专利名称：一株高产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株真菌菌株，尤其涉及一株能够高效生产竹红菌素的毛竹种子内生 真菌菌株，本发明还涉及该毛竹种子内生真菌菌株在制备竹红菌素中的应用，属于竹红菌 素的制备领域。
背景技术：
竹红菌素(hypocrellin)是竹小肉座菌和竹黄子实体的主要有效成分，属茈醌类 化合物，是目前已知的在可见光区内优良的光敏剂，具有显著的光疗作用，临床上已用来治 疗皮肤病，如外阴白色病变和软化疤痕疙瘩。近年来研究发现它具有优良的光敏杀伤肿瘤 细胞和抑制艾滋病病毒HIV-1的作用，并且作为新型的光活化农药和潜在的光电转换材 料，已得到生物学界和医学界的广泛关注。目前国内外对竹红菌素的药理作用及应用价值已经展开广泛深入的研究，并已经 取得很多实质性和突破性的进展，市场对竹红菌素的需求量也越来越大。迄令为止，竹红菌 素是直接从竹小肉座菌和竹黄菌菌子实体中分离得的，而竹小肉座菌仅仅分布在云南局部 地区，产量低；竹黄菌发生虽然较广，但是自然发生往往受到气候、寄主等多种因子的影响， 而且年年“采摘”会导致资源枯竭，因此直接利用竹小肉座菌和竹黄子实体提取活性成分往 往受到多种限制，很难大规模产业化加以利用，利用微生物菌株发酵生产竹红菌素可排除 上述弊端，易于工业化生产，但其前提是需要分离得到能高效发酵生产竹红菌素的微生物 菌株。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株能够高效发酵 生产竹红菌素的菌株；本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的本发明通过对一株分离自广西的毛竹种子内生真菌菌株进行固体培养、摇瓶发酵 和提取测定，获得了一株能够高效发酵生产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株(菌株号为 ZZZ-817)，其微生物保藏号是CGMCC NO :3135 ；保藏日期是2009年6月26日；其分类命 名是(Shiraia bambusicola)；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。本发明主要通过以下方法从来自于广西壮族自治区灵川县灵川镇的毛竹种子内 生真菌分离得到上述竹黄菌菌株取毛竹种子先用75%乙醇进行表面消毒，去除表面组织，无菌条件下切割成1cm3 大小的组织块，然后在10%的次氯酸钠溶液中浸泡30-60s，再用无菌水冲洗三次，转移到 含PDA固体培养基(含0.4%的氯霉素)的平皿上，20°C进行培养，分离，即得。经过分子鉴定，本发明所分离得到毛竹种子内生真菌菌株ZZZ-817的分类地 位属于子囊菌门(Ascomycota)、假球壳目(Pleosporales)、竹黄菌属(Shiraia)、竹黄(Shiraia bambusicola)。本发明毛竹种子内生真菌菌株ZZZ-817菌株的生物学特性如下1、寄主本发明的内生真菌分离自毛竹(Phyllostachys edulis (Carr. ) H. De Lehaie)禾中 子。关于竹黄菌寄主的范围，文献报道不一致，林海萍等人认为有较广泛的寄主；赖光辉等 人的观察则认为竹黄菌寄主范围很窄，主要是短穗竹属种。侯成林等近年在安徽省广德县 竹种园以及旌德县的一些林场调查发现，竹黄菌在短穗竹上普遍发生，但与其相邻的其它 各种竹种，包括刚竹属和水竹属的成员却没有任何症状。但迄令为止还没有有关毛竹上竹 黄菌的报道。2、培养性状毛竹内生菌菌株ZZZ-817于26°C、PDA固体培养基上培养生长。约10d左右长满 皮氏平皿，呈同心环状生长，生长速度经测量约0. 336mm/d。依据公式菌丝体日均生长速度(mm d—1)=菌落半径增长长度(mm) /培养天数(d)本发明所要解决的另一个技术问题是将上述毛竹种子内生真菌ZZZ-817菌株应 用于生产竹红菌素；本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的毛竹种子内生真菌ZZZ-817菌株在生产竹红菌素中的应用，包括(1)将毛竹种子内生真菌ZZZ-817菌株接种到固体培养基进行平板培养；(2)从平板中挑取菌块接入液体种子培养基中，培养；(3)将扩大培养的液体种子接入到液体摇瓶发酵培养基中进行发酵培养；(4)将菌丝体与发酵液分离，得到菌丝体；再从菌丝体中提取得到竹红菌素。其中，步骤⑴中所述的固体培养基优选为PDA培养基；步骤(2)中所述的液体种子培养基的组成优选为马铃薯葡萄糖培养基，其配制方 法包括马铃薯(去皮)200g，切块浸煮20min，取滤液加入葡萄糖20g，加水至lOOOmL，pH 自然；灭菌，即得。步骤(2)中所述的培养优选在以下条件下进行培养转速为150r/min，培养温度 26 °C，培养时间60h ；步骤(3)中所述的液体摇瓶发酵培养基的组成优选为去皮马铃薯200g，切块浸 煮 20min，取滤液，加入葡萄糖 20g，KH2P04lg，MgS040. 5g 和 CuS040 . 03g，加水至 lOOOmL，调 pH 值至6;灭菌，即得。步骤(3)中所述的发酵培养优选在以下条件下进行发酵培养转速150r/min，培 养温度26°C，培养时间144h ；步骤(3)中所述的从菌丝体中提取得到竹红菌素的方法优选为将菌丝体用纯净 水冲洗，抽滤；收集菌丝体，冷冻过夜，再经真空冷冻干燥器干燥至恒重；将干燥的菌丝体 粉粹(用丙酮经索氏提取器)回流提取约4 5h至无色，浓缩，即得。试验结果显示，应用本发明毛竹种子内生真菌菌株发酵生产竹红菌素，每升发酵 液可获得竹红菌素1760. 9mg,竹红菌素的提取率高达152. 4%。与近些年来一些学者对竹 黄菌产活性物质竹红菌素含量的相关研究比较，本发明菌株所得竹红菌素含量较高，可实现规模化生产，具有较高的应用价值。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1、所用培养基的组成成分和配制1)固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，PDA培养基)马铃薯(去皮)200g，切 块浸煮20min，取滤液，加入葡萄糖20g和琼脂18g，加水至lOOOmL，pH自然，lX105Pa灭菌 30min,即得。2)液体种子培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯(去皮)200g，切块浸煮 20min，取滤液加入葡萄糖20g，加水至lOOOmL, pH自然，lX105Pa灭菌30min，即得。3)液体摇瓶发酵培养基去皮马铃薯200g，切块浸煮20min，取滤液，加入葡萄糖 20g, KH2P04lg, MgS040. 5g 和 CuS040. 03g，加水至 lOOOmL, pH6，IX 105Pa 灭菌 30min,即得。2、培养及检测方法1)平板培养固体培养基经12rC，30min常规灭菌后，用接种针挑取大小一致的 毛竹种子内生真菌ZZZ-817菌株菌块置于培养皿中心位置进行平板培养，26°C恒温。2)液体种子扩大培养从活化后的长满菌丝的平皿中挑取5块大小适宜的毛竹种 子内生真菌ZZZ-817菌株菌块接入种子培养基中，装液量为80mL/250mL，转速为150r/min， 26°C 培养，60h。3)摇瓶发酵培养将扩大培养的液体种子按10%的接种量接入发酵培养三角瓶 中，装液量 100mL/250mL，转速 150r/min，26°C 培养 144h。4)制备待测样将发酵培养物经布氏漏斗抽滤分离得菌丝体与发酵液，弃去发酵 液，菌丝体用纯净水冲洗三遍，抽滤，收集菌丝体放入培养皿中，冷冻过夜，再经真空冷冻干 燥器干燥1250min至恒重。干燥后的菌丝体放在真空干燥器保存，备用。5)竹红菌素提取将干燥的待测菌丝体粉粹，滤纸包裹。用丙酮经索氏提取器回 流提取约4 5h至无色，再经旋转蒸发仪浓缩，丙酮重溶，定容到20mL，4°C，避光保存。6)竹红菌素提取率的检测以丙酮作溶剂，采用分光光度法在465nm波长处测定 提取待测液的吸光值。0D值在0.2-0. 8之间。据标准曲线求得浓度，计算产量(说明竹 红菌素标准品由云南省微生物所提供，纯度在98%以上)。竹红菌素提取率(％ )=(提取物含量mg/菌丝体干重g)xl00试验结果显示，采用本发明毛竹种子内生真菌ZZZ-817菌株进行发酵，每升发酵 液中可获得竹红菌素1760. 9mg，竹红菌素的提取率高达152. 4%。
权利要求
一株高产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株(Shiraia bambusicola)，其微生物保藏号是CGMCC NO3135。
2.权利要求1所述的毛竹种子内生真菌菌株在发酵生产竹红菌素中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，包括以下步骤(1)将所述毛竹种子内生真菌菌株接种到固体培养基上进行平板培养；(2)从平板中挑取菌块接入液体种子培养基中，培养，得到液体种子；(3)将液体种子接入到液体摇瓶发酵培养基中进行发酵培养；(4)将菌丝体与发酵液分离，再从菌丝体中提取得到竹红菌素。
4.按照要求3所述的用途，其特征在于步骤(1)中所述的固体培养基为PDA培养基。
5.按照要求3所述的用途，其特征在于步骤(2)中所述的液体种子培养基的配制方 法为去皮马铃薯200g，切块浸煮20min，取滤液，加葡萄糖20g，加水至lOOOmL，pH自然。
6.按照要求3所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述的培养是在以下条件下进行培 养转速为150r/min，培养温度26°C，培养时间60h。
7.按照要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3)中所述的液体摇瓶发酵培养基的配 制方法为去皮马铃薯200g，切块浸煮20min，取滤液，加入葡萄糖20g，KH2P04lg，MgS040. 5g 和 CuS040. 03g，加水至 lOOOmL，调 pH 值为 6。
8.按照要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3)中所述的发酵培养在以下条件下进行 发酵培养转速150r/min，培养温度26°C，培养时间144h。
9.按照要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3)中所述的从菌丝体中提取得到竹红菌 素的方法包括将菌丝体用纯净水冲洗，抽滤；收集菌丝体，冷冻过夜，再经真空冷冻干燥 器干燥至恒重；将干燥的菌丝体粉粹用丙酮回流提取4 5h至无色，浓缩，即得。
全文摘要
本发明公开了一株高产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株及其应用。本发明通过对分离自广西的毛竹种子内生真菌菌株进行固体培养、摇瓶发酵和提取测定，获得了一株能够高效生产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株(菌株号为ZZZ-817)，其微生物保藏号是CGMCC NO3135。应用本发明毛竹种子内生真菌菌株发酵生产竹红菌素，每升发酵液中可获得竹红菌素1760.9mg，竹红菌素的提取率高达152.4％。与现有对微生物产活性物质竹红菌素含量的相关研究比较，本发明菌株所得竹红菌素含量高，可实现规模化生产竹红菌素，具有较高的应用价值。
文档编号C12R1/645GK101875905SQ200910237409
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者侯成林, 李星秀 申请人:首都师范大学