专利名称：：一株高产竹红菌素的竹黄无性型菌株及其筛选方法
技术领域：
：本发明涉及微生物，具体而言，涉及竹红菌素，还涉及其筛选方法。
背景技术：
：竹红菌素是一类茈醌类光敏色素物质，其具有抗炎、镇痛、抗菌、光敏杀伤肿瘤细胞、减轻毒副作用以及抑制肉芽组织增生等作用。此外，在食品添加剂和新型生物农药上，竹红菌素具有广阔的应用前景。目前，在自然界中只发现了Hypcrellabambusae(Berk,etBr.)Sacc.，Hypomyces(Fr.)Tul.sp.，Shiraia(Henn.)sp.，这几个产竹红菌素的真菌，资源有限。目前，检测竹红菌素产量的传统方法是采用有机溶剂提取紫外分光光度仪下进行的，因为色素的产量不一定就是竹红菌素的含量，所以筛选存在一定的不准确性。经过检索，尚无竹红菌素筛选技术的专利申请，也没有相关的报道。
发明内容本发明的目的是提供一株高产竹红菌素的竹黄无性型菌株，使其可用于竹红菌素的制备及微生物发酵工程；本发明的又一目的是提供一种简单、准确的筛选高产竹红菌素的方法。发明人通过反复的探索试验认识到，为摆脱传统上单纯依靠有机溶剂提取紫外分光光度仪下检测的方法，需要开拓既定性又定量、简单又容易操作、对设备要求不高的新方法，以便于对高产竹红菌素的菌种进行筛选。通过此方法，发明人对竹黄(ShiraiabambusicolaP.He皿.)的无性型菌株经行了筛选，并且获得了一株高产竹红菌素的菌株。本发明提供的高产竹红菌素的菌株是竹黄的无性型菌株，该菌株是从采自浙江省桐庐县的竹黄子实体上分离获得；该菌株为竹黄GZUIFR-08K1，保藏中心的菌株保藏编号CCTCCNO:M209141，拉丁文名称为ShiraiabambusicolaGZUIFR-08K1，2009年7月7日在中国典型培养物保藏中心保藏，其地址为中国.武汉.武汉大学。上述竹黄的无性型菌株在查氏培养基上，26t:培养4d后，菌落直径超过2.5cm，10d后菌落直径达67cm，菌丝有隔，有分枝，透明，宽度38iim;菌落表面初期呈棉絮或疏松绒毛状，有同心轮带，白色后呈淡褐色，基质菌丝密致呈黑色；培养10d后，未见产孢结构。本发明提供的筛选方法是将滤纸片浸于竹红菌素的乙醇萃取液中lh后，置于暗处适度挥干溶剂后，将6个纸片叠起铺在涂布有100i!L金黄色葡萄球菌的普通肉汤培养基(0.5cm厚)上，光照60min后，在此条件下，竹红菌素的抗菌活性最高。上述竹红菌素的筛选方法包括(1)供试菌的选择；(2)竹红菌素激发条件的选取；(3)供试菌培养条件的确定；(4)筛选方法的具体过程；(5)性能检测。本发明的竹黄无性型菌株的应用方法是将竹黄无性型菌株接种于PDA液体培养基上，26t:下恒温培养14d，收集菌丝体，烘干，用乙醇提取得到竹红菌素；再应用上述的筛选方法，根据抑菌圈的大小来判断不同菌株所产竹红菌素含量的高低；此筛选方法可以为需要竹红菌素的相关发酵工业、生物医药、食品添加剂和新型生物农药等选育菌种。发明人指出为发挥真菌资源的综合效益，探索一种筛选高产竹红菌素的方法及其应用是一项有意义的研究工作。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果与传统方法相比，既能定性又可以定量，简单又容易操作，是一种对设备要求不高的新方法，便于对高产竹红菌素的菌种进行筛选。图1为竹红菌素的光敏活性抑制细菌的效果图，图2为光照时间对抑菌效果的影响，图3为供试细菌培养时间对抑菌效果的影响。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。实施例1研究光照时间和供试细菌培养时间对竹红菌素光敏抑菌活性的影响1.实验材料与方法1.l材料来源革兰阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草杆菌(Bacillussubtilis)，均为贵州大学真菌资源研究所保藏。普通肉汤液体培养基牛肉250g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加蛋白胨10g，葡萄糖lg，水补足1000mL，pH7.4。灭菌条件12rC，25min。普通肉汤固体培养基牛肉250g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加蛋白胨10g，葡萄糖lg，琼脂20g，水补足1000mL，pH7.4。灭菌条件121°C，25min。竹红菌素的乙醇溶液取0.lg的竹黄子实体浸于25ml的乙醇溶液中。1.2纸片的制备将灭过菌的滤纸片(8mm)浸于竹红菌素的乙醇溶液中片刻，置于暗处适度挥干溶剂后暗中保存，备用。1.3竹红菌素光敏活性的测量按无菌操作规程，分别吸取供试菌悬液各100i!L，添加到不同平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸有竹红菌素的滤纸片，平贴在含菌培养基上。再用680Lx的光照强度对其照射不同的时间，照光处理组在34t:的培养箱中培养24h后，以抑菌圈的产生与否及大小来表示光敏活性的有无及其高低(如图1所示)。抑菌圈与纸片半径的差值越大表示竹红菌素活性越好。抑菌效果为抑菌圈半径与纸片半径的差值。1.4实验方法1.4.1确定光照时间在普通肉汤固体培养基上，均匀涂布培养了24h的100iiL金黄色葡萄球菌，放入制备好的纸片，再分别光照20min、40min、60min、80min、100min、120min和140min后，将培养皿置于34t:的培养箱中培养24h。通过比较抑菌圈与纸片半径的差值的大小，选择最佳光照时间。1.4.2确定供试细菌的培养时间从供试细菌培养的第2小时开始，每隔1小时在普通肉汤固体培养基上均匀涂布100iiL金黄色葡萄球菌，放入制备好的纸片，光照60min后，将培养皿置于34t:的的培养箱中培养24h。通过比较抑菌圈与纸片半径的差值的大小，选择最佳供试细菌的培养时间。2.实验结果2.1光照时间对竹红菌素光敏抑菌活性的影响在光照下，竹红菌素光敏化合物通过光诱导电子转移，还原形成负离子自由基。竹红菌素光敏化合物诱导产生各类半醌自由基，而醌类衍生物对生物体的光敏作用可引起细胞功能的改变、酶失活以及细胞死亡等。光照时间过长，光敏活性丧失；光照时间过短，光敏活性还未受到激发。只有在适宜的光照时间下，竹红菌素光敏活性才能得到最大程度的利用。在普通肉汤固体培养基上，均匀涂布培养了24h的lOOiiL金黄色葡萄球菌，放入制备好的纸片，再分别光照20min、40min、60min、80min、100min、120min和140min后，将培养皿置于34t:的培养箱中培养24h。通过比较抑菌圈与纸片半径的差值的大小(实验结果如图2所示)，发现在光照60min后，竹红菌素光敏抑菌活性的效果最好。2.2供试细菌培养时间对竹红菌素的光敏抑菌活性的影响微生物在液体培养基中有其特有的生长曲线，各个阶段有其不同的特性。所以，供试细菌培养时间的不同，其对竹红菌素的敏感程度不同。从供试细菌培养的第2小时开始，每隔lh在普通肉汤固体培养基上均匀涂布100iiL金黄色葡萄球菌，放入制备好的纸片，再光照60min后，将培养皿置于34°C的的培养箱中培养24h。通过比较抑菌圈与纸片半径的差值的大小(实验结果如图3所示)，在金黄色葡萄球菌培养了10h，光照60min后，竹红菌素光敏抑菌活性的效果最好。实施例2竹红菌素光敏抑菌活性相关因素的优化正交实验结果1.实验材料与方法1.1材料来源革兰阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草杆菌(Bacillussubtilis)，均为贵州大学真菌资源研究所保藏。普通肉汤液体培养基牛肉250g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加蛋白胨10g，葡萄糖lg，水补足1000mL，pH7.4。灭菌条件12rC，25min。普通肉汤固体培养基牛肉250g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加蛋白胨10g，葡萄糖lg，琼脂20g，水补足1000mL，pH7.4。灭菌条件121°C，25min。竹红菌素的乙醇溶液取0.lg的竹黄子实体浸于25ml的乙醇溶液中。1.2纸片的制备将滤纸片(8mm)浸于竹红菌素的乙醇溶液中片刻，置于暗处适度挥干溶剂后暗中保存，备用。1.3竹红菌素光敏活性的测量按无菌操作规程，分别吸取供试菌悬液各100iU，添加到不同平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸有竹红菌素的滤纸片，平贴在含菌培养基上。再用680Lx的光照强度对其照射不同的时间，照光处理组在34t:的培养箱中培养24h后，以抑菌圈的产生与否及大小来表示光敏活性的有无及其高低。抑菌圈与纸片半径的差值越大表示竹红菌素活性越好。抑菌效果为抑菌圈半径与纸片半径的差值。2.实验结果根据资料，设计选择纸片数量(A)、供试细菌类型(B)、供试细菌添加量(C)、培养基厚度(D)、供试细菌的添加形式(E)五个因素各二个水平，考虑到各因素之间可能存在的交互作用，选用L7(2')正交表安排实验(表l)。表1竹红菌素光敏抗菌活性的因素和水平<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2竹红菌素光敏抗菌活性5因素2水平的交互实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3竹红菌素光敏抑菌活性5因素2水平的交互实验方差分析结果sourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel19.5873.91765.330.015Intercept24.887124.887415.035002A3.39313.39356.586.017B1.61111.61128.867.035C1.25611.25620.948.045D1.00111.00116,696.055E12.326112.326205.555.005Error.12025.996E-02Total44.5938CorrectedTotal19.7077竹红菌素光敏抑菌活性正交优化试验由结果分析可以看出，培养基厚度、供试细菌培养时间、供试细菌类型、供试细菌添加量和供试细菌添加形式均呈高度显著，显著程度由高到低依次是供试细菌添加形式>纸片数量>供试细菌类型>供试细菌添加量>培养基厚度，根据水平比较，选择最佳为金黄色葡萄球菌培养10h后，取100i！L涂布于0.5cm厚的培养基上，铺6个纸片，竹红菌素的光敏抑菌活性最高。确定竹红菌素最佳光敏抑菌活性条件为金黄色葡萄球菌在普通肉汤液体培养基上培养10h后，取100iiL涂布于0.5cm厚的普通肉汤固体培养基上，铺6个纸片，光照60min后，竹红菌素的光敏抑菌活性最高。实施例3不同竹黄无性型菌株产竹红菌素高低的筛选1实验材料与方法1.1竹黄的分离纯化野生竹黄菌采自浙江省桐庐县竹林中。采用组织和孢子分离的方法，接种于母种斜面培养基，26t:2『C培养12d，在培养基表面刚刚产生菌丝时，立即进一步转管纯化，共分离得到丝状真菌无性型纯培养60余株。1.2供试菌类本试验供试菌革兰阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaur-eus)，其为贵州大学真菌资源研究所保藏。1.3培养基PDA液体培养基马铃薯200g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加葡萄糖20g，水补足1000ml，pH自然。灭菌条件12rC，30min。PDA固体培养基马铃薯200g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000ml，pH自然。灭菌条件121°C，30min。普通肉汤液体培养基牛肉250g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加蛋白胨10g，葡萄糖lg，水补足1000mL，pH7.4。灭菌条件12rC，25min。普通肉汤固体培养基牛肉250g切块，加水约500ml，煮沸30min，过滤，加蛋白胨10g，葡萄糖lg，琼脂20g，水补足1000mL，pH7.4。灭菌条件121°C，25min。竹黄菌母种斜面和摇瓶深层发酵采用PDA培养基；供试细菌用普通肉汤培养基。1.4竹黄无性型菌株菌丝体发酵培养条件竹黄无性型菌株菌丝体采用深层发酵培养。250mL的培养容器(三角瓶)中加入50mLPDA培养液。培养条件温度28°C，摇瓶转速为120r/min。连续摇瓶7d，待发酵液中充满灰白色的密集粘滑的菌丝球时终止发酵。1.5竹黄无性型菌株发酵菌丝体萃取液的制备将发酵菌液过滤并用蒸馏水洗涤3次后，将得到的菌丝体低温烘干，称取干菌丝体1.Og后，用25mL体积的无水乙醇对其进行萃取。1.6纸片的制备将滤纸片(8mm)浸于发酵菌丝体萃取液中片刻，置于暗处适度挥干后暗中保存，备用。2筛选方法供试细菌一金黄色葡萄球菌，在普通肉汤液体培养基上培养10h后，取100iiL涂布于O.5cm厚的普通肉汤固体培养基上，铺6个浸有发酵菌丝体萃取液的纸片，用680Lx的光照量光照60min后，以抑菌圈的产生与否及大小来判断竹红菌素光敏抑菌活性的有无及其高低。抑菌圈与纸片半径的差值越大表示竹红菌素光敏抑菌活性越高。抑菌效果为抑菌圈半径与纸片半径的差值。3实验结果3.1竹黄无性型菌株产竹红菌素的表现竹黄无性型菌株发酵菌丝体的提取液多呈无色、淡褐色或是褐色，不同菌株间提取液的颜色差别不太，而且提取液颜色的深浅是否和竹红菌素含量的高低有直接的联系，需要进一步确证。3.2不同的竹黄无性型菌株对竹红菌素光敏活性的差异分离到的65株竹黄无性型菌株应用筛选高产竹红菌素的方法，发现不同菌株发酵提取液所产生的抑菌圈差异很大。竹黄无性型菌株GZUIFR-08K1抑菌效果最高，达到5.50mm，而有的菌株的提取液基本上就没有抑菌圈。而且用高效液相色谱仪测量竹黄无性型菌株提取液中竹红菌素含量的方法，进行进一步比较，证实此筛选方法的可靠性。综上所述，竹红菌素最佳光敏抑菌活性与供试菌种、供试菌种的培养时间、培养基、培养基厚度、供试菌种的添加量、纸片数量和光照时间有密切的关系。高产竹红菌素的筛选方法金黄色葡萄球菌在普通肉汤液体培养基上培养10h后，取lOOiU涂布于0.5cm厚的普通肉汤固体培养基上，铺6个制备好的纸片，光照60分钟后，发现不同的竹黄无性型菌株产抑菌圈的大小有明显的不同，筛选出高产竹红菌素的菌株GZUIFR-08K1。以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求一株高产竹红菌素的竹黄菌株，其特征在于该菌株是竹黄无性型菌株，该菌株是从采自浙江省桐庐县的竹黄子实体上分离获得；该菌株编号为GZUIFR-08K1，菌株保藏号CCTCCNOM209141，2009年7月7日在中国典型培养物保藏中心保藏。2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于所述竹黄的无性型菌株是在查氏培养基上，26t:培养4d后，菌落直径超过2.5cm，10d后菌落直径达67cm，菌丝有隔，有分枝，透明，宽度38ym;菌落表面初期呈棉絮或疏松绒毛状，有同心轮带，白色后呈淡褐色，基质菌丝密致呈黑色；培养10d后，未见产孢结构。3.竹红菌素高低的筛选方法，其特征在于所述方法是将滤纸片浸于竹红菌素的乙醇萃取液中lh后，除尽溶剂后，将6个制备好的纸片叠起铺在涂布有100iiL金黄色葡萄球菌的普通肉汤固体培养基(厚O.5cm)上，光照60min后，在此条件下，竹红菌素的光敏抑菌活性最高。4.如权利要求1和2所述竹黄菌株的筛选方法，其特征在于所述竹红菌素的筛选方法包括(1)供试菌的选择；(2)竹红菌素激发条件的选取；(3)供试菌培养条件的确定；(4)筛选方法的具体过程；(5)性能检测。5.如权利要求1和2所述竹黄无性型菌株的应用方法，其特征在于该方法是将竹黄无性型菌株接种于PDA液体培养基上，26t:下恒温培养14d，收集菌丝体，烘干，用乙醇提取得到竹红菌素；再用上述的筛选方法，根据抑菌圈的大小来判断不同菌株所产竹红菌素含量的高低。此筛选方法为竹红菌素的相关部门选育菌种。全文摘要本发明公开了一株高产竹红菌素的竹黄无性型菌株及其筛选方法，该菌株是竹黄无性型菌株GZUIFR-08K1，菌株保藏号CCTCCNOM209141，2009年7月7日在中国典型培养物保藏中心保藏。竹黄无性型菌株在查氏培养基上，26℃培养4d后，菌落直径超过2.5cm，10d后菌落直径达6～7cm，菌丝有隔，有分枝，透明，宽度3～8μm；菌落表面初期呈棉絮状，有同心轮带，白色后呈淡褐色，基质菌丝密致呈黑色；培养10d后，未见产孢结构。竹红菌素的筛选方法包括(1)供试菌的选择；(2)竹红菌素激发条件的选取；(3)供试菌培养条件的确定；(4)筛选方法的具体过程；(5)性能检测。本发明既能定性又可定量，简单又容易操作，便于对高产竹红菌素的菌种进行筛选。文档编号C12Q1/18GK101760435SQ200910102809公开日2010年6月30日申请日期2009年10月13日优先权日2009年10月13日发明者杜文,梁宗琦,梁建东,董旋,韩燕峰申请人:贵州大学