专利名称：儿童过敏性哮喘遗传检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种儿童过敏性哮喘 遗传检测方法。
背景技术：
儿童过敏性哮喘是儿童最常见的慢性呼吸道疾病，以反复发作的呼吸困难、伴有 喘鸣音出现为主要症状，多在冬、春季发病，初次发病年龄多在学龄前。哮喘反复发作，对儿 童健康、学习和生活影响很大，且部分儿童哮喘可迁延至成人哮喘，成为终生疾患，如诊治 不及时，随病程延长可产生气道不可逆性狭窄和气道重塑，因此，对哮喘的合理防治至关重 要。儿童患过敏性哮喘有家族性说明该病和遗传因素有关，因此遗传体质不同的人， 应该采取不同的疾病风险控制策略才能更好的预防哮喘的发生；有效区分喘息性疾病忠儿 的病因(哮喘性和非哮喘性)，进行有效早期干预治疗，将提高治疗的针对性，避免过度化 治疗。利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的儿童过敏性哮喘遗传辅助诊 断与评估预测产品会对儿童过敏性哮喘的发生起到预警、个性化防治的作用。肾上腺素能受体(ADRB2或β 2_AR)是与鸟嘌呤核苷蛋白耦联(G蛋白耦联)的肽 链跨膜至少7次的受体家族成员之一。ADRB2在机体多种组织中均有表达，包括心肌细胞、 支气管和血管平滑肌细胞、脂肪细胞以及肾脏细胞。通过ADRB2激动剂的介导(如异丙肾 上腺素、肾上腺素)后，引起血管扩张、支气管平滑肌松弛等生理效应。rsl042713是位于 ADRB2第46位的A/G多态，导致氨基酸16的改变，即精氨酸(Argl6)变为甘氨酸(Glyl6)。 ADRB2编码区第16位氨基酸的变异已在体外试验中证实可以改变ADRB2的功能，影响气道 平滑肌松弛和组胺等介质的释放，是近年来国际上研究哮喘易感性及疾病调节基因的重要 候选基因之一。ADRB2基因多态性不仅能引起ADRB2表型功能的改变，而且在一定程度上影 响到哮喘的发生、严重程度及对治疗的反应。TNF-α基因，位于人类染色体6ρ21. 3位置，位于HLA-I类和HLA-II类基因之间， 并且与之紧密连锁。TNF-α基因全长2. 81Λ，共有4个外显子，mRNA全长l，669nt，编码234 个氨基酸残基的蛋白。TNF-α可以由多种细胞产生，包括巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞和 表皮细胞，但主要来源于巨噬细胞。TNF-α基因存在多个多态位点，其是位于TNF-α基因 启动子区第-308位的鸟嘌呤(G)变异为腺嘌呤(A)，存在三种基因型GG(无突变)，GA(突 变杂合子)，AA(突变纯合子)。许多研究发现该基因的多态性与哮喘疾病的易感性相关。跨膜结构域4亚家族A，成员2(MS4A2)是一异型多聚复合物，属于多条链的免疫 识别受体，其生物学功能，最主要功能是参与IgE介导的I型超敏反应，促进肥大细胞、嗜 碱性细胞释放炎性介质，分泌细胞因子，表达粘附分子。过敏气喘相关的两种细胞巨细胞 (Mast cells)及嗜碱性白血球(Basophils)，都有MS4A2基因产生的接受器，环境中的过敏 原与MS4A2结合后，会启动急性高度敏感反应，巨细胞会释放组织胺(Histamine)以及蛋白 分解酵素，合成前列腺素(ftOstaglandins)及白血球三烯素(Leukotrienes)，这过程会引起高度的敏感反应。rs569108基因多态性，即MS4A2E237G，是β链基因第七个外显子6843 位点碱基由鸟嘌呤(G)取代了腺嘌呤(A)，从而导致β链氨基酸系列中胞浆区羧基末端第 237位氨基酸由甘氨酸(G)代替了谷氨酸(E)。β链羧基末端胞浆区在IgE与α链结合后 与细胞浆之间的信号传递中起重要作用。由于甘氨酸为非极性疏水性氨基酸，谷氨酸却为 酸性氨基酸，含两个羧基，甘氨酸不带电荷、谷氨酸带负电荷，E237G便改变了 β链羧基末 端的亲水性，并进而可能影响β链的功能，导致血清总IgE水平升高，引起肥大细胞等释放 炎性介质增多。同时，β链羧基末端第237位氨基酸邻近酪氨酸激酶受体与酪氨酸激酶相 互作用并通过酪氨酸的磷酸化而激活细胞，E237G可能是通过影响ITAM的功能而导致细胞 内信号传递方式发生改变。ACE基因编码血管紧张素转化酶，位于第17号染色体17q23. 3位置。全长 44，769bp，mRNA全长4，195nt，共有48个外显子，编码1，306个氨基酸残基的蛋白。ACE是 一种膜结合糖蛋白，属二肽基羧肽酶，能将血管紧张素I (十肽，由肾素转化而来)肽链C末 端的组氨酸和亮氨酸残基水解，形成具有增压作用的血管紧张素II，从而在血压调节和电 解质平衡方面发挥重要作用。ACE不仅使具有降血压作用和参与炎性作用的缓激肽、P物质 等多肽性物质灭活，还能直接作用于肾上腺皮质，促进醛固酮分泌。因此，它是肾素-血管 紧张素-醛固酮系统以及缓激肽系统的重要调节因素，影响人体多种生理功能。从1988年 ACE基因被克隆，目前已发现多种ACE基因多态性标志。近年来研究最多的是位于第16内 含子中一段长的插入/缺失多态rs4646994位点，含有此片段的ACE等位基因称为I 型等位基因，不含此片段的称为D型等位基因。从而产生了三个不同的基因型，即在17号 染色体上均插入这一片段为插入型纯合子(I/I型)，均缺失这一片段为缺失型纯合子(D/D 型)，如在一条染色体上插入而另一条染色体缺失这一片段为杂合子(I/D型)。关于DD型 影响哮喘发病的机制，可能是通过Ang II的产生增加有关，另外DD基因可能与哮喘患者肺 功能损害的程度有关。通过对儿童哮喘的风险基因型的遗传检测，从基因角度评估儿童哮喘的遗传风 险，从而更好的预防疾病的发生。作为疾病传统防控方法的创新发展，遗传检测项目在疾病 尚未发生时，就从遗传角度提示疾病发生风险，继而对遗传高发病风险人群进行改变生活 方式、调整环境因素及其他手段予以干预，达到降低疾病发生风险的目的，从而降低人群中 儿童过敏性哮喘发病率，提升了群众生活质量，减轻了社会医疗负担。并且此遗传检测作 为儿童哮喘疾病的一种辅助诊断和鉴别诊断方法，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出 来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提 供了有利的指导。
发明内容
本发明提供一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法。通过采集受检者的口腔粘膜细胞，提取其基因组DNA，对其基因组DNA的ADRB2 基因rs 1042713位点、TNFA基因rs 1800629位点、MS4A2基因rs569108位点和ACE基因 rs4646994位点多态性进行检测，从基因层面评估儿童哮喘的遗传风险，并作为辅助诊断和 鉴别诊断，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的 诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提供了有利的指导。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总 体积10 μ 1，包含浓度为20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针 各0.25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤3:基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
1. 一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法，其特征在于采集受检者的口腔粘膜细胞，提 取其基因组DNA，对其基因组DNA的ADRB2基因rsl042713位点、TNFA基因rsl8006^位 点、MS4A2基因rs569108位点和ACE基因rs4646994位点多态性进行检测，从基因层面评 估儿童哮喘的遗传风险，并作为辅助诊断和鉴别诊断，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区 分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工 作提供了有利的指导。
全文摘要
本发明公开了一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法，通过采集受检者的口腔粘膜细胞，提取其基因组DNA，对其基因组DNA的ADRB2基因rs1042713位点、TNFA基因rs1800629位点、MS4A2基因rs569108位点和ACE基因rs4646994位点多态性进行检测，从基因层面评估儿童哮喘的遗传风险，并作为辅助诊断和鉴别诊断，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提供了有利的指导。
文档编号C12Q1/68GK102108383SQ20091020048
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者冯哲民, 贺宪民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司