤 在步骤(2)之前并在步骤(1)之前、之后或同时实施。[8]根据[7]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中使用的胆 固醇酯酶的浓度范围为0. 01U/mL-10U/mL。[9]根据[7]或[8]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中 还加入作用于除LDL之外的脂蛋白的表面活性剂。[10]根据[9]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中使用的 表面活性剂的浓度范围为0. 05% -1. 0%。[11]根据[7]_[10]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步 骤(a)中还加入胆固醇氧化酶和过氧化氢酶。[12]根据[7]_[10]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步 骤(a)中还加入4-氨基安替比林。[13]根据[7]_[12]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)的反应和步骤(1)的反应在同一溶液中同时进行。[14]根据[7]_[13]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤 (a)中采用的表面活性剂为选自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚 和聚氧乙烯烷基胺的非离子型表面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺 醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵 盐、季铵盐和单直链烷基型表面活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二 甲基烷基甜菜碱、咪唑啉型表面活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂。[15] 一种用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，所述试剂盒包含至少以下两 类试剂组合物(i)用于清除样品中除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇的试剂组合物，该试剂组 合物含有至少与除小而密LDL之外的LDL反应的磷脂酶；(ii)用于测定小而密LDL的试剂组合物，其包含仅与小而密LDL或其衍生物反应的作为聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物的表面活性 剂；或作为HLB在11以上且小于14的聚氧乙烯衍生物的表面活性剂；4-氨基安替比林；和过氧化物酶。[16]根据[15]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的包含至少3种试剂组合物的 试剂盒，所述试剂盒还包含(iii)用于清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的试剂组合物， 所述试剂组合物包含选自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺 的非离子型表面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛 磺酸盐和磷酸盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵盐、季铵盐和单直 链烷基型表面活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱、 咪唑啉型表面活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂。[17]根据[15]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，所述试剂组合物⑴ 还包含选自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非离子型表 面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸 盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵盐、季铵盐和单直链烷基型表面 活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱、咪唑啉型表面 活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂，由此通过所述试剂组合物(i)清 除样品中除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇。[18]根据[15]_[17]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，其中 磷脂酶与脂蛋白中存在的磷脂中的至少鞘磷脂和/或磷脂酰肌醇具有高反应性。本发明的效果通过将含有本发明的特定表面活性剂的试剂(即磷脂酶)加入含有脂蛋白的样品 中，在无需利用过滤器或离心进行分离的情况下可直接且选择性地测量脂蛋白中的小而密 LDL。本说明书包括日本专利申请第2007-264908号的说明书和/或附图所公开的部分 或全部内容，它是本申请的优先权文件。
附图简述

图1显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇以将所述胆固醇排除在反应体系之外并采用磷脂酶A2作为磷脂酶的步骤；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图2显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇以将所述胆固醇排除在反应体系之外并采用磷脂酶C作为磷脂酶的步骤；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图3显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇以将所述胆固醇排除在反应体系之外并采用磷脂酶D作为磷脂酶的步骤；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图4显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇以将所述胆固醇排除在反应体系之外并采用溶血磷脂酶作为磷脂酶的步骤；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图5显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤并采用特异性针对甘油磷脂的磷脂酶作为磷脂 酶；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图6显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇以将所述胆固醇排除在反应体系之外并采用鞘磷脂酶作为磷脂酶的步骤；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图7显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，其中第一步是清除LDL中除小而密LDL之外的 LDL(LLDL)中的胆固醇以将所述胆固醇排除在反应体系之外并采用鞘磷脂酶作为磷脂酶的 步骤；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图8显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括2个步骤，该方法采用鞘磷脂酶作为磷脂酶并且采用 EMULGEN B-66和EMULGEN A-90作为表面活性剂；禾口采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图9显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括3个步骤，该方法采用鞘磷脂酶作为磷脂酶并采用EMULGEN B-66作为表面活性剂；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图10显示了以下两种方法之间的相关性
本发明的方法，其包括2个步骤，该方法采用鞘磷脂酶作为磷脂酶并采用EMULGEN A-90作为表面活性剂；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。图11显示了以下两种方法之间的相关性本发明的方法，其包括2个步骤，该方法采用鞘磷脂酶作为磷脂酶并且没有使用 表面活性剂；和采用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法。实施本发明的最佳方式将如下详细解释本发明。脂蛋白可粗略分级为VLDL、LDL和HDL。进一步将LDL分级为小而密LDL及其它 亚级分。小而密LDL也被称为小颗粒LDL、SLDL(小LDL)、致密性LDL或sd LDL0除此之外 的LDL也可被称为LLDL(大LDL)或轻LDL。这些级分与亚级分可根据粒度或密度区别开 来。VLDL的粒度(或粒径)范围为30nm-80nm(30nm-75nm)，LDL的粒度(或粒径)范围为 22nm-28nm(19nm-30nm)，而HDL的粒度(或粒径)范围为7nm_10nm，然而这些数字可随研究 人员的变化而变化。VLDL的密度为1. 006 (g/Ι)以下，LDL的密度范围为1. 019-1. 063 (g/Ι)， 而HDL的密度范围为1. 063-1. 21 (g/1)。LDL颗粒的直径可通过梯度凝胶电泳(GGE) (JAMA, 260，第 1917-21 页，1988)或 NMR(脂蛋白测试手册(HANDBOOK OF LIP0PR0TEINTESTING), 第二版，编者 Nader Rifai 等人·第 609-623 页，AACCPRESS The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEARANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No. 3，第 15-16 页)进行测定。密 度可基于通过超速离心的分析进行测定(Atherosclerosis，106，第241-253页，1994 Atherosclerosis,83,H 59 页，1990)。由本发明方法测定的小而密LDL通常是LDL级分中直径范围为约22. Onm-约 25. 5nm、密度范围为1. 040-1. 063 (g/Ι)的亚级分。为何要基于粒度对LDL进行亚分级的原 因是LDL中的小LDL需要分级测定，因为这种具有小粒度的LDL具有引发动脉硬化的高倾 向并且恶性程度显著高于其它LDL。LDL的直径和密度分布是连续的。因此，不可能清楚 地确定会导致特别高程度的恶性的具有前述水平以上密度的LDL。因此，1. 040-1. 063 (g/ 1)的密度范围并不构成小而密LDL的确定特征，而是通过在1.019-1. 063 (g/Ι)之间的 密度范围在中心点处划分得到的值，这是已经被广泛采用且建立完善的方法。例如，在 另一报告中，将小而密LDL在1.044-1. 060 (g/Ι)之间的范围内分级(Atherosclerosis 106241-253,1994)。关于如何设定小而密LDL的密度范围在研究人员中有一定差异。在所 有情形中，当利用以上密度范围进行分级时，小而密LDL的存在与临床恶性相关。在本发明中，术语“小而密LDL”是指在LDL中具有低密度并且在临床上具有比其 它LDL更高的引发动脉硬化的倾向的LDL。优选地，小而密LDL具有高于在LDL的整个密度 范围内中心点处的密度。更优选地，小而密LDL的密度范围为1.040-1. 063 (g/L)。此外， 术语“除LDL之外的脂蛋白”是指VLDL和HDL。该术语还可指乳糜微粒、IDL (中密度脂蛋 白)和HDL(极高密度脂蛋白)。本发明的方法包括以下步骤清除LDL中除小而密LDL之外的LDL(LLDL)中的胆固醇，以将胆固醇排除在反应 体系之外；
清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇，以将胆固醇排除在反应体系之外；和测定小而密LDL。对于从LDL中清除除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中的胆固醇以将胆固醇排除 在反应体系之外的上述步骤和清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇以将所述胆固醇排除 在反应体系之外的上述步骤，本文还可应用合适的技术将这样的胆固醇排除在反应体系之 外，而非在除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中或除LDL之外的脂蛋白中将胆固醇清除。特 别地，使用例如涉及HDL、VLDL、L LDL等中所含的此类胆固醇的聚集反应或抑制其在随后步 骤中的反应的已知技术可将HDL、VLDL、L LDL等中所含的胆固醇排除在反应体系之外，致使 小而密LDL胆固醇的定量测定不受影响。在将除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中的胆固醇从LDL中排除在反应体系之外 的步骤中，认为除所述反应(通过该反应在该步骤中除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中的 胆固醇被排除在反应体系之外)之外还发生另一种反应。这样的“另一种反应”在本发明 的方法是可接受的，只要该反应不会影响本发明的目的(即小而密LDL的分级测定)即可。 这样的“另一种反应”的实例是将除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇排除在反应体系之外的 反应。该反应是可接受的，因为它一般不会影响小而密LDL的分级测定。本发明的方法通常在自动分析仪内进行。在本发明方法的清除除小而密LDL之外的LDL(大LDL ；LLDL)中的胆固醇以将胆 固醇排除在反应体系之外的步骤中使用磷脂酶。磷脂酶与L LDL的反应速率大于与小而 密LDL的反应速率。因此，当使用L LDL(在LDL中)作为底物时，磷脂酶选择性地增大了 酶反应速率。磷脂酶是与磷脂反应的酶的总称。磷脂酶的实例包括磷脂酶A2、磷脂酶C和 磷脂酶D。任何种类的磷脂酶可用于本发明。此外，在磷脂当中，本发明适当地可采用对鞘 磷脂具有高反应性(鞘磷脂酶活性)的磷脂酶(鞘磷脂酶)和对磷脂酰肌醇具有高反应性 的磷脂酶等。对鞘磷脂具有高反应性(鞘磷脂酶活性)的上述磷脂酶、对磷脂酰肌醇具有 高反应性的磷脂酶等也可对磷脂酰胆碱等(另一种磷酸)具有反应性。上述磷脂酶在试剂 中的浓度优选范围为0. lU/mL-100U/mL、并更优选范围为0. 2U/mL_20U/mL。在反应时所述 酶在反应液中的浓度优选范围为0. 05U/mL-100U/mL、并更优选范围为0. lU/mL_20U/mL。此 外，除具有高鞘磷脂酶活性的磷脂酶和/或对磷脂酰肌醇具有高反应性的磷脂酶之外，还 可采用其它类型的磷脂酶，例如磷脂酶A2、磷脂酶D和溶血磷脂酶。对于上述磷脂酶，可适 当地采用对鞘磷脂具有高特异性的磷脂酶或对磷脂酰肌醇具有高特异性的磷脂酶。优选可 采用来自细菌、酵母或人胎盘的磷脂酶。磷脂酶的优选具体实例包括但不限于PLA2、PLC、 PLD、LYPL、PLDP、SPC、PI-PLC(Asahi Kasei Corporation)、来源于赌状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的鞘磷脂酶、来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的鞘磷脂酶、磷脂 酶C和来源于蜡状芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性的磷脂酶(SIGMA)。在清除L LDL中的胆固醇的步骤中可使用或不使用表面活性剂。使用优选的表面 活性剂能够加速L LDL中的胆固醇的清除。当使用表面活性剂时，可优选使用与清除除随 后的LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的胆固醇的步骤中所用的表面活性剂的相同 表面活性剂。此外，也可加入与所述实例不同的合适的表面活性剂。当在清除L LDL中胆固醇的步骤前实施清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步 骤时，在清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤中的各组分在接受清除L LDL中胆固醇的后续步骤时保持完整。因此，用于清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的一种或多种 表面活性剂也可用于清除L LDL中胆固醇的步骤中。在清除L LDL中胆固醇的上述步骤中，胆固醇酯酶在磷脂酶存在下作用于L LDL, 由此得到的胆固醇在与胆固醇反应的酶(例如胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶)的存在下被 反应并清除。在此之后，L LDL中的胆固醇被排除在反应体系之外。当在清除L LDL中胆 固醇的步骤中使用表面活性剂时，胆固醇酯酶和表面活性剂在磷脂酶存在下作用于L LDL, 由此得到的胆固醇在与胆固醇反应的酶(胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶)的存在下被反 应并清除，从而使L LDL中的胆固醇被排除在反应体系之外。这里，短语“表面活性剂作用 于...(与...反应)”是指其中表面活性剂与脂蛋白结合以改变或降解脂蛋白的情形，例 如致使脂蛋白中的胆固醇释放。例如当“表面活性剂作用于除LDL之外的脂蛋白(与除LDL 之外的脂蛋白反应)”时，并不要求所述表面活性剂完全不作用于LDL，而是可主要作用于 除LDL外的脂蛋白。例如，作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂对小而密LDL 的作用小于其对除小而密LDL之外的脂蛋白的作用。术语“清除”意指降解样品中的物质 以防止在后续步骤中检测到降解产物。这就是说，短语“清除L LDL中脂蛋白的胆固醇”意 指降解样品中的L LDL并继而避免降解产物；即防止在后续步骤中检测到L LDL中的胆固 醇。用于清除的方法的实例包括但不限于涉及用过氧化氢酶将过氧化氢(由使胆固醇酯酶 或胆固醇氧化酶起作用而产生)降解为水和氧的方法以及涉及用过氧化物酶致使氢供体 与过氧化氢反应从而实现转换为无色醌的方法。在本发明中，短语“排除在反应体系之外”是指以下体系其中HDL、VLDL、L LDL等 中所含的胆固醇被清除、聚集或抑制以避免在后续步骤中所述胆固醇的反应，例如为了防 止HDL、VLDL和L LDL等中所含的此类胆固醇影响小而密LDL胆固醇的定量测定。在本发明中，除了上述在磷脂酶存在下清除L LDL中胆固醇的步骤之外，还可实施 清除除LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的胆固醇的步骤。清除除LDL之外的脂蛋 白(例如VLDL和HDL)中的胆固醇的步骤可在清除L LDL中胆固醇的步骤之前、之后或者 同时进行。在清除除LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的胆固醇的步骤中，VLDL和HDL 中的胆固醇在表面活性剂存在下被清除，所述表面活性剂作用于除LDL之外的脂蛋白(例 如VLDL和HDL)但不与LDL反应。作用于除LDL之外的VLDL和HDL等并与其反应的此类表 面活性剂的实例为HLB为13-15的聚氧乙烯衍生物。此类表面活性剂在试剂中的浓度优选 范围为0.3% (重量/体积)_5% (重量/体积)、更优选范围为0.5% (重量/体积)_3% (重量/体积)。在反应时其在反应液中的浓度优选范围为0. 15% _5%、并更优选范围为 0. 25% (重量/体积)_3% (重量/体积)。此类衍生物的实例包括高级醇缩合物、高级脂 肪酸缩合物、高级脂肪酰胺缩合物、高级烷基胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物和烷基酚缩合 物。HLB为13-15的聚氧乙烯衍生物的优选具体实例包括但不限于HLB为13-15的化合物， 例如聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油酰基醚、聚氧乙烯高级醇醚和 聚氧乙烯烷基苯基醚。以上表面活性剂的具体实例包括EMULGEN B-66(聚氧乙烯衍生物) 和EMULGEN A-90 (聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚)。当在清除L LDL中胆固醇的步骤中采用不与小而密LDL反应而仅与L LDL反应的 表面活性剂，例如HLB为13-15的表面活性剂时，可加入选自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基胺的非离子型表面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、 酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲 基铵盐、季铵盐和单直链烷基型表面活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜 碱、二甲基烷基甜菜碱、咪唑啉型表面活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活 性剂。所述非离子型表面活性剂的具体实例包括EMULGEN B-66、EMULGEN A_90、EMULGEN 120 禾口 EMULGEN920 (Kao 公司)、NONION HS-220、NONION HS-215、N0NI0NK-230、NONION NS-220,NONION NS-230,NYMEEN F-215,NYMEEN L-207和 ADEKA TOL LB-1520 (ADEKA公司)。 所述阴离子型表面活性剂的具体实例包括EMAL 20CM、EMAL 20T、EMAL E27C和LEVEN0L WX(Kao 公司)、SUNAMIDE CF-3、SUNAMIDE CF-10、DIAPON K、DIAPON F、DIAPON K-SF, PERSOFT EF、PERSOFT EFT、PERSOFT EL、PERSOFT EP、PERS0FT ΕΚ、PERSOFT SL、POLYSTAR 0MP、ADEKA C0LPS-440E和TRAX K_40 (ADEKA公司)。所述阳离子型表面活性剂的具体实例 包括QUARTAMIN24P (Kao公司)和ADEKA MINEMAC-30 (ADEKA公司)。所述两性表面活性剂 的具体实例包括 AMPHITOL 24B (Kao 公司)、NISSAN ANON LG、NISSAN ANONBDF-R、NISSAN ANON BF,NISSAN ANON BL,NISSAN ANONBL-SF 和 NISSAN ANON GLM-R-LV0 以上表面活性剂 在试剂中的浓度优选范围为约0.01% (重量/体积)_1.0% (重量/体积)并更优选范围 为约0.10% (重量/体积)_0.50% (重量/体积)。在反应时此类表面活性剂在反应液 中的浓度优选范围为约0.005% (重量/体积)_1.0% (重量/体积)并更优选范围为约 0. 05% (重量/体积)-0. 50% (重量/体积)。在以上表面活性剂存在下，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶起作用以从胆固醇产生过 氧化氢，由此产生的过氧化氢随后被清除。用于清除过氧化氢的方法的实例包括但不限于 涉及使过氧化氢酶起作用以将过氧化氢降解为水和氧气的方法和涉及用过氧化物酶使苯 酚或苯胺氢供体化合物与过氧化氢反应以实施转化为无色醌的反应。胆固醇酯酶在反应液 中的浓度的优选范围为约0. 010U/mL-10U/mL。此外，可采用来自细菌或酵母的胆固醇氧化 酶。所述胆固醇氧化酶在反应液中的浓度的优选范围为约0. lU/mL-0. 7U/mL。此外，过氧化 氢酶在反应液中的浓度的优选范围为约40U/mL-500U/mL。此外，当过氧化氢被转化为无色 奎宁时，过氧化物酶在反应液中的浓度的优选范围为0. 4U/mL-l. 0U/mL并且这样的苯酚或 苯胺氢供体化合物在反应液中的浓度的优选范围为0. 4mmol/L-0. 8mmol/L。在清除L LDL的步骤或清除除LDL之外的HDL、VLDL等的步骤或所述两个步骤中 可使用与清除有关的上述组分，例如胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和苯酚或苯胺 氢供体化合物。在清除L LDL中胆固醇的步骤中所用试剂的量和在清除除LDL之外脂蛋白中胆固 醇的步骤中所用试剂的量可视各组分的浓度范围而定。例如，假设在清除除LDL之外的脂 蛋白中的胆固醇的步骤中所用表面活性剂的浓度为3g/L，则在清除L LDL中胆固醇的步骤 中不加入表面活性剂，并且在清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤中使用的试剂与 在清除L LDL中胆固醇的步骤中所用试剂的液体体积比为1 1。当样品量较少时，所述步 骤中表面活性剂的浓度为约1.5g/L。照此，试剂的组成和所加入试剂的量可视反应时所需 试剂的浓度而定。通过清除L LDL中的胆固醇的步骤和清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步 骤，已作用于上述表面活性剂和胆固醇酯酶并与其反应的脂蛋白中的胆固醇与对胆固醇起
11反应的酶(例如胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶)反应，以使所述胆固醇排除在反应体系之 外。除LDL和L LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的胆固醇通过所述反应被排除在 反应体系之外，致使在后续步骤中小而密LDL单独作为脂蛋白保留在反应液中。在本发明 中，清除除小而密LDL之外的脂蛋白并随后将其排除在反应体系之外以防止在后续步骤中 检测到除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的此类程序也可被称作“将小而密LDL从除 小而密LDL之外的脂蛋白中区分开”。此外，通过调整在上述表面活性剂存在下胆固醇酯酶的浓度，可改变与胆固醇酯 酶反应的脂蛋白的类型，从而使选择性地清除除小而密LDL之外的脂蛋白成为可能。随着 反应时胆固醇酯酶的浓度的增大，首先L LDL，特别是(在LDL之中)与酶的反应性增大，因 此其被排除在反应体系之外。然而，当在浓度不特别高的范围之内时，小而密LDL与酶的反 应性没有显示出增大。此外，当胆固醇酯酶的浓度增大时，小而密LDL与酶的反应性增大。 因此，当将胆固醇酯酶以一定范围内的浓度(在此范围内L LDL与酶之间的反应性高而小 而密LDL与酶之间的反应性低)内加入时，小而密LDL可被选择性地测定。因此，通过将 胆固醇酯酶的浓度调整至特定范围内时，可更选择性地测定小而密LDL。在用于清除L LDL 中胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤的反应液中，或在用于清除除LDL之外脂蛋白 中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤的反应液中，胆固醇酯酶的浓度优选范围为 0. lU/mL-3. OU/mL、更优选范围为 0. 3U/mL_2. 5U/mL、特别优选范围为 0. 6U/mL_2. OU/mL。本 发明所使用的胆固醇酯酶不受到特别限制，只要它是水解胆固醇酯的酶即可。可采用来自 动物或微生物的胆固醇酯酶。本文所用的胆固醇脱 氢酶不受到特别限制，只要其是能够氧化胆固醇以还原被氧 化的辅酶的酶即可。可采用动物或微生物来源的胆固醇脱氢酶。胆固醇脱氢酶在反应液中 的浓度优选范围为0. 01U/mL-200U/mL，特别优选范围为0. lU/mL_100U/mL。还可将脂蛋白酶任意加入用于清除L LDL中胆固醇的步骤和/或清除除LDL之 外脂蛋白中胆固醇的步骤的反应液中以调节对各种脂蛋白的作用。作为所述脂蛋白酶，可 使用脂蛋白脂肪酶。本文所用的脂蛋白脂肪酶不受到特别限制，只要其是能够降解脂蛋白 的酶即可。可使用动物或微生物来源的脂蛋白脂肪酶。此类脂蛋白脂肪酶在反应液中的浓 度优选范围为0. 01U/mL-10U/mL、更优选范围为0. 01U/mL_5U/mL、特别优选范围为0. OlU/ mL-lU/mL0本发明的清除L LDL中胆固醇的步骤和清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的 步骤可在同一试剂中同时实施。在这种情况下，胆固醇酯酶在反应液中的浓度优选范围为 0. 5U/mL-2. OU/mL。作为本文所用的表面活性剂，清除L LDL中胆固醇的步骤和/或清除除 LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤中所用表面活性剂可照原样使用。此类表面活性剂在 反应液中的浓度优选范围为0.05% (重量/体积)_0.3% (重量/体积)。此外，磷脂酶在 反应液中的浓度优选范围为0. lU/mL-30U/mL。在本发明中，在清除L LDL中的胆固醇和清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇这 两个步骤中剩余的未反应的小而密LDL中的胆固醇可在后续步骤中被定量测定。用于定 量测定LDL的常用方法可用于所述定量测定步骤中。此类方法的实例包括涉及加入LDL 絮凝剂并随后通过比浊测定来定量测定由此形成的LDL特异性聚集物含量的方法、涉及用 LDL特异性抗体进行抗原抗体反应的方法以及涉及利用酶定量测定降解产物的方法。在这些方法中，优选的方法涉及利用酶定量测定降解产物的方法。具体而言，所述方法涉及加入 用于胆固醇测定的酶(例如胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶)并释放和降解小 而密LDL中的胆固醇，并随后定量测定反应产物。在定量测定步骤中，将至少作用于小而密 LDL的表面活性剂用于小而密LDL中的胆固醇的定量测定。至少作用于小而密LDL的此类 表面活性剂可为仅作用于小而密LDL的表面活性剂、还作用于除小而密LDL之外的其它脂 蛋白的表面活性剂或作用于所有脂蛋白的表面活性剂。作为仅作用于小而密LDL的表面活性剂，可适当地采用聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚 物或其衍生物。聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物或其衍生物的实例包括基于Pluronic (商标) 的表面活性剂(例如 BASF 和 ADEKA 公司)例如 Pluronic 17R-4,Pluronic L-64,Pluronic PE3100、Pluronic P_85、Pluronic F_88、Pluronic P-103 禾口 Pluronic F-127。作为作用于所有脂蛋白的表面活性剂，可采用任何市售的表面活性剂，只要其在 用于总胆固醇测定的试剂等中使用即可。此类表面活性剂的优选实例为HLB在11以上且 小于14的聚氧乙烯衍生物、优选HLB在12以上且小于14的聚氧乙烯衍生物。此类表面 活性剂的具体实例包括聚氧乙烯壬基苯基醚(EMULGEN 909 (Kao公司))、聚氧乙烯烷基醚 (EMULGEN 707 (Kao 公司)和 EMULGEN709 (Kao 公司))。在定量测定小而密LDL的步骤中所用的反应液中，表面活性剂的浓度优选范围为 约0. 01 % (重量/体积)-10% (重量/体积)、更优选范围为约0. 1 % (重量/体积)-5% (重量/体积)。当采用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作为在定量测定小而密LDL的步骤中用于胆 固醇测定(与胆固醇反应)的酶时，酶反应产生过氧化氢。在过氧化物酶存在下通过与氢 供体和氢受体的偶联反应使由此产生的过氧化氢形成染料(有色醌)。通过在400-700nm 波长下测定染料可定量测定小而密LDL中的胆固醇。在定量测定步骤中优选使用的氢供体为苯胺衍生物。此类苯胺衍生物的实例包括 N-乙基-N- (2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N_乙基-N- (2-羟基-3-磺基丙 基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟 基-3-磺基丙基)_3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺基丙基)苯胺(HALPS)和N-(3-磺 基丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)。此类氢供体在反应液中所用的终浓度优选范围为 0.lmmol/L-1. 5mmol/L。作为氢受体，可采用4-氨基安替比林、甲基苯并噻唑酮腙 (methylbenzothiazolonhydrazone)等。当采用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作为用于胆固醇测定的酶时，通过酶反应由 NAD(P)产生NAD (P) H。可通过范围在330nm_400nm处吸光度测定由此产生的NAD (P) H，从而 定量测定小而密LDL中的胆固醇。依照本发明在清除L LDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤和清除除 LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤中，单价阳离子和/或二 价阳离子或其盐可用作离子强度调节剂。加入这样的离子强度调节剂促进小而密LDL从L LDL中区分开。具体而言，可采用氯化钠、氯化钾、氯化镁、二氯化锰、氯化钙、氯化锂、氯化 铵、硫酸镁、硫酸钾、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁等。在反应时这样的离子强度调节剂的浓度优 选范围为 Ommo 1/L-IOOmmol/L。
此外在本发明中，聚阴离子也可被加入至清除L LDL中的胆固醇并将其排除在反 应体系之外的步骤以及清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外 的步骤中，以调节磷脂酶对小而密LDL和L LDL的催化活性。作为被加入的聚阴离子，可 适当地采用肝素、磷钨酸或葡聚糖硫酸酯等。在肝素的情况下，聚阴离子在试剂中的浓度 优选范围为10U/mL-250U/mL ；在磷钨酸的情况下，其浓度优选范围为0. 02% (重量/体 积)-1.25% (重量/体积)；在葡聚糖硫酸酯的情况下，其浓度优选范围为0.02% (重量 /体积)-1.25% (重量/体积)。这些聚阴离子在反应液中的浓度优选范围分别为5U/ mL-250U/mL,0. 01% (重量 / 体积)_1· 25% (重量 / 体积)和 0. 01 % (重量 / 体积)_1· 25% (重量/体积)。本发明的各步骤中的反应优选在2V "450C的温度下进行，更优选在25°C _40°C的 温度下进行。各步骤中的反应优选实施1-10分钟，更优选实施3-7分钟。血清和血浆可以用作本发明的样品，但样品的实例并不限于此。本发明采用的自动分析仪的实例包括TBA-120FR · 200FR (TOSHIBA公司)、 JCA-BMl250 · 1650 · 2250 (JE0L 有限公司)、HITACHI 7180 · 7170 (Hitachi 有限公司)和 AU2700(OLYMPUS)。当实施本发明的测定方法时，本文所采用的试剂可分成多种试剂组合物。本发明 所采用试剂的实例包括与除L LDL和LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)反应的表面活 性剂，用于胆固醇测定的酶(例如胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)、表面活性剂、降解过氧化 氢的过氧化氢酶、用于经由偶联反应由过氧化氢形成染料的过氧化物酶、氢供体以及缓冲 剂。考虑到试剂的稳定性等，适当地将这些试剂分成不同的试剂组合物。本文中采用的试 剂组合物的数目可根据本发明方法的步骤数而定。例如，当存在包括以下的3个步骤时清 除L LDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤、清除除LDL之外的脂蛋白中的胆 固醇并将其排除在反应体系之外的步骤以及测定小而密LDL的步骤，制备3类试剂组合物 以实施各步骤。此外，清除L LDL中胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤和清除除LDL 之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤同时进行，则制备2类试剂组 合物；即制备一种用于实施所述合并步骤的试剂组合物和一种用于实施测定小而密LDL的 步骤的试剂组合物。在3个步骤的情况下，即在清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反 应体系之外的步骤、清除L LDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤、以及测定小 而密LDL的步骤的情况下，分别采用试剂组合物A (用于清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇的试剂组合物)、试剂组合物B (用于清除L LDL中胆固醇的试剂组合物)和试剂组合物 C(用于测定小而密LDL的试剂组合物)。在清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排 除在反应体系之外的步骤中采用的试剂组合物A至少包含作用于诸如VLDL和HDL的脂蛋 白的表面活性剂例如聚氧乙烯衍生物。在清除L LDL中胆固醇并将其排除在反应体系之 外的步骤中采用的试剂组合物B至少包含与L LDL反应的磷脂酶。在初始步骤中加入的试 剂组合物A或试剂组合物B还可包含降解胆固醇的酶(例如胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶)、 氢供体(例如苯胺衍生物)、清除过氧化氢的过氧化氢酶等。例如，当首先实施清除除LDL 之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤然后再实施清除L LDL中的胆
14固醇并将其排除在反应体系之外的步骤时，试剂组合物A至少包含作用于除LDL之外的脂 蛋白例如VLDL和HDL的表面活性剂(例如聚氧乙烯衍生物)并且还包含例如降解胆固醇的 酶(例如胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶)、氢供体(例如苯胺衍生物)以及清除过氧化氢的过 氧化氢酶。试剂组合物B至少包含与L LDL反应的磷脂酶并且若有必要可向其加入表面活 性剂。另一方面，当首先实施清除LLDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤然后 再实施清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤时，试剂组 合物B至少包含与L LDL反应的磷脂酶并且还包含例如降解胆固醇的酶(例如胆固醇酯酶 或胆固醇氧化酶)、氢供体(例如苯胺衍生物)以及清除过氧化氢的过氧化氢酶。试剂组合 物A至少包含作用于除LDL之外的脂蛋白例如VLDL和HDL的表面活性剂例如聚氧乙烯衍 生物。测定小而密LDL的试剂组合物的步骤中采用的试剂组合物C可包含仅与小而密LDL 反应的表面活性剂或者作用于所有脂蛋白的表面活性剂、氢供体(例如4-氨基安替比林) 和过氧化物酶等。与此同时，若有必要还可向试剂组合物A和试剂组合物B中加入一价阳 离子、二价阳离子或其盐或聚阴离子。此外，试剂组合物A和试剂组合物B可含有血清白蛋 白。各试剂组合物的pH可在中性pH附近，例如范围为pH6-pH8且优选范围为pH6. 5_pH7. 5。 PH可通过加入缓冲液调节。当按以下顺序实施本发明的3步法时清除除LDL之外脂蛋白中的胆固醇并将其 排除在反应体系之外的步骤、清除L LDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤和 测定小而密LDL的步骤，将试剂组合物A加入至样品中反应，加入试剂组合物B反应，加入 试剂组合物C反应并随后测定吸光度。样品的量和各试剂组合物的量不受到特别限制，并且可通过考虑各试剂组合物中 试剂的浓度等适当地确定。例如，样品可采用ι μ L-IO μ L，试剂组合物A、B和C各自可采 用 25μ L-200y L0当按以下顺序进行本发明的3步法时清除L LDL中的胆固醇并将其排除在反应 体系之外的步骤、清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤 和测定小而密LDL的步骤，首先将试剂组合物B加入样品中反应，随后加入试剂组合物A反 应，加入试剂组合物C反应，最后测定吸光度。在本发明的方法中，在测定小而密LDL的步骤之前将L LDL中的胆固醇和除LDL 之外的脂蛋白中的胆固醇排除在反应体系之外，致使可测定小而密LDL。作为将L LDL中的 胆固醇和除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇排除在反应体系之外的方法，除如上所述的清除 之外，还可采用用于聚集、抑制等的已知技术。此外，当在测定小而密LDL的步骤前实施两 个或更多个步骤时，可在完成将LLDL中的胆固醇和除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇排除在 反应体系之外的反应后的步骤中立即进行测定小而密LDL的步骤。因此，还可能的是在一 个步骤中使磷脂酶作用于L LDL中的胆固醇，随后在后续步骤中进行清除。或者，例如可能 的是在一个步骤中降解除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇，随后在后续步骤中进行清除。各 步的产物也可在同一步骤中清除。可将清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤和 清除L LDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外的步骤合并为单个步骤。当通过包含所 述单个步骤和测定小而密LDL的后续步骤这2步进行反应时，可在第一步中使用试剂组合 物AB(含有包含在以上试剂组合物A和试剂组合物B中的试剂)和试剂组合物C。具体而言，所述试剂组合物AB至少包含作用于除LDL之外的脂蛋白例如VLDL和HDL的表面活性 剂例如聚氧乙烯衍生物和与L LDL反应的磷脂酶。在这种情况下，将试剂组合物AB加入样 品中，使除L LDL和LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)作用于表面活性剂，将反应产物 与酶反应，随后加入试剂组合物C使小而密LDL作用于表面活性剂用于酶反应，然后测定小 而密LDL中的胆固醇。
实施例下面将参考以下实施例来更详细描述本发明，但本发明并不限于此。实施例1依次实施以下三个步骤清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇、清除L LDL中的胆 固醇和测定小而密LDL胆固醇，然后测定小而密LDL。在清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤中使用的试剂组合物A，在清除L LDL中胆固醇的步骤中使用的试剂组合物B和在测定小而密LDL胆固醇的步骤中使用的试 剂组合物C如下制备。
试剂组合物A PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 胆固醇酯酶 胆固醇氧化酶 过氧化氢酶 牛血清白蛋白 TOOS
50mmol/L 0. 6U/mL 0.5U/mL 600U/mL 0.5% (重量 20mmol/L
体积)
聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]
0. 27% (重量/体积) 聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]
0. 03% (重量/体积)
试剂组合物B PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 磷脂酶 A2 [Asahi Kasei 公司，PLA2] 氯化钙 试剂组合物C PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 4_氨基安替比林 过氧化物酶
叠氮化钠0. 05 % (重量/体积)
聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]
1.0% (重量/体积) 将试剂组合物A(75yL)加入2yL血清样品中，然后在37°C下反应5分钟。加入 试剂组合物B (75 μ L)，然后反应5分钟。再加入试剂组合物C(50yL)，然后反应5分钟。然 后在600nm的主波长和700nm的亚波长处测定吸光度。
50mmol/L 11. OU/mL 1OOmmo1/L
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O单位/mL 0. 05% (重量
在用于比较的对照方法中使用用于测定小而密LDL胆固醇的sd LDL-C “SEIKEN“ 试剂(DENKA SEIKEN Co. , Ltd.)，并随后比较小而密LDL胆固醇的浓度。图1显示所述结果。
如图1所示，该实施例的方法表现出与采用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。脂酶。

实施例2
由实施例1中采用的试剂组合物B制备试剂组合物，其包含磷脂酶C[PLC]作为磷
50mmol/L 0. 6U/mL 0.5U/mL 600U/mL 2. Ommo 1/L
试剂组合物A PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 胆固醇酯酶 胆固醇氧化酶 过氧化氢酶 TOOS
聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]
0. 27% (重量/体积) 聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]
0. 03% (重量/体积)
试剂组合物B PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 磷脂酶 C[Asahi Kasei 公司，PLC] 试剂组合物C PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 4_氨基安替比林 过氧化物酶
叠氮化钠0. 05 % (重量/体积)
聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]
1.0% (重量/体积)
50mmol/L 1. 16U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. 0单位/mL 0. 05% (重量
测定以与实施例1的方法相似的方式实施。将结果与利用sdLDL-C “SEIKEN”试 剂得到的结果作比较。图2显示所述结果。 如图2所示，该实施例的方法表现出与采用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。脂酶。

实施例3
由实施例1中采用的试剂组合物B制备试剂组合物，其包含磷脂酶D [PLD]作为磷
试剂组合物A PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 胆固醇酯酶 胆固醇氧化酶
50mmol/L 0. 6U/mL 0. 5U/mL
1. 36U/mL
作为磷脂酶。
1. 18U/mL
PIPES 缓冲液(pH 7.0)4-氨基安替比林过氧化物酶叠氮化钠聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O单位/mL 0. 05% (重量/体积)
1.0% (重量/体积)测定以与实施例1的方法相似的方式实施。将结果与利用sdLDL-C “SEIKEN”试 剂得到的结果作比较。图4显示所述结果。如图4所示，该实施例的方法表现出与采用sd LDL-C "SEIKEN"试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例5由实施例1中采用的试剂组合物B制备试剂组合物，其包含特异性针对甘油磷脂 的磷脂酶[PLDP]作为磷脂酶。试剂组合物APIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L胆固醇酯酶0.6U/mL胆固醇氧化酶0. 5U/mL过氧化氢酶600U/mLTOOS2. Ommo 1/L聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]0.27% (重量 / 体积)聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A_90]0. 03% (重量 / 体积)试剂组合物BPIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L磷脂酶[AsahiKasei 公司，PLDP]7. 5U/mL试剂组合物CPIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L4-氨基安替比林4. Ommol/L过氧化物酶4. O单位/mL叠氮化钠0.05% (重量/体积)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 体积)测定以与实施例1的方法相似的方式实施。将结果与利用sdLDL-C “SEIKEN”试 剂得到的结果作比较。图5显示所述结果。如图5所示，该实施例的方法表现出与采用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例6由实施例1中采用的试剂组合物B制备试剂组合物，其包含鞘磷脂酶[SPC]作为
1950mmol/L 0. 97U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. 0单位/mL 0. 05% (重量
磷脂酶。试剂组合物APIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L胆固醇酯酶0. 6U/mL胆固醇氧化酶0. 5U/mL过氧化氢酶600U/mLTOOS2. Ommo 1/L聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]0.27% (重量 / 体积)聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]0. 03% (重量 / 体积)试剂组合物BPIPES 缓冲液(pH 7. 0)鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]试剂组合物CPIPES 缓冲液(pH 7. 0)4-氨基安替比林过氧化物酶叠氮化钠0.05% (重量/体积)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 体积)测定以与实施例1的方法相似的方式实施。将结果与利用sdLDL-C “SEIKEN”试 剂得到的结果作比较。图6显示所述结果。如图6所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C "SEIKEN"试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例7依次实施以下三个步骤清除L LDL中的胆固醇、清除除LDL之外的脂蛋白中的胆 固醇和测定小而密LDL胆固醇，然后测定小而密LDL。在清除L LDL中胆固醇的步骤中使用的试剂组合物B，在清除除LDL之外的脂蛋白 中的胆固醇的步骤中使用的试剂组合物A，和在测定小而密LDL胆固醇的步骤中使用的试 剂组合物C如下制备。试剂组合物BPIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L 胆固醇酯酶0. 6U/mL 胆固醇氧化酶0.5U/mL 过氧化氢酶600U/mL 牛血清白蛋白0.5% (重量 体积)TOOS2. Ommo 1/L 鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]0. 485U/mL
试剂组合物APIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]0.6% (重量 / 体积)试剂组合物CPIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L4-氨基安替比林4. Ommol/L过氧化物酶4. O单位/mL叠氮化钠0.05% (重量/体积)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 体积)将试剂组合物B (75 μ L)加入2 μ L血清样品中，然后在37°C下反应5分钟。加入 试剂组合物A(75yL)，然后反应5分钟。再加入试剂组合物C(50yL)，然后反应5分钟。在 600nm的主波长和700nm的亚波长处测定吸光度。在用于比较的对照方法中采用用于测定小而密LDL胆固醇的sd LDL-C “SEIKEN“ 试剂(DENKA SEIKEN Co.，Ltd.)，并随后比较小而密LDL胆固醇的浓度。图7显示所述结^ ο如图7所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例8在该实施例中，清除L LDL中胆固醇的步骤和清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固 醇的步骤(即清除除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤)同时进行。清除LLDL 的步骤和清除除LDL之外的脂蛋白的步骤(即清除除小而密LDL之外的脂蛋白的步骤)中 采用的试剂组合物AB和测定小而密LDL的步骤中采用的试剂组合物C如下制备。试剂组合物AB
PIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L
胆固醇酯酶0. 6U/mL
胆固醇氧化酶0.5U/mL
过氧化氢酶600U/mL
牛血清白蛋白0. 5% (重量/体积)
TOOS2. Ommol/L
鞘磷脂酶[Asahi Kasei公司，SPC]1. 46U/mL
聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]
0. 135% (1is.1体积)
聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGENA-90]
0. 015% ( iis. /1体积)
试剂组合物C
PIPES 缓冲液(pH 7. 0)50mmol/L
4_氨基安替比林4. Ommol/L
21
过氧化物酶4. 0单位/mL叠氮化钠0.05% (重量/体积)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 体积)将试剂组合物AB(150 μ L)加入2 μ L血清样品中，然后在37°C下反应5分钟。加 入试剂组合物C (50 μ L)，然后反应5分钟。然后在600nm的主波长和700nm的亚波长处测
定吸光度。在用于比较的对照方法中采用用于测定小而密LDL胆固醇的sd LDL-C “SEIKEN“ 试剂(DENKA SEIKEN Co.，Ltd.)，并随后比较小而密LDL胆固醇的浓度。图8显示所述结^ ο如图8所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C “SEIKEN“试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例9由实施例6中采用的试剂组合物A制备试剂组合物，其包含单一类型的表面活性 剂 EMULGEN B-66。试剂组合物APIPES 缓冲液(pH 7. 0)胆固醇酯酶胆固醇氧化酶过氧化氢酶TOOS聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]试剂组合物BPIPES 缓冲液(pH 7. 0)鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]试剂组合物CPIPES 缓冲液(pH 7. 0)4-氨基安替比林过氧化物酶叠氮化钠聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 体积)测定以与实施例1的方法相似的方式实施。将结果与利用sdLDL-C ‘‘SEIKEN”试 剂得到的结果作比较。图9显示所述结果。如图9所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C "SEIKEN"试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例10由试剂组合物AB制备含单一类型的表面活性剂EMULGENA-90的试剂组合物。
50mmol/L 0. 6U/mL 0.5U/mL 600U/mL 2. Ommo 1/L
0. 27% (重量/体积)
50mmol/L 0. 97U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. 0单位/mL 0. 05% (重量/体积)试剂组合物AB PIPES 缓冲液(pH 7. 0) 胆固醇酯酶 胆固醇氧化酶 过氧化氢酶 牛血清白蛋白 TOOS
鞘磷脂酶[Asahi Kasei公司，SPC]
50mmol/L 1. 2U/mL
0. 3U/mL 1200U/mL 1.0% (重量
2.Ommo 1/L
3.OU/mL
体积)
聚氧乙烯联苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]
试剂组合物C PIPES 缓冲液(pH 7. 0)
4_氨基安替比林
0. 18% (重量/体积)
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O单位/mL 0. 05% (重量/体积)过氧化物酶叠氮化钠聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 709]1.0% (重量 / 体积)将试剂组合物ΑΒ(150 μ L)力口入2 μ L血清样品中，然后在37°C下反应5分钟。再 加入试剂组合物C (50 μ L)，然后反应5分钟。在600nm的主波长和700nm的亚波长处测定
吸光度。采用超速离心法作为对照。图10显示所述结果。如图10所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例11由不包含其中所用的表面活性剂的试剂组合物AB制备试剂组合物。试剂组合物ABPIPES 缓冲液(pH 7. 0)胆固醇酯酶胆固醇氧化酶过氧化氢酶牛血清白蛋白TOOS鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]试剂组合物CPIPES 缓冲液(pH 7. 0)4-氨基安替比林过氧化物酶叠氮化钠0.05% (重量/体积)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 709]
50mmol/L 0. 6U/mL
0.3U/mL 1200U/mL 1.0% (重量 2. Ommo 1/L
1.6U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O单位/mL 0. 05% (重量
体积)
23
1.0% (重量 / 体积)将试剂组合物ΑΒ(150 μ L)力口入2 μ L血清样品中，然后在37°C下反应5分钟。再 加入试剂组合物C (50 μ L)，然后反应5分钟。在600nm的主波长和700nm的亚波长处测定
吸光度。采用超速离心法作为对照。图11显示所述结果。如图11所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。实施例12通过加入各种的表面活性剂由实施例1中采用的试剂组合物A制备试剂。此处加 入的表面活性剂为 NONION HS215,EMULGEN920,NONION NS220,NONION HS220,NONION NS230 或 PERSOFT EP0 NONION HS215,EMULGEN 920 和 NONION NS220 按 0.03% (重量 / 体积)加 入。NONION HS220、NONION NS230 和 PERSOFT EP 按 0. 06% (重量 / 体积)加入。0. 97U/mL
试剂组合物C
PIPES 缓冲液(pH 7. 0)
4_氨基安替比林
50mmol/L 4. Ommo 1/L
4. 0单位/mL 0. 05% (重量
体积)过氧化物酶叠氮化钠聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 体积)测定以与实施例1的方法相似的方式实施。将结果与利用sdLDL-C “SEIKEN”试 剂得到的结果作比较。表1显示所述结果。如表1所示，该实施例的方法表现出与利用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小 而密LDL胆固醇的方法的良好的相关性。
如表1所示，使用以组合的方式包含作为表面活性剂的EMULGEN B-66和NONION HS215, EMULGEN 920、N0NI0NNS220、NONION HS220、NONION NS230 或 PERSOFT EP 的试剂组 合物A的方法表现出与利用sd LDL-C “SEIKEN”试剂用于测定小而密LDL胆固醇的方法的 良好的相关性。表 1 本文列举的所有出版物、专利及专利申请以其全部内容在此引作参考。
权利要求
一种定量测定样品中的小而密LDL胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇，以及随后(2)定量测定剩余的小而密LDL中的胆固醇。
2.权利要求1的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(1)中使用的磷脂 酶与至少鞘磷脂和/或磷脂酰肌醇具有高反应性，其为存在于脂蛋白中的磷脂。
3.权利要求1或2的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(1)中使用的 磷脂酶的浓度范围为0. lU/mL-100U/mL。
4.权利要求1-3中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2) 中在至少作用于小而密LDL的表面活性剂的存在下加入用于胆固醇测定的酶。 >
5.权利要求4的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中使用的至 少作用于小而密LDL的表面活性剂是作用于所有脂蛋白的表面活性剂。
6.权利要求4或5的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中使用 的至少作用于小而密LDL的表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物、或HLB 为11以上且少于14的聚氧乙烯衍生物。
7.权利要求1-6中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，所述方法还包括 在胆固醇酯酶存在下清除样品中的除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(a)，该步骤在 步骤(2)之前并在步骤(1)之前、之后或者同时实施。
8.权利要求7的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中使用的胆固 醇酯酶的浓度范围为0. 01U/mL-10U/mL。
9.权利要求7或8的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加 入作用于除LDL之外脂蛋白的表面活性剂。
10.权利要求9的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中使用的表 面活性剂的浓度范围为0. 05% -1. 0%。
11.权利要求7-10中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤 (a)中还加入胆固醇氧化酶和过氧化氢酶。
12.权利要求7-10中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤 (a)中还加入胆固醇氧化酶和4-氨基安替比林。
13.权利要求7-12中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a) 的反应和步骤(1)的反应在同一溶液中同时进行。
14.权利要求7-13中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a) 中使用的表面活性剂为选自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚 氧乙烯烷基胺的非离子型表面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫 酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵盐、季 铵盐和单直链烷基型表面活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二甲基 烷基甜菜碱、咪唑啉型表面活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂。
15.一种用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，所述试剂盒包含至少以下两类试 剂组合物⑴用于清除样品中的除小而密LDL之外LDL中的胆固醇的试剂组合物，该试剂组合物 至少包含与除小而密LDL之外的LDL反应的磷脂酶；( )用于测定小而密LDL的试剂组合物，其包含仅与小而密LDL或其衍生物反应的作为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的表面活性剂；或 作为HLB在11以上且小于14的聚氧乙烯衍生物的表面活性剂；4_氨基安替比林；和过氧化物酶。
16.权利要求15的用于定量测定小而密LDL胆固醇的包含至少3种试剂组合物的试剂 盒，所述试剂盒还包含(iii)用于清除除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的试剂组合物，所述 试剂组合物包含选自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非 离子型表面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸 盐和磷酸盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵盐、季铵盐和单直链烷 基型表面活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱、咪唑 啉型表面活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂。
17.权利要求15的用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，其中所述试剂组合物 ⑴还包含选自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非离子型表面活 性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐型 表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵盐、季铵盐和单直链烷基型表面活性 剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱、咪唑啉型表面活性 剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂，由此通过所述试剂组合物⑴清除样品中的除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇。
18.权利要求15-17中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，其中磷脂酶 与脂蛋白中存在的磷脂中的至少鞘磷脂和/或磷脂酰肌醇具有高反应性。
全文摘要
本发明公开了一种分级测定小而密LDL的方法以及试剂，其使得能够在无需任何预处理样品的情况下进行快速、简便和高特异性的分析。本发明具体公开了用于定量测定样品中小而密LDL胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤(1)和(2)(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇，和(2)测定经过步骤(1)后剩余的脂蛋白中的胆固醇的量。
文档编号C12Q1/30GK101896620SQ20088012108
公开日2010年11月24日 申请日期2008年10月10日 优先权日2007年10月10日
发明者伊藤康树, 藤村美树 申请人:电化生研株式会社