细胞测定套件和方法

专利名称：细胞测定套件和方法
技术领域：
本发明是针对一种细胞测定套件和方法，用于确定在一种细胞样品中给定类型的 细胞的存在和/或浓度，并且特别是在该样品中存在至少一个所选定的阈值水平的细胞。
背景技术：
多种疾病病况，包括对一种疾病状态的治疗的反应，可以通过血液学标志物、使用 在一种血液样品中某些白血细胞的近似浓度作为针对该疾病的身体反应的一种指示物进 行监测。例如，在一种血液样品中⑶4+T-淋巴细胞的浓度可以为HIV感染之后AIDS的爆 发提供一种标志物。低于约200个细胞/μ 1的细胞计数表示了一种受到严重削弱的免疫 系统，以及因此对立即开始(例如)抗逆转录病毒治疗(ART)的需要。一些疾病病症(例 如，病毒或细菌感染)的特征是增加浓度的血液白细胞，例如超过约10，000个细胞/μ 1血 液，因此这可以充当一种传染性疾病状态的指示物。相反地，在一个患有白血病或正在进行 化疗或放疗的个体中，在一种血液样品中白细胞的浓度可以被降低，例如低于约4，000个 细胞/μ 1血液。在这些和其他特征为降低或升高的水平的一种白细胞类型的疾病病症中， 可以将这些标志物细胞的水平用于检测或证实一种病症、或监测身体对该病症的治疗的反 应。目前，存在着两种通用的血液学方法，这些方法通常被用于确定在一种细胞样品 中给定细胞的浓度。在第一种方法中，所感兴趣的细胞类型用一种标志物进行标记，该标志 物特异性地结合到该细胞类型上，典型地是一种抗原特异性抗体。然后，用一种细胞计数器 (例如，一台流式细胞仪或一台荧光活化细胞分选仪(FACS))对该细胞样品进行分析，以便 确定具有该表面结合标志物的细胞的百分数。第二种通用的方法是标记所感兴趣的细胞并且通过显微镜检测来检查一种代表 性细胞的体积，对标记的以及未标记的细胞的数目进行计数以便确定所感兴趣的细胞类型 的百分数。在这两种方法中，特别是其中希望确定一种给定的白细胞类型的浓度时，可以首 先对该细胞样品进行处理以去除红细胞或其他不需要的细胞。以上概述的方法非常适合于实验室或诊所，在那些地方良好训练的实验室人员以 及细胞分选或组织学设备是可供使用的。然而，它们不能使其自身容易地用于现场条件，例 如第三世界国家中的店面诊所、或野外诊所，在那里没有经过训练的实验室人员或尖端的 细胞分选或显微镜设备。例如，在更为贫困的非洲地区，这些方法可能不太适合于对大量的 人群测试CD4+T细胞计数，作为HIV感染之后AIDS爆发的一种指示物，或者不太适合于一 个人对(例如)抗逆转录病毒药物的反应。因此，令人希望的是提供简单、快速、廉价的套件和方法用于对疾病相关的细胞(例如，在一种血液样品中所选出的白细胞)确定细胞计数。具体地，这种方法和套件应当 可以仅用最少的训练来容易地进行操作，并且需要极少的实验设备或不要求特别的实验设 备，例如，超过一台简单的(例如)手动驱动的台式离心机。

发明内容
一方面，本发明包括一种用于对细胞样品测定存在至少一个阈值浓度的给定类型 细胞的方法。该方法包括以下步骤(a)将含有该给定细胞类型的多个细胞的一种细胞样品与多个颗粒进行反应，这 些颗粒能够特异性连接到这些细胞上并且当与这些细胞相连接时对于增加这些细胞的密 度或磁化率是有效的，从而允许在一种重力或所施用的离心力或磁场力的影响下基于它们 的穿过一种选定介质的更大的迁移速率将该样品中的结合颗粒的细胞以及游离的颗粒与 无颗粒结合的细胞分开，(b)使该细胞样品中的这些结合颗粒的细胞与颗粒迁移穿过一个长形的收集室， 该收集室含有该选定的介质并且沿着它的长度具有多个细胞收集区，通过使该样品受到一 种重力或所选定的离心力或磁场力持续一段时间，该时间足以使这些结合颗粒的细胞以及 颗粒完全填满该收集室中的依次的细胞收集区，并且(c)检查该室以便确定该至少一个选定的收集区是否部分地或完全被填满，作为 该细胞样品含有至少一个阈值浓度的给定细胞类型的细胞的证据。在一个通用的实施方案中，该收集室包括一个收集柱，该柱中的收集区包括沿着 该柱的一部分的多个限定长度的片段，并且这些收集区在步骤(b)中沿着该收集室的柱长 度以下游至上游的方向被依次地填满。在另一个通用的实施方案中，该收集室包括一个长形的收集管；以及在该收集 管中形成这些收集区的、在该管中所安排的多个空腔，这样将在步骤(b)中以上游至下游 的方向迁移穿过该管的细胞在最上游的空腔中被捕获直到填满，在这之后以上游至下游的 方法依次地填满这些空腔。这些颗粒当在步骤(a)中与这些细胞相连接时对于用一种可检出的报告基因对 这些细胞进行标记是有效的，并且所述检查包括对该收集室肉眼检查存在用该可检出的报 告基因标记的细胞。该方法中步骤(b)包括通过将该室置于一个基本上直立的垂直布置的位置上使 这些结合颗粒的细胞受到重力，或使这些结合颗粒的细胞受到一种离心力。在这些实施方 案中，该选定密度的介质具有一种密度，该密度大于该样品的密度并且低于这些颗粒的密 度，并且这些颗粒可以是基本上球形的金属颗粒，这些颗粒具有优选的直径，这些直径在所 选定的约0. 05至5微米的大小范围内，优选地在0. 2至5微米范围内。可替代地，在该方法中步骤(b)可以包括使这些结合颗粒的细胞受到磁场力。在 该实施方案中，该选定密度的介质具有一种密度，该密度大于该样品的密度，并且这些颗粒 可以是基本上球形的磁性(铁磁或顺磁)颗粒，这些颗粒优选地具有的直径为在约5至 10，OOOnm之间，优选地在5至50nm范围内。在该方法中步骤(b)可以进一步包括将该含有结合颗粒的细胞的样品加入到该 收集室的一种界面区上游，并且将该样品中的细胞与在该界面区中的一种选定密度的介质进行物理混合。当该细胞样品是一种血液样品时，这些颗粒可以使表面结合的结合蛋白能够与一 种血细胞特异性抗原(例如，与特征为一种或多种特异性细胞类型的抗原)进行免疫反应。 这些颗粒可以受到表面处理以降低血液样品中的颗粒聚集。为了检测来自一个可能感染HIV的个体的血液样品中⑶4+T淋巴细胞的浓度，作 为该个体的T细胞种类的一种指示物，反应步骤(a)是通过将来自该个体的一种血液流体 样本暴露于具有表面结合的抗-CD4+结合剂的颗粒来进行的，并且步骤(c)可以基于观察 到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表CD4+T-淋巴细胞的浓度，该浓度在一种选定 的200-750个细胞/μ 1血液的阈值范围内，例如，250、350、450、或750个细胞/μ 1血液的 阈值。在一个实施方案中，步骤(a)可以进一步包括将该样品中的细胞与能够特异性地 结合到单核细胞上的CD14抗原上的第一批颗粒进行反应，并且与能够特异性地结合到T淋 巴细胞和单核细胞上的CD4抗原的第二批颗粒进行反应，由此在这些T淋巴细胞上给予增 强的密度，并且在这些单核细胞上给予增强的密度以及磁化率，并且步骤(b)可以进一步 包括首先将结合颗粒的单核细胞从该细胞样品中去除，这是通过施用一种磁力来进行的， 该磁力对于将这些结合颗粒的单核细胞从结合颗粒的T淋巴细胞中选择性地去除是有效 的。两种颗粒还可以按照已限定的比率同时进行施用，确保了在统计学上这些单核细胞与 具有磁化率的至少一种颗粒进行结合。其他去除不令人希望的细胞(具有与这些靶细胞相 同的表面标志物)的可能的方法是i)用空间大的珠粒掩蔽这些目标表面标志物，这些珠 粒对这些干扰细胞类型上的其他非目标表面标志物具有亲和性(例如，在将该样品暴露于 这些抗-⑶4珠粒之前使用非致密的、并且不受磁性影响的抗⑶14珠粒首先涂覆这些单核 细胞)，由此由于这些抗CD14珠粒覆盖这些单核细胞的遮蔽作用来防止这些抗CD4珠粒与 这些单核细胞上的CD4标志物相结合。ii)通过其他手段(例如，使用抗体介导的四聚体抗 体复合物，这些复合物对例如CD14抗原以及红细胞表面标志物均具有特异性)来遮蔽不令 人希望的细胞上的目标表面标志物，由此遮蔽这些单核细胞，这是通过用一个致密层的红 细胞将它们覆盖来进行的。iii)这些干扰性非目标细胞能够通过特异性地捕获这些细胞、 通过一种固体基质(含有，例如对抗仅在这些干扰细胞上存在的表面标志物的抗体)而被 去除。例如，抗CD14抗体可以被固定在一种过滤基质上。在将该血液样品暴露于该过滤基 质之后，这些单核细胞通过结合到该基质上而从该血液样品中弃去，在这之后将该血液样 品暴露于抗CD4颗粒。为了对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行检测，该个体可能患有一种 导致血液中白细胞升高的传染病或其他病症，反应步骤(a)是通过将来自该个体的一种血 液流体样本暴露于具有表面结合的抗白细胞结合剂的颗粒来进行的，并且步骤(c)可以是 基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表白细胞大于约10，000个细胞/μ 1 血液的浓度。为了对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行监测，该个体由于化疗、放 疗或白血病可能在血液中具有降低的白细胞数目，反应步骤(a)可以是通过将来自该个体 的一种血液流体样品暴露于具有表面结合的抗_白细胞结合剂的颗粒来进行的，并且步骤 (c)可以是基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表白细胞小于约4，000个
8细胞/μ 1血液的浓度。为了对来自一个个体的血液样品中嗜中性细胞的浓度进行监测，该个体由于化疗 或干扰素治疗可能在血液中具有降低的嗜中性细胞数目，反应步骤(a)可以是通过将来自 该个体的一种血液流体样品暴露于具有表面结合的抗_嗜中性细胞结合剂的颗粒来进行 的，并且步骤(c)可以基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表嗜中性细胞 在一个选定的在500至2，500细胞/y 1血液之间的范围内的浓度。为了对来自一个感染的个体的体液样本中细菌细胞的浓度进行检测，作为感染的 程度和类型的一种指示物，反应步骤(a)可以是通过将该个体的一种体液样品暴露于具有 一种表面接合的结合剂的颗粒来进行的，该结合剂能够特异性地与一种或多种选定的细菌 壁抗原相结合，并且步骤(c)可以是基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在对 应于在该血液样品中一种可检出浓度的细菌细胞。另一方面，本发明包括了一种用于对细胞样品测定在该样品中存在至少一个阈值 浓度的选定细胞类型的细胞的套件。该套件包括(a) 一种测定装置，该测定装置具有一个用于接受该细胞样品的样品室、以及与其 进行流体相通的一个长形的收集室，该收集室含有一种选定的介质并且沿着它的长度具有 多个细胞收集区。(b) 一些颗粒，这些颗粒当被加入到该细胞样品中时能够特异性连接到该选定细 胞类型的细胞上，并且这些颗粒当连接到这些细胞上时对于增加这些细胞的密度或磁化率 是有效的，从而允许在一种重力或选定的离心力或磁场力的影响下使该细胞样品中的结合 颗粒的细胞以及颗粒优先地迁移穿过该长形的收集室，直到基本上所有这些结合颗粒的细 胞以及颗粒完全填满该收集室中依次的细胞收集区，并且(c)与该装置收集室上的至少一个收集区相关联的一种或多种标记，这种或这些 标记表示该选定类型的细胞对于至少部分地填满该收集区有效的浓度，这是当结合颗粒的 细胞以及游离的颗粒被牵引穿过该收集室时进行的。在不同的实施方案中(1)该收集室包括一个收集柱，该柱中的收集区包括沿着 该柱的一部分的多个限定长度的片段，并且这些收集区被适配为沿着该收集室的柱长度以 下游至上游的方向被按步骤依次地填满；(2)该收集室包括一个长形的收集管；以及在该 收集管中形成这些收集区的、在该管中所安排的多个空腔，并且这些收集区被适配为沿着 该柱长度以上游至下游的方向被依次地填满；(3)该收集室包括一个收集管，该收集管具 有多个相对成角度的流动片段；以及在该收集管中形成这些收集区的、在邻近的流动片段 之间所安置的多个有边缘(rimmed)的空腔，这样使得以上游至下游的方向从一个流动片 段迁移到另一个流动片段的细胞在这两个流动片段之间的空腔中被捕获，直到该空腔被填 满；(4)该收集室包括一个收集管，该收集管在一种重力之下相对于该管中的结合颗粒的 细胞的流动方向成角度；以及在该收集管中形成这些收集区的、沿着该管的一个外表面部 分所安置的多个空腔，这样使得以上游至下游的方向迁移穿过该收集管的细胞在最上游的 空腔中被捕获直到被填满，并且(5)该收集室包括一个流动管，该流动管在一种重力下相 对于结合颗粒的细胞的流动方向基本上横向地延伸；以及在该收集室中形成这些收集区 的、沿着该流动管的长度所安置的多个空腔，这样使得以上游至下游的方向流动穿过该流 量管的细胞沉淀进入到该最上游的空腔中直到填满，在此之后以上游至下游的方向依次地将这些空腔填满。该装置进一步包括一个与该样品室相通的捕获室，并且颗粒(b)包括一种第一类 型的、能够与在该选择类型的细胞以及一种非选定类型的细胞上呈递的一种抗原进行特异 性结合的颗粒，以及一种第二类型的、能够仅与该非选定类型的细胞上呈递的一种抗原进 行特异性结合的颗粒，允许在该选定类型的细胞迁移之前将结合到第二种类型的颗粒上的 颗粒通过迁移到该捕获室中而被选择性地去除，这些细胞仅结合到该第一类型的颗粒上以 便选择性地迁移到该收集室中。当这些结合颗粒的细胞被适配为在一种重力或所施用的离心力的影响下迁移穿 过该收集区时，这些颗粒可以是基本上球形的金属颗粒，这些颗粒所具有的直径在优选选 择的在约0. 2至2um之间的大小范围内。为了对一种血液样品中的一种给定类型的细胞进 行检测，这些颗粒可能具有能够与一种血细胞特异性的抗原进行免疫反应的表面结合的结 合蛋白。这些颗粒受到表面处理以降低血液样品中的颗粒聚集，例如用一种亲水性聚合物 涂层(例如，聚乙二醇聚合物链)进行涂覆。当这些结合颗粒的细胞被适配为在一种磁场力的影响下迁移穿过该收集区，这些 颗粒是基本上球形的磁性颗粒或顺磁颗粒，这些颗粒所具有的直径在一个优选选择的在约 5至-50nm之间的大小尺寸范围内。为了对来自一个可能感染HIV的个体的血液样品中⑶4+T-淋巴细胞的浓度进行 检测，作为该个体的T细胞种类的一种指示物，这些颗粒具有表面结合的抗CD4+结合剂，并 且所述标记被设计为表示⑶4+T淋巴细胞约200个细胞/ μ 1血液的浓度以及约500个细 胞/μ 1血液的细胞浓度。为了对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行检测，该个体可能患有一种 导致该血液中白细胞升高的传染病或其他病症，这些颗粒具有表面结合的抗白细胞结合 剂，并且这些标记被设计为表示白细胞大于约10，000个细胞/ μ 1血液的浓度。为了对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行监测，该个体由于化疗、放 疗或白血病可能在血液中具有降低的白细胞数目，这些颗粒可能具有表面结合的抗白细胞 结合剂，并且这些标记被设计为表示白细胞小于约4，000个细胞/ μ 1血液的浓度。为了对来自一个个体的血液样品中嗜中性细胞的浓度进行监测，该个体由于化疗 或干扰素治疗可能在血液中具有降低的嗜中性细胞数目，这些颗粒具有表面结合的抗嗜中 性细胞结合剂(例如，⑶16)，并且这些标记被设计为表示嗜中性细胞在一个选定的500至 2，500个细胞/ μ 1血液的范围内的浓度。为了对来自一个感染个体的血液或尿液样品中一种细菌感染的存在进行检测，这 些颗粒可能具有能够与一种细菌壁抗原进行特异性结合的表面结合的结合剂，并且这些标 记被设计为表示在血液或尿液样品中细胞的存在。该套件可以进一步包括一种装置支持器，该支持器用于支持该装置并且对所支持 的装置施用一种离心力或磁场力。本发明的这些和其他连同特征当结合附图阅读以下本发明的详细说明时应当变 得更加完全清楚。


图1是在一个通用的实施方案中形成本发明的套件的一部分的测定装置的平面图；图2展示了在一个通用的实施方案中以本发明的测定套件的操作为基础的结合 以及细胞迁移事件；图3A至3C示出了在一个第二通用的实施方案中本发明的装置的收集室的侧视截 面图，其中该收集室包括多个成角度的流动片段以及安置在邻近的流动片段之间的有边缘 的空腔(图3A和3B)，并且其中该收集室在一种所施用的力之下相对于在该管中结合颗粒 的细胞的流动方向成角度，并且具有沿着该管的一个表面部分所安置的多个空腔；图4展示了结合颗粒的细胞在图3B中所展示的装置的空腔中以上游至下游的方 向依次进行的累积；图5是在本发明的一个第三通用的实施方案中该收集室的侧视截面图；图6展示了根据本发明的一种检测装置用于检测一个个体内CD4+细胞的阈值水 平的用途；图7A至7C在示意图(7A)、摄像图(7B)、以及荧光读取图(7C)中示出了根据本发 明的方法所进行的一种测定操作的末端；图8示出了在本发明的测定方法中仅针对珠粒(左道)、以及IxlO5个细胞(中 道)、以及5x10s个细胞(右道)的末端结果；图9A至9B展示了使用一种两室装置的测定，该装置允许初步去除一种不需要的 细胞类型，该细胞类型与所感兴趣的细胞类型共有一种关键的表面抗原；并且图IOA至IOC展示了在一种适合于通过沉淀(IOA)、或在所施用的离心力(IOB)或 磁场力(IOC)之下进行细胞迁移的支持器中的样品装置。
具体实施例方式I.定义除非另外说明，以下术语在此具有以下含义一种“细胞样品”指在含有或怀疑含有一种或多种处于悬浮状态的细胞类型的任 何液体样品。一种细胞样品包括一种“体液样品”，该体液样品是指例如从人类或其他动物 体获得的血液、尿液、或唾液样品。一种血液样品可以是全血或经处理的血液、或其中所有 或大量的红细胞已被去除的全血。其他可能的细胞样品包括例如从组织样品、废水获得的 细胞培养物、细胞提取物。怀疑含有细胞的细胞样品包括例如用一种不需要的(例如)细 胞或细菌类型污染的牛奶和其他食物。在一种细胞样品中细胞的“浓度”是指在一个给定的细胞样品体积中细胞的数目。 该术语被典型地表达为每个样品体积的细胞数目。一种“给定类型的细胞的阈值水平或浓度”是指在一个给定体积的样品中所含有 的细胞的阈值数目，也表示为细胞浓度，例如CD4+细胞的数目大于500个细胞/ μ 1血液样 品，或CD4+细胞的数目小于200个细胞/ μ 1血液样品。细胞的“沉淀”指在一种液体悬浮液中颗粒在重力的影响下从该悬浮液中沉降出、 或者沉降到该悬浮液的底部或进入不同密度或粘度的另一种液体介质中。—种“给定类型”的细胞或“分析物”细胞是指在一种样品中其浓度有待测定的细胞。这些细胞可以是细菌性或病毒性颗粒(例如，来自一种体液样品)、哺乳动物细胞(例 如，下表中列出的白细胞类型)或细胞碎片(例如，血小板)、来自一种血液样品、组织或器 官衍生的哺乳动物细胞(例如，由一种实体瘤或其他组织肿块所衍生的癌细胞)、所培养的 或其他的分离的植物或动物细胞、来自单细胞真核生物的细胞(例如，酵母细胞)、以及在 一种工业的、环境的或城市的样品中所含有的细胞(例如，土壤或废水样品中所含有的细 菌)。一种给定类型的白细胞其特征可以典型地是细胞表面特异性抗原标志物(例如CD)， 这些⑶抗原标志物是在下表中所表示的白细胞类型的特征。
细胞类型⑶标记物干细胞CD34+, CD31-所有白细胞的基团CD45+粒细胞CD45+，CD15+单核细胞CD45+，CD14+T淋巴细胞CD45+, CD3+T辅助细胞CD45+，CD3+, CD4+细胞毒性T细胞CD45+，CD3+,CD8+B淋巴细胞CD45+，CD 19+or CD45+，CD20+凝血细胞CD45+，CD61+自然杀伤细胞CD16+, CD56+, CD3-细胞的“迁移”是指细胞在一种重力或所使用的离心力或磁场力的影响下穿过一 种介质(典型地具有一种选定的密度)的移动。颗粒(例如，金属颗粒)对于增加这些颗粒所连接的细胞的密度是有效的。这些 细胞以及所连接的颗粒与单独这些细胞相比具有一种结合的更大的密度，例如通过这些细 胞以及所结合颗粒在一种重力或所施用的离心力的影响下穿过一种给定密度的介质的更 高的迁移速率作为证据。磁性颗粒(包括铁磁性和顺磁性颗粒)对于增加这些颗粒所连接的细胞的磁化率 是有效的，条件是这些细胞以及所连接的颗粒与单独这些细胞相比具有一种更高的结合的
12磁化率，例如通过这些细胞以及所连接的颗粒在一种所施用的磁场力的影响下穿过一种给 定密度和/或粘度的介质的更高的迁移速率作为证据。“磁化率”是被置于一个均勻磁场中的身体的磁化强度的一种量度。“微通道”或“微量通道或柱”是指一种通道或柱，它所具有的尺度在微尺度范围 内，典型地在10至500之间，例如宽度和深度为50至100微米。II.测定装置和套件图1示出了根据本发明的一个实施方案所构建的细胞测定套件20。该装置包括一 个衬底或背板22，该装置的其他元件安装或结合其上。例如，以下说明的某些储蓄槽和通 道元件可以作为微流体元件结合到该衬底上，该微流体元件根据熟知的方法在两个衬底板 之间形成，例如其中该储蓄槽和通道元件在下层板24中形成作为凹槽，该下层板用一个上 层盖板26覆盖。在一个优选的实施方案中，该装置的室和连接性微通道是由一种光滑表面 的材料(像玻璃或硬聚合物材料)构建的，并且该室和通道表面用一种涂层涂覆从而将细 胞与这些通道壁的非特异性连接最小化。例如，这些通道壁可以用如在美国专利5567440、 6884628和5462990中所说明的聚乙二醇化的多离子性共聚物进行涂覆。可以采用本领域 内已知的其他涂层来降低或防止细胞与这些通道壁的非特异性或不希望的粘附，这些涂层 例如基于以下各项的涂层特异性硅烷、烷硫醇自组装的单层、PEG共聚物、表面活性剂以 及无机层或被动吸附蛋白(例如，BSA或血清)。如在这些图中所见，该装置包括一个取样头28，它被设计为吸取一种细胞样品，例 如通过毛细管作用、通过将该头浸入该样品中。该取样头可以是一种指尖刺血针或其他毛 细管结构用于抽取一个固定体积的样品。该取样头是通过一个微通道管32而与一个样品 室30相连接的。该样品室可以用给定体积的颗粒悬浮液进行预先装满，这些颗粒(i)能够 特异性与有待检测的给定类型的细胞相连接(ii)当连接到这些细胞上时，实质上增加了 这些细胞的密度或磁化率，例如将一种实质上更高的密度或磁化率给予这些颗粒所结合的 细胞。适合于在本发明中使用的颗粒将参照图2在以下进行说明。图1中所示的装置以及 在具有该样品的样品室种所含有的或加入到其中的颗粒在此也一起被称为一种测定套件。在该装置中一个溢流的储液槽34通过一个微通道管36与样品室30连接，并且发 挥作用以便当一个给定体积的样品加入到该装置时接受溢流的液体。该样品室沿着它的下 端与一个界面室38相通。正如所见，图1中室38是仅从一侧以向下的方向成锥形；图2中 一个等效功能的界面室38’是从该样品室的两侧对称地成锥形；并且在图6中，一个界面区 对应地形成为分离室38”、39”。图1中室38 (或图2中室38，或图6中室39”)的下端与一个长形的收集室40流 体相通。在图1、2、以及6中所示的通用的实施方案中，该收集室是一个长形的微通道，该微 通道沿着该柱的长度具有多个限定长度的片段，例如通过一对标记物、或标记(例如，沿着 该柱的长度所展示的标记物44)所定义的片段42。如图2中所见，通过这些展示的标记所 表示的这些柱片段或区域用来确定该样品的细胞数目、或细胞计数，正如通过已经迁移入 该柱的细胞的塞子的顶部的高度所测定。因此，沿着该柱的长度所展示的标记提供了这些 测定结果的读数。尽管在此没有示出，该装置可以装配有一个透镜元件，该元件被放置在该 收集室的前面用于增强在该细胞区中细胞的检测。还考虑了根据已知的方法通过分光镜监 测或电子监测来检测该收集室中细胞的水平，尽管所展示的实施方案的一个优点是该测定读数可以通过对该收集室中细胞的分布进行简单地目测来测定。正如从以下说明的测定操作中应当理解，在该收集室中所收集的细胞的总体积将 反映具有结合的颗粒以及游离颗粒的细胞的组合体积。在更大的颗粒的情况下，例如在0. 5 至5微米尺寸范围内，这些颗粒可以在该收集室中为细胞的总体积作出一种可测量的贡 献。在这种情况下，这些颗粒的体积贡献可以通过在这些储水槽片段中提供一个“零”片段 而被补偿，该“零”片段对应于单独加入的颗粒的体积。在这种配置下，具有结合颗粒的细 胞加上任何的游离颗粒的总体积将被假定为等于游离颗粒的总体积加上未结合颗粒的天 然细胞的总体积。其中这些颗粒是相当小的，例如对于小的磁颗粒，这些颗粒的体积贡献可 以是忽略不计的，在这种情况下可能不存在针对颗粒体积的作用来调节这些储水槽体积的 需要。然而，甚至在相对小颗粒的情况下，如果将大量过量的颗粒加入到这些细胞中，例如 以便确保在含有高浓度的分析物细胞的样品中的完全反应，这些颗粒可以为这种已测量的 堆叠或消除体积作出相当可观的贡献，需要调节储水槽体积以补偿颗粒体积。可以容易地 确定该颗粒体积的作用，例如通过对有待穿过该收集室加入到该样品中该量值的颗粒进行 离心，并且测量单独这些颗粒的体积贡献。完成在图1中所示的说明，将一个填充口 46通过一个微通道48与柱40的下端连 接，允许该柱和界面区在制造时或恰好在测定之前被一种适当密度的介质填满。在一个通 用的实施方案中，其中细胞在重力或所施用的离心力之下迁移穿过该介质，该介质具有一 种特异性的密度，该密度低于在该样品室中形成的连接颗粒的细胞的密度，并且优选地等 于或大于未连接这些颗粒的样品细胞的密度。图2和3展示了以该装置的操作为基础的细胞反应和迁移的事件。在图2中，样品 室30用一种给定的预先存在的反应颗粒或珠粒的悬浮液进行填充，并且接受一个限定体 积的样品来填充该室，或者接受一个定义组合体积的预先混合的样品并且与一个给定体积 的颗粒悬浮液进行预反应。当这些细胞在一种重力或所施用的离心力之下被允许迁移进入 并且穿过该收集室时，加入这些样品细胞的颗粒是相对高密度的，典型地大于约5gm/CC，并 且是通过金属、陶瓷材料、高密度玻璃、以及类似物来形成的。这些颗粒例如通过共价连接、 用一种结合剂进行涂覆，该结合剂在该检测中能够特异性高亲和性与一种细胞表面抗原相 结合，该抗原对于所感兴趣的细胞是独特的。因此，例如在针对CD4+细胞的测定中，这些颗 粒可以用对CD+抗原特异性的抗体(例如，单克隆抗体)进行涂覆。多种细胞抗原特异性抗体是可商购的、或者是通过已知的单克隆抗体方法容易获 得的。一种示例性的颗粒是一种1微米的金微颗粒，该金微颗粒具有经由这些颗粒表面上 的胺或羧基化学基团所连接的单克隆抗体，并且具有一种密度，该密度接近金的密度，约 19.3克/(^。其他颗粒包括其它金属、氧化物或聚合物(的微米尺寸或胶体的颗粒例如， 铁、银、玻璃、硅或PTFE的微米颗粒或纳米颗粒)，连同银或金的SERS (表面增强的拉曼光谱 学)颗粒、聚合物涂覆的金属颗粒、以及量子点。这些颗粒还可以对于用一种可检出的报告 基因标记这些细胞是优选地有效的。该报告基因可以是该颗粒其本身，例如以浓缩形式可 以容易地看到的金颗粒，或可以是一种加入的标签，例如，一种荧光标记，它直接与这些颗 粒连接或连接到涂覆这些颗粒的结合剂上。适用于在生物学应用中使用的、并且具有适合 于加入细胞特异性结合剂的表面化学基团的磁性或顺磁的颗粒是熟知的，并且容易例如从 invitrogen(Carlsbad, CA)获得0
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这些颗粒可以受到额外地表面处理或涂覆以降低这些颗粒在悬浮状态下自身聚 集的趋势。在一个示例性的方法中，这些颗粒用一种亲水性聚合物涂覆，优选在一种水性 介质中高度溶剂化的一种聚合物，例如聚乙二醇聚合物链。用于制备具有表面反应性基团 (例如，醇、酸、或胺基基团)的颗粒、将聚合物链连接到此类基团上的方法是已知的。在图2中，非分析物细胞(例如细胞50)是用空心方块表示的，分析物细胞(例如 细胞52)是用空心圆圈表示的，细胞结合的颗粒(例如颗粒54)是用实心圆圈表示的，并且 结合颗粒的细胞(例如细胞56)是用加深的空心圆圈表示的。最初，该样品和颗粒可以在 一个单独的试管中预混合并且反应，然后一起加入该样品室中，允许这些反应的细胞从该 样品室穿过该沉淀区沉淀到该收集室中。可替代地，可以将该样品直接加入到该样品室用 于与该样品室中的颗粒进行反应，在这种情况下，该装置可以被放置于一个水平位置以防 止在该细胞结合反应完成之前颗粒和细胞免于沉淀到该收集室中。在一个适当的反应时间(例如10分钟)之后，该装置被放置在一个适当的支持 器上用于促进这些具有结合颗粒的细胞的迁移以便迁移进入该收集室，如图10A-10C中所 展示。当颗粒迁移穿过该收集区是在重力之下提供沉淀时，该支持器仅发挥作用来将该收 集室放于一个直立的、并且优选地垂直地直立位置，如图IOA中所示，其中检测装置140 (具 有一个收集室140)被放置在一个桌面支持器144中，该支持器144被适配为在一种基本上 垂直、直立的位置中支持该装置。当颗粒迁移是通过离心时，该支持器可以仅是一个管支持 器，该管支持器被适配为放置在一台离心机的头部，例如一台典型的台式离心管支持器，如 图IOB中所示。在此，检测装置146 (具有一个收集室148)是(例如)通过在该装置的相 对侧接受套接口、通过一个U形叉152的可伸展臂151而接合的，该U形叉是用于围绕着一 台离心机的轴150进行旋转，用于围绕该轴心线旋转。例如，该离心机可以是一台廉价的手 动驱动的台式离心机。因此，该离心机和所连接的叉子在本实施方案中充当该装置的支持 器。当颗粒迁移是通过一种磁场的施用时，该支持器可以仅仅是一个台架，该台架在其底座 上具有一个永磁体或电磁体，如图IOC中所示，它展示了一个测定装置154，该测定装置具 有直立地安装在一个台架158的一个收集室156。在该台架的底端的一个永磁体160用于 将磁珠结合的细胞牵引进入并且穿过该收集室。在每种方式中，该测定促进了结合颗粒的 细胞(以及游离的颗粒)迁移进入并且穿过该界面区(室38’)并且进入柱40中，其中这 些细胞积累到一种最终深度，该深度与在加入的样品中结合颗粒的细胞数目成正比。对沿 着该柱所显示的标记进行校准以表示该细胞数目，优选地表示一种细胞浓度、对应于一个 给定的样品体积。根据本发明，在每个实施方案中所示的支持器可以形成一种测定套件的 一部分，该套件还包括该测定装置以及与该细胞样品进行反应的细胞特异性颗粒。在本发明的另一个实施方案中，如图9A和9B中所展示，该细胞样品含有具有一个 给定细胞表面标志物的分析物细胞以及具有分析物细胞标志物连同一种第二细胞特异性 标志物这两者的不需要的细胞。为了说明的目的，将说明对于一种血液样品中CD4+T细胞 的细胞测定。该样品中的细胞含有CD4+T细胞以及具有表面CD4抗原的不需要的单核细 胞，同时这些单核细胞额外地含有⑶14表面抗原。该细胞样品与涂覆着对抗这两种抗原之 一的抗体的重颗粒进行反应，与涂覆着对抗这两种细胞表面抗原之外的抗原的抗体的磁珠 进行反应。该检测装置(显示为130)包括一个或多个样品接受和界面区136、一个收集室 136、以及一个捕获室134，用于收集不需要的单核细胞。
在图9A中所展示的测定中，该细胞样品与重颗粒(例如，金颗粒)的混合物进行 反应，这些颗粒与⑶4抗原进行免疫反应，并且因此将与⑶4+T细胞和⑶4+单核细胞相结 合，并且与磁珠进行反应，这些磁珠与⑶14进行免疫反应，并且因此将与这些⑶4/⑶14单 核细胞进行反应。一个适当的反应时间后，这些结合颗粒的细胞被允许在重力之下在该装 置中沉淀。当这些细胞沉淀时，在该捕获室附近所施用的一个磁体138牵引不需要的单核 细胞进入该捕获室，释放这些CD4+T细胞沉淀进入不需要的单核细胞的收集室中。在图9B中说明的测定中，这两种颗粒的作用是相反的，其中这些重颗粒是对抗 CD14进行免疫反应的，而这些磁珠是对抗CD14抗原进行免疫反应的。在这些细胞与这两种 颗粒类型反应之后，该检测装置如所示是成角度的，允许用这些重颗粒标记的单核细胞沉 淀进入捕获室134，将这些细胞从这些CD4+T细胞中去除，它们被该室下端的磁体138牵引 进入该收集室。图3A-3C展示了在像以上说明的、但根据本发明的一种第二通用的实施方案所构 建的一个细胞沉淀测定装置中的收集室构型。在所有这些装置中，该收集室包括一个长形 的收集管；以及在该收集管中形成这些收集区的、沿着该管所安置的多个空腔。这些空腔被 安排在该管中，这样使得以上游至下游的方向迁移穿过该管的细胞在最上游的空腔中被捕 获直到填满，在此之后以从上游至下游的方向依次地填满这些空腔。图3A显示了一种测定装置60，它具有与一个收集管或室64相连的一个界面区 62。该收集管具有多个相对成角度的流动片段，例如片段66、68。该管中的多个收集区是 多个有边缘的空腔，这些空腔被安置在邻近的流动片段之间，例如在邻近的流动片段66、68 之间的空腔70。图3B中所示的收集室是与图3A的相类似的。在此，在一种测定装置74中一个收 集管72是由相对成角度的流动片段(例如片段76、78)、以及在邻近的流动元件之间的一系 列空腔(例如，在流动片段76，78之间的空腔80)形成的。该构型的一部分示于图4中，并 且展示了迁移穿过该收集管的细胞是如何以上游至下游的方向在这些空腔中被依次地捕 获，允许通过识别这种含有连接颗粒的细胞的最下游空腔容易地测定细胞计数。如在图4 中所见，结合颗粒的细胞(例如，细胞79)，以上游至下游的方向(在该图中从上到下)、沿 着由箭头75所表示的力的一条线、从一个流动片段迁移到另一个流动片段，在最上游空腔 80中被捕获直到该室被填满，在这个时候细胞将开始填充下一个最下游的空腔，以此类推， 直到所有的细胞已经被捕获。在该收集管中捕获的细胞的数目可以通过测定含有细胞的最 下游空腔进行半定量地确定。在一个实际的测定装置中，将这些收集区校准，这样使得每个 依次的收集区代表某一个总数的感兴趣的样品细胞，例如约200个细胞/每空腔，这样使得 从顶部第η个空腔中细胞的存在表示一个细胞计数，该计数在约例如(η-1)χ200至ηΧ200 个细胞之间。如以上所说明，可以对空腔大小和细胞数目之间的关系进行调整以便对填充 这些储水槽的颗粒体积(结合的颗粒以及游离颗粒)进行校正。在图3C中，在一个装置84中一个收集管82是与在一种重力或所施用的离心力或 磁场力下在该管中结合颗粒的细胞的流动方向成角度的，由箭头86表示。该收集管中的收 集区包括多个空腔(例如，空腔88)，它们沿着该管的一个外表面部分90被安置，这样使得 以上游至下游的方向、并且在由箭头86所表示的力的方向上迁移穿过该收集管的细胞首 先在最上游的空腔被捕获，并接着当每个空腔充满时在更多的下游空腔中被依次地捕获。
16如在图3A和3B中所展示的实施方案，该装置允许通过识别含有结合颗粒细胞的最下游空 腔容易地测定细胞计数。在所有三种装置中还显示了与该收集管的下端相通的一个预填充的通道92，提供 了 一个端口，通过该端口可以对该收集管和界面区进行填充。图5展示了在像以上说明的、但根据本发明的一个第三通用的实施方案所构建的 一个细胞沉淀测定装置94中的收集室构型。在这个装置中，该收集室(表示为96)包括一 个流动管98，该流动管在其上游端与一个沉淀区97相连、并且在一种重力下相对于结合颗 粒的细胞的流动方向基本上横向地延伸。换言之，流动穿过管的方向(由箭头100表示) 是基本上垂直于施用到这些细胞的力的方向的，例如在重力之下，由箭头102所表示。该室 包括多个空腔104，这些空腔沿着管98的底面间隔排列。在操作中，结合颗粒的细胞(例 如，表示为106)以一定的流速流动穿过该室，这样使得这些颗粒首先基本上专一性地迁移 进入最上游的空腔(表示为108)，并且当该空腔被填满时，继续在空腔108中收集的颗粒将 被该流体流携带从而沉淀进入下一个下游空腔，并且同样地进入每一个邻近的空腔，直到 所有细胞已经在一个空腔中被捕获。对于该通用的实施方案中使用其他装置，结合颗粒的 细胞的细胞计数是可以从含有细胞的最上游空腔进行确定的。III.测定方法本发明的方法使用以上细胞检测装置用于对细胞样品检测存在至少一个阈值浓 度的给定类型细胞。为了说明的目的，该方法将针对一种方法进行说明，该方法用于确定在 一个感染HIV的、正在对感染状况进行监测的个体中存在的CD4+T细胞的阈值浓度(细胞 计数)。大体上，⑶4+细胞计数在500-1500个⑶4+T细胞/ μ 1血液之间表明在该个体中T 细胞免疫正常发挥作用，其中细胞迁移是在重力下通过沉淀穿过一种定义了密度的介质而 产生的。当HIV杀死⑶4+Τ细胞时，这样使得存在着小于200个⑶4+Τ细胞/ μ 1血液，细胞 免疫丧失，导致一种可能的AIDS诊断。在此所展示的测定方法被设计为检测CD4+T细胞小 于250/μ 1血液的阈值水平，这意味着在这个阈值建议进行治疗。可以将该阈值调节(例 如取决于该个体的年龄)到比如说350、450、550、或750个/ μ 1血液。在该测定中所采用的测定装置在图6中示出。该装置(表示为110)包括与图1 和2所说明的相类似的装置、一个样品室30(处于液体相通、以上游至下游的方向)、一个沉 淀室38”、以及集中室39” (合起来，一个界面室)、以及一个收集管40，其中该收集管中收 集区是由通过沿着该管的长度的标记44表示的。假设该装置已经用一种选定密度的介质 预填满，填满该界面室和收集室。该样品室可以含有一个选定体积的可检出颗粒的悬浮液， 这些颗粒能够与CD4+细胞的CD4+抗原进行特异性反应，或可替代地，这些颗粒可以被分开 提供用于在加入到该样品室之前与该样品混合。作为该测定的一个第一个步骤，从该患者采集血液流体样本。在将该样品施用到 该装置之前，该样品中的RBC可以部分地或全部地通过以下方式去除例如裂解、抗体沉 淀、离心以便特异性地去除RBC、或离心从而将所有血细胞团聚之后跟随白细胞部分的再悬 浮，这是根据实验室血液学熟知的方法进行的。在任何情况下，将最终的白细胞样品的体积 进行调节以便对应于该初始血液样品的已知体积。将含有白细胞的样品以一个给定的体积施用到该装置中的样品室，并且允许这些 细胞与这些细胞结合的颗粒反应足以完成该反应的一段时间，例如10分钟。可替代地，该反应是在一个单独的试管中进行的，然后一起加入到该样品室中。在如图6中所示的装置 中，⑶4+结合颗粒被表示为小实心圆圈112，⑶4+阳性细胞由阴影圆圈114表示，⑶4+阴 性细胞被表示为空心圆圈116，并且结合颗粒的CD4+细胞被表示为具有深色的颗粒外层的 阴影圆圈，代表结合的颗粒。如以上所表示，这些结合颗粒的细胞具有实质上增加的密度， 并且优选地易于通过肉眼检出。目前，该样品中的细胞被允许在重力之下沉淀穿过一种沉淀介质(该介质具有一 种密度，该密度小于这些结合颗粒细胞的密度)进入具有多个收集区的一个收集室，例如 通过将该装置放在一个直立的位置上或以慢速离心，直到基本上所有这些结合颗粒的细胞 已经沉积到该收集管中。图6示出了当一些结合颗粒的细胞已经沉积到该收集管中时完成 之前的沉淀过程。一旦沉淀结束，对该装置检查(优选地通过目检)在至少一个选定的收集区中存 在结合颗粒的细胞。在所展示的装置中，这些收集区代表该管增加的片段，对应于沿着该管 侧面的标记44，粗略地对应于每个标记增加100个细胞/ μ 1。作为本方法的最后一步，基于已填满的或部分填满的收集区的数目来测定所加入 的样品体积是否包含正在测定的细胞类型的细胞的选定阈值数目。在本展示中，可以看到 在该测定中在结束时细胞计数将是大于500个细胞/ul，这表示所测试的个体具有正常发 挥作用的免疫系统。图7C-7C展示了一种示例性测定方法的结果，正如示意图(7A)、通过照片(7B)、并 且通过荧光读数(7C)所见。该荧光读数是使用两个不同样品的PBMC(外周血单核细胞) 进行荧光标记而获得的，一个含有所施用的7. 6x IO5个细胞(左道，在图7C中)以及所施 用的7. BxlO4个细胞(右道，在图7C中)。如在该图中所见，在该测定的收集管中具有更大 细胞体积的样品产生了大于超过2倍的塞子高度。图8示出了一种细胞测定的结果，其中仅含有珠粒的样品的柱高(左道)、珠粒加 上IxlO5个⑶4+细胞(中道)、以及珠粒加上5x10s个⑶4+细胞。这些沉淀珠粒单独产生 一个柱高，在该图中表示为120。加入IxlO5个细胞小量地增加了高度，表示为122 ；并且加 入5x10s个细胞一定量地增加了高度，表示为124，这是较小的细胞计数样品的大概5倍，正 如所预期。其他用于监测白细胞作为一种健康或治疗状况的指示物的应用包括但不限于检测或监测可能来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度，该个体可能患有一种 导致血液中白细胞升高的感染或其他病症。在该应用中，这些细胞与具有表面结合的抗白 细胞结合剂(例如CD45)的颗粒进行反应，并且对应于所感兴趣的一个或多个阈值收集区 的这种标记或这些标记表示白细胞大于约10，000个细胞/μ 1血液的浓度。检测或监测来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度，该个体由于化疗、放疗或 白细胞在血液中具有降低的白细胞数目。在该应用中，这些细胞与具有表面结合的抗白细 胞结合剂(例如CD45)的颗粒进行反应，并且对应于所感兴趣的一个或多个阈值收集区的 这种标记或这些标记表示白细胞小于约4，000个细胞/ μ 1血液的浓度。检测或监测来自一个个体的血液样品中嗜中性细胞的浓度，该个体由于化疗或干 扰素治疗在血液中具有降低的嗜中性细胞数目。在该应用中，这些细胞与具有表面结合的 抗嗜中性细胞结合剂(例如CD16)的颗粒进行反应，并且对应于所感兴趣的一个或多个
18阈值收集区的这种标记或这些标记表示嗜中性细胞的浓度，该浓度在一个选定的500至 2，500个细胞/μ 1血液之间的范围内。检测或监测来自一个感染的个体的体液样品中细菌细胞的浓度，作为感染的程度 和类型的标志物。在该应用中，这些细胞与具有一种表面结合的结合剂的颗粒进行反应，该 结合剂能够与一种或多种选定的细菌壁抗原进行特异性地结合，并且对应于所感兴趣的一 个或多个阈值收集区的这种标记或这些标记表示在该血液样品中细菌细胞的可检出的浓度。从以上所述，可以看到本发明的不同目标和特征是如何达到的。本测定和装置的 原理是基于结合颗粒的细胞在一个特异的微细管中或梯类型的细胞收集安排中的优先迁 移。以这种方式对该装置进行校准，这样使得细胞堆叠的高度或填满的收集区的数目对应 于细胞计数，特别是当对颗粒体积进行调节时。该方法不要求抗体涂覆的装置表面，并且读 出可以通过肉眼来实现，无需任何额外的染色步骤或读取器仪器。因此，本方法结合了血球 计中细胞计数的精确性以及明白的并且简单的、无需读取器的读出的便捷性。由于它的简 单性，本方法可以理想地适合于一些发展中国家种的恶劣环境条件。尽管相对于具体的实施方案和实例已经对本发明进行了说明，应当理解可以进行 不同的改变和修改，而不偏离本发明的精神。
权利要求
一种用于对细胞样品测定存在至少一个阈值浓度的给定类型细胞的方法，该方法包括(a)将含有该给定细胞类型的多个细胞的一种细胞样品与多个颗粒进行反应，这些颗粒能够特异性连接到这些细胞上并且当与这些细胞相连接时对于增加这些细胞的密度或磁化率是有效的，从而允许在一种重力或所施用的离心力或磁场力的影响下基于它们的穿过一种选定介质的更大的迁移速率将该样品中的结合颗粒的细胞以及游离的颗粒与无颗粒结合的细胞分开。(b)使该细胞样品中的这些结合颗粒的细胞与颗粒迁移穿过一个长形的收集室，该收集室含有该选定的介质并且沿着它的长度具有多个细胞收集区，通过使该样品受到一种重力或所选定的离心力或磁场力持续一段时间，该时间足以使这些结合颗粒的细胞以及颗粒完全填满该收集室中的依次的细胞收集区，并且(c)检查该室以便确定该至少一个选定的收集区是否部分地或完全被填满，作为该细胞样品含有至少一个阈值浓度的给定细胞类型的细胞的证据。
2.如权利要求1所述的方法，其中该收集室包括一个收集柱，该柱中的收集区包括沿 着该柱的一部分的多个限定长度的片段，并且这些收集区在步骤(b)中沿该收集室的柱长 度以下游至上游的方向上被依次地填满。
3.如权利要求1所述的方法，其中该收集室包括一个长形的收集管；以及在该收集管 中形成这些收集区的、在该管中所安排的多个空腔，这样使得在步骤(b)中以上游至下游 的方向迁移穿过该管的细胞在最上游的空腔中被捕获直到填满，在这之后以上游到下游的 方向依次地填满这些空腔。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒当步骤(a)中与这些细胞相连接时对于用 一种可检出的报告基因对这些细胞进行标记是有效的，并且所述检查包括对该收集室肉眼 检查存在用该可检出的报告基因标记的细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括通过将该室置于一个基本上直立的垂 直布置的位置上，使这些结合颗粒的细胞受到重力，该选定密度的介质具有一种密度，该密 度小于这些结合颗粒细胞的密度，并且这些颗粒是基本上球形的金属颗粒。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括使这些结合颗粒的细胞受到离心力，该 选定密度的介质具有一种密度，该密度小于这些结合颗粒的细胞的密度，并且这些颗粒是 基本上球形的金属颗粒。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括使这些结合颗粒的细胞受到磁场力，并 且这些颗粒是基本上球形的磁性颗粒或顺磁颗粒。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括以一个方向将一种流动组分施用到该 收集室内的介质中，该方向基本上垂直于重力或所施用的离心力或磁场力的方向。
9.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)进一步包括将该含有结合颗粒的细胞的样 品加入到该收集室的一种界面区上游，并且将该样品与在该界面区中的一种选定密度的介 质进行物理混合。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是一种血液样品，并且所述颗粒具有能够 与一种血细胞特异性抗原进行免疫反应的表面结合的结合蛋白，并且这些颗粒被表面处理 以便降低血液样品中的颗粒聚集。
11.如权利要求10所述的方法，用于对来自一个可能感染HIV的个体的血液样品中 CD4+T-淋巴细胞的浓度进行检测，作为该个体的T细胞种类的一种指示物，其中反应步骤 (a)是通过将来自该个体的一种血液流体样本暴露于具有表面结合的抗-CD4+结合剂的颗 粒来进行的，并且步骤(c)是基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表具有 一个在200至750/ μ 1血液的选定阈值的⑶4+Τ-淋巴细胞的浓度。
12.如权利要求10所述的方法，其中步骤(a)进一步包括将该样本中的细胞与能够特 异性地结合到单核细胞上的CD14抗原的颗粒进行反应、同时或之后随后与能够特异性地 结合到T淋巴细胞上的Cd4抗原的第二批颗粒进行反应，由此在这些T淋巴细胞上给予增 强的密度或磁化率，并且在这些单核细胞上给予增强的密度和磁化率，并且步骤(b)进一 步包括首先将结合颗粒的单核细胞从该细胞样品中去除，这是通过施用一种力来进行的， 该力对于将这些结合颗粒的单核细胞从结合颗粒的T淋巴细胞中选择性地去除是有效的。
13.如权利要求10所述的方法，用于对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行 检测，该个体可能患有一种导致血液中白细胞升高的传染病或其他病症，其中反应步骤(a) 是通过将该个体的一种血液流体样品暴露于具有表面结合的抗_白细胞结合剂的颗粒来 进行的，并且步骤(c)是基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表白细胞大 于约10，000个细胞/ μ 1血液的浓度。
14.如权利要求10所述的方法，用于对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行 监测，该个体由于化疗、放疗或白血病可能在该血液中具有降低的白细胞数目，其中反应步 骤(a)是通过将来自该个体的一种血液流体样品暴露于具有表面结合的抗-白细胞结合剂 的颗粒来进行的，并且步骤(c)是基于观察到的在一个收集区中存在的细胞，该存在代表 白细胞小于约4，000个细胞/ μ 1血液的浓度。
15.如权利要求10所述的方法，用于对来自一个个体的血液样品中嗜中性细胞的浓度 进行监测，该个体由于化疗或干扰素治疗可能在该血液中具有降低的嗜中性细胞数目，其 中反应步骤(a)是通过将来自该个体的一种血液流体样品暴露于具有表面结合的抗-嗜 中性细胞结合剂的颗粒来进行的，并且步骤(c)是基于观察到的在一个收集区中存在的细 胞，该存在代表嗜中性细胞在一个选定的在500至2，500细胞/ μ 1血液之间的范围内的浓 度。
16.如权利要求10所述的方法，用于对来自一个感染个体的体液样本中细菌细胞的浓 度进行检测，作为感染的程度和类型的一种指示物，其中反应步骤(a)是通过将来自该个 体的一种体液样品暴露于具有一种表面接合的结合剂的颗粒来进行的，该结合剂能够特异 性地与一种或多种选定的细菌壁抗原相结合，并且步骤(c)是基于观察到的在一个收集区 中存在的细胞，该存在对应于在该血液样品中一种可检出浓度的细菌细胞。
17.一种用于对细胞样品测定在该样品中存在至少一个阈值浓度的选定细胞类型的细 胞，该套件包括(a)一种测定装置，该测定装置具有一个用于接受该细胞样品的样品室、以及与其进行 流体相通的一个长形的收集室，该收集室含有一种选定的介质并且沿着它的长度具有多个 细胞收集区，(b)一些颗粒，这些颗粒当被加入到该细胞样品中时能够特异性连接到该选定细胞类 型的细胞上，并且这些颗粒当连接到这些细胞上时对于增加这些细胞的密度或磁化率是有效的，从而允许在一种重力或选定的离心力或磁场力的影响下使该细胞样品中的结合颗粒 的细胞以及颗粒优先地迁移穿过该长形的收集室，直到基本上所有这些结合颗粒的细胞以 及颗粒完全填满该收集室中依次的细胞收集区，并且(C)与该装置收集室上的至少一个收集区相关联的标记，该标记表示该选定类型的细 胞对于至少部分地填满该收集区有效的浓度，这是当结合颗粒的细胞以及游离的颗粒被牵 引穿过该收集室时进行的。
18.如权利要求17所述的套件，其中该收集室包括一个收集柱，该柱中的这些收集区 包括沿着该柱的一部分的多个限定长度的片段，并且这些收集区被适配为沿着该收集室的 柱长度以从下游至上游的方向被按步骤依次地填满。
19.如权利要求18所述的套件，其中该收集室包括一个长形的收集管；以及在该收集 管中形成这些收集区的、在该管中沿着它的长度所安排的多个空腔，并且这些收集区被适 配为沿着该柱长度以上游至下游的方向被依次地填满。
20.如权利要求17所述的套件，其中该收集室包括一个收集管，该收集管具有多个相 对成角度的流动区段；以及在该收集管中形成这些收集区的、在邻近的流动片段之间所安 置的多个有边缘的空腔，这样使得以上游至下游的方向从一个流动区段迁移到另一个流动 区段的细胞被捕获在这两个流动片段之间的空腔中，直到该空腔被填满。
21.如权利要求17所述的套件，其中该收集室包括一个收集管，该收集管在一种重力 之下相对于在该管中的结合颗粒的细胞的流动方向成角度；以及在该收集管中形成这些收 集区的、沿着该管的一个外表面部分所安置的多个空腔，这样使得以上游至下游的方向迁 移穿过该收集管的细胞在最上游的空腔中被捕获直到被填满。
22.如权利要求17所述的套件，其中该收集室包括一个流动管，该流动管在一种重力 下相对于结合颗粒的细胞的流动方向基本上横向地延伸；以及在该收集室中形成这些收集 区的、沿着该流动管的长度所安置的多个空腔，这样使得以上游至下游的方向流动穿过该 流量管的细胞沉淀进入到该最上游的空腔中直到填满，在此之后以上游至下游的方向依次 地将这些空腔填满。
23.如权利要求17所述的套件，其中装置(a)进一步包括一个与该样品室相通的捕获 室，并且颗粒(b)包括一种第一类型的、能够与在该选择类型的细胞以及一种非选定类型 的细胞上呈递的一种抗原进行特异性结合的颗粒，以及一种第二类型的、能够仅与该非选 定类型的细胞上呈递的一个抗原进行特异性结合的颗粒，允许在该选定类型的细胞迁移之 前将结合到第二种类型的颗粒上的颗粒通过迁移到该捕获室中而被选择性地去除，这些细 胞仅结合到该第一类型的颗粒上以便选择性地迁移到该收集室中。
24.如权利要求17所述的套件，其中所述结合颗粒的细胞被适配为在一种重力或离心 力的影响下迁移穿过该收集区，其中所述颗粒是基本上球形的金属颗粒。
25.如权利要求17所述的套件，其中用于对血液样品中的给定类型的细胞进行检测， 并且所述颗粒具有能够与一种血细胞特异性的抗原进行免疫反应的表面结合的结合蛋白。
26.如权利要求25所述的套件，其中这些颗粒受到表面处理以便降低血液样品中的颗 粒聚集。
27.如权利要求26所述的套件，其中用亲水聚合物涂层对所述颗粒进行涂覆。
28.如权利要求17所述的套件，其中所述结合颗粒的细胞被适配为在一种磁场力的影响下迁移穿过该收集区，其中所述颗粒是基本上球形的磁性颗粒或顺磁颗粒。
29.如权利要求17所述的套件，用于对来自一个可能感染HIV的个体的血液样品中 CD4+T-淋巴细胞的浓度进行检测，作为该个体的T细胞种类的一种指示物，其中所述颗粒 具有表面结合的抗CD4+结合剂，并且所述标记被设计为表示CD4+T淋巴细胞的浓度，这些 细胞具有一个选定的在200至750/μ 1血液之间的阈值。
30.如权利要求17所述的套件，用于对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行 检测，该个体可能患有一种导致该血液中白细胞升高的传染病或其他病症，其中所述颗粒 具有表面结合的抗白细胞结合剂，并且所述标记被设计为表示白细胞大于约10，000个细 胞/μ 1血液的浓度。
31.如权利要求17所述的套件，用于对来自一个个体的血液样品中白细胞的浓度进行 监测，该个体由于化疗、放疗或白血病可能在该血液中具有降低的白细胞数目，其中所述颗 粒具有表面结合的抗白细胞结合剂，并且所述标记被设计为表示白细胞小于约4，000个细 胞/μ 1血液的浓度。
32.如权利要求17所述的套件，用于对来自一个个体的血液样品中嗜中性细胞的浓度 进行监测，该个体由于化疗或干扰素治疗可能在该血液中具有降低的嗜中性细胞数目，其 中所述颗粒具有表面结合的抗嗜中性细胞结合剂，并且所述标记被设计为表示嗜中性细胞 在一个选定的500至2，500个细胞/ μ 1血液的范围内的浓度。
33.如权利要求17所述的套件，用于对来自一个感染个体的血液或尿液样品中一种细 菌感染的存在进行检测，其中所述颗粒具有能够与一种细菌壁抗原进行特异性结合的表面 结合结合剂，并且所述收集区被设计为表示在血液或尿液样品中细胞的存在。
34.如权利要求17所述的套件，该套件进一步包括一种装置支持器，该支持器用于支 持该装置并且对所支持的装置施用一种离心力或磁场力。
全文摘要
在此披露了一种用于对细胞样本测定存在至少一个阈值数目的给定类型细胞的方法和套件。该套件包括一种测定装置，该测定装置具有一个用于接受该细胞样品的样品室、以及一个长形的收集室，该收集室含有一种选定密度和/或粘度的介质并且沿着它的长度具有多个细胞收集区，以及多个颗粒，这些颗粒能够与该选定细胞类型的细胞进行特异性连接，并且这些颗粒当与这些细胞连接时对增加这些细胞的密度或磁化率是有效的。在实施中，该细胞样品中结合颗粒的细胞以及颗粒在一种重力或所选定的离心力或磁场力的影响下被牵引穿过该长形的收集室，直到这些结合颗粒的细胞以及颗粒完全填满该收集室中的多个依次的细胞收集区。与至少一个收集区相关联的标记表示了该选定类型的细胞对于至少部分地填满该收集区是有效的。
文档编号G01N33/543GK101939645SQ200880126275
公开日2011年1月5日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者劳伦斯·鲁伊斯-泰勒, 勒妮·托比亚斯, 弗兰克·佐格, 彼得·凯尔宁, 彼得·瓦格纳, 西尔维亚·麦克马努斯·穆尼奥斯 申请人:齐翁米克斯股份有限公司