专利名称：屎肠球菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肠球菌属的屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium AnpOl)，于2009年1 月19日在中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCCNO: M209019,其作为一种饲料添加剂， 用于改善机体免疫力。
背景技术：
随着科技的发展，人们越来越重视机体免疫力的提高，微生态制剂作为一种能够明显提 高人体免疫力功能的制剂，受到国际医学机构的普遍关注和积极研究。微生态制剂也是一种 很好的饲料添加剂，并能起到机体免疫激活剂的作用，能刺激动物产生干扰素，提高免疫球 蛋白浓度和巨噬细胞的活性，通过非特异性免疫调节因子等激发机体免疫力的增强。动物口 服益生菌后，调整肠道内菌群构成，使肠道内的微生态平衡加以改善，活化肠粘膜内的相关 淋巴组织，使SigA抗体分泌增强，提高免疫识别能力，并诱导T、 B淋巴细胞和巨噬细胞等 产生细胞因子，通过淋巴细胞再循环而活化全身的免疫系统，从而增强机体免疫力。益生菌 可以激活巨噬细胞功能，刺激机体产生免疫应答，有益菌能够刺激负责人体免疫的淋巴细胞 分裂繁殖，同时还能调动非特异性免疫系统，去"吃"掉包括病毒、细菌、衣原体等在内的 各种可致病的外来微生物。现在使用的益生菌的种类主要有三种酵母菌、乳酸菌、芽孢菌， 其中以乳酸菌被选作益生菌菌种的数量最多，主要原因是因为乳酸菌能在动物的肠道内展现 强而有力的生物活力。然而这些乳酸菌类的益生菌菌种的世代时间大约在40-60分钟之间，如 最常见的乳酸杆菌等，世代时间较长，在肠道内和病原菌的竞争能力不强；乳酸杆菌制造的 乳酸5(^是L型乳酸，5094是D型乳酸，L型乳酸又称为天然乳酸，可被动物吸收并利用，而D 型乳酸则只能被吸收，而无法利用，因此吸收的D型乳酸的能量会被浪费掉；三种益生菌菌 种中以芽孢菌在干燥的环境下安定性最高，不易受到外界环境的影响，乳酸菌和酵母菌的安 定性则差很多，必须利用特殊的方法保护才能提高其安定性
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的词料添加剂菌种，屎肠球菌。本发明是屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01) CCTCC NO: M 209019。本发明是屎肠球菌AnpOl(EnterococcusfaeciumAnpOl)已于2009年1月19日保存在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为M209019。
本发明屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium AnpOl) CCTCC M 209019是一种对人和动物没有毒性和肠病原性的正常肠道菌类，用它制成的饲料添加剂，即使在不正常的情况下，也不会制造任何毒素，在宿主动物免疫功能低下时，也不会产生潜在的危险，是一种纯天然,没有任何外来的抗药性存在的饲料添加剂。此种屎肠球菌对酸有高度的抵抗力，可通过胃酸的考验顺利到达肠道，在pH 时，90分钟后存活率约为75-80%;世代时间特别短，约19分钟分裂一次，在肠道内和病原菌的竞争性强；另外，制造的乳酸全部都是L型乳酸，可以全部被动物吸收并利用。总之，本发明的屎肠球菌可以在肠道内快速生长，形成菌落并调节肠道菌群，抑制病原菌如沙门氏菌、大肠杆菌等，产生L型乳酸，产生类杀菌类，分泌生物薄膜，保护肠粘膜免受毒素侵袭，重建肠内正常菌群，刺激免疫系统，促进动物整体健康。
本发明是屎肠球菌Anp01(EnterococcusfaeciumAnp01)已于2009年1月19日保存在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC,保藏编号为M209019。
具体实施例方式
本发明屎肠球菌为球形或椭圆形，呈链状排列，无芽胞。无鞭毛。培养早期(2 4h)形成透明质酸的荚膜，有菌毛，含型特异的M蛋白。易被普通的碱性染料着色，革兰染色阳性。培养要求较高，需补充血液、血清、葡萄糖等。在血清肉汤中易形成长链，管底形成絮状沉淀。在血琼脂平板上，不同菌株溶血不一。
生化特征屎肠球菌分解葡萄糖，产酸不产气，不被胆汁溶解。
下面以几个试验说明屎肠球菌作为饲料添加剂的好处(1)本发明的屎肠球菌可以制造类杀菌素在试管内混合培养屎肠球菌和大肠杆菌时，屎肠球菌的繁殖曲线和单独培养时相同，但是大肠杆菌则在培养一段时间后数量开始减少，有人认为这是因为屎肠球菌分泌乳酸，使试管内的pH值降低，因而抑制大肠杆菌的繁殖，但是如果在试管内加入缓冲剂，使试管内的pH值固定时，大肠杆菌的繁殖曲线仍然相同，其实这是因为大肠杆菌分泌了所谓的"类杀菌素"杀死大肠杆菌的关系，同样的试验改用沙 门氏菌结果相同。
(2) 屎肠球菌的分泌物减少大肠杆菌吸附在肠上皮细胞的数量，在培养肠上皮细胞的试 管内加入病原性大肠杆菌， 一段时间后每个肠上皮细胞上约吸附着5个大肠杆菌，但是如果 在加入大肠杆菌的同时加入屎肠球菌的培养上清液，则只有约2个大肠杆菌吸附在肠上皮细 胞上，这是因为屎肠球菌产生一种分泌物会抑制病原菌吸附在肠上皮细胞上。
(3) 屎肠球菌的培养上清液降低感染伤寒杆菌的小白鼠的死亡率对照组的小白鼠只用 伤寒杆菌感染，试验组的小白鼠感染伤寒杆菌的同时另外给予屎肠球菌的培养上清液，第io 天和第15天使对照组的死亡率分别为65%和85%，而试验组的死亡率则分别为30%和40%， 此试验证明屎肠球菌的培养上清液不只在试管内可以抑制病原菌，在活体内也可以抑制病原
菌o
(4) 屎肠球菌抑制仔猪肠道内的大肠杆菌28日龄仔猪给予含有屎肠球菌词料添加剂 的饲料，发现试验组肠道内肠球菌的数量显著的比对照组仔猪多，相对的大肠杆菌的数量则 显著的比对照组少。同时发现试验组肠道内的另一种乳酸菌，乳酸杆菌的数量比对照组多很 多，原因是屎肠球菌在肠道内制造一个适合其他乳酸菌生长繁殖的环境。
(5) 屎肠球菌刺激免疫系统带有肿瘤的大白鼠其巨噬细胞(Macrophage)吞噬荧光颗粒 的比例约为30%，投与含有屎肠球菌饲料添加剂的饲料后，巨噬细胞吞噬荧光颗粒的比例提 高到约为45%，正常大白鼠的巨噬细胞吞噬荧光颗粒的比例约为60%。
(6) 屎肠球菌剌激免疫系统小白鼠给予屎肠球菌12小时后其血液中的干扰素的量约 为对照组的6倍多。
(7) 屎肠球菌保护肠道中其他的乳酸菌群使用修正流动培养系统(类似活体肠道内的 情况)培养屎肠球菌和L. acidophilus,对照组只培养L. acidophilus,试验组同时培养屎肠球 菌和L. acidophilus,第3-6天给予AmpiciUin,给予AmpiciUin后对照组L. acidophilus数量很 快的减少，停用AmpiciUin后数量慢慢回升，但和屎肠球菌混合培养的试验组给予AmpiciUin 后L. acidophilus的数量慢慢减少，停用AmpiciUin后L. acidophilus的数量很快的回升，可见 屎肠球菌可保护L. acidophilus,使之较不受AmpiciUin的縧响。
(8) 屎肠球菌保护肠道腮红的其他的乳酸菌群与(7)类似的试验，只是L. acidophilus 改为L.reuteri,且AmpiciUin改为Cephalexin,给予时间为第3-12天，其结果也类似。
5屎肠球菌(Enterococcus faecium )
16S rRNAJ ，列测定结果如下:
1GGCTCAGGACGMCGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCMGTCGTACGCTTCTTTTTCCA
61CCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAMGMGAGTGGCGMCGGGTGAGTMCACGTGGGTMC
121CTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGMACAGGTGCTAATACCGTATAACMTCGAAA
181CCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGC
241ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCMGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGG
301GTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG
361AATCTTCGGCMTGGACGMAGTCTGACCGAGCMCGCCGCGTGAGTGAAGMGGTTTTC
421GGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGMGMCMGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGA
481CGGTATCTMCCAGAMGCCACGGCTMCTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT
541GGCMGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGCTTTCTTAAGTCTGA
601TGTGAAAGCCCCCGGCTCMCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGA
661AGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGMCACCAG
721TGGCGMGGCGGCTCTCTGGTCTGTMCTGACGCTGAGGCTCGAMGCGTGGGGAGCAM
781CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAMCGATGAGTGCTMGTGTTGGAGGGTT
841TCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTMCGCATTMGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAA
901GGTTGMACTCAAAGGMTTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTT
961CGMGCAACGCGAAGMCCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAG
1021CTTCCCCTTCGGGGGCMAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG
1081ATGTTGGGTTMGTCCCGCAACGAGCGCMCCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTG
1141GGCACTCTAGCMGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGMGGTGGGGATGACGTCAAATCAT
1201CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACMTGGGMGTACAACGAGTTGCGAA
1261GTCGCGAGGCTAAGCTMTCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCMCTC
簡GCCTGCATGAAGCCGGMTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTC
1381CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGMGTCGGTGA
1441GGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTG
权利要求
1、屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC NOM 209019。
全文摘要
本发明涉及一种肠球菌属的屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)，于2009年1月19日在中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCC NOM209019，其作为一种饲料添加剂，用于改善机体免疫力。本发明屎肠球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC M209019是一种对人和动物没有毒性和肠病原性的正常肠道菌类，用它制成的饲料添加剂，即使在不正常的情况下，也不会制造任何毒素，在宿主动物免疫功能低下时，也不会产生潜在的危险，是一种纯天然，没有任何外来的抗药性存在的饲料添加剂。
文档编号C12N1/20GK101629155SQ200910136109
公开日2010年1月20日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者刘光辉, 峰 邵 申请人:邵 峰;刘光辉