专利名称：用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，涉及一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗 的基因组合。
背景技术：
表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶介导的细胞生长信号通路在癌症的形成和 发展中起重要作用。EGFR在许多不同的实体瘤患者中过表达，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、 乳腺癌。卵巢癌、头颈癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌和胶质细胞瘤等，常与预后不良。 放化疗抗性、肿瘤血管形成和肿瘤的转移有关，已成为肿瘤治疗的理想靶点。近年来，许多 以此为靶点的新抗肿瘤药物陆续被开发，在多种肿瘤治疗中取得了令人鼓舞的疗效。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替 尼/Erlotinib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美 国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对 10-30 %的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR酪氨酸激酶区基因突变是NSCLC 靶向治疗药物奏效的一个必要前提条件，而且绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗效显 著。因此，检测EGFR基因突变成为NSCLC病人是否接受靶向治疗的重要依据。EGFR =EGFR与配体结合后激活酪氨酸激酶区，结合1个ATP分子，自身发生磷酸化 和转磷酸化作用，使受体酪氨酸残基磷酸化，然后将信号传入细胞内。EGFR不但能调节正常 细胞的增殖分化，而且在调节肿瘤细胞的生长、修复和转移中也具有重要的作用。EGFR的突 变主要发生在外显子18-21，其中19和21两外显子突变率可达到90%。19外显子碱基缺 失主要发生在746-750位的氨基酸，这个位子是ATP结合的关键部位，突变改变了受体ATP 结合位点(ATP-binding pocket)的角度，明显的增加了癌细胞对EGFR抑制剂如特罗凯和 易瑞沙的敏感性。21外显子点突变表现为858位密码子的亮氨酸转变为精氨酸(L858R)， 此突变位点紧邻激酶活化环中高度保守的Dre序列附近，使活化环的稳定性提高，也明显 增强癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI 治疗的病人，进行EGFR基因突变检测。Kras :ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种H-ras、K_ras和N_ras，分别定 位在11、12和1号染色体上。其中，K-ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关，当正常 时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。Kras突变基因检测能确定是否适合进行表皮生长因子受体抑制剂这类药物的个 体化治疗，通常情况下，60%左右的结直肠癌病人的K-ras基因都是野生型的，这样在化疗 基础上加上表皮生长因子受体抑制剂，如爱必妥，有效率可以达到60%左右，延长病人生 命。而突变型的病人则不适合进行单抗药物的治疗。K-ras基因突变的最常见的方式是点 突变，多发生在N端第12、13和61密码子，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为GGT 突变成GTT。Kras基因突变检测已被美国癌症综合网络(NCCN)列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。药物代谢和效应的个体化差异临床上，同样药物的剂量对病人甲有效，对病人乙 可能不起作用，对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很 大。因此，在对肿瘤病人进行化疗时，如果先对其相关基因位点进行检测，再根据其基因突 变情况进行治疗，就可以对病人实施个体优化治疗。因此，通过检测病人肿瘤组织中的EGFR-Exon 19，EGFR_Exon21，Kras_codon 12/13， Kras-codon61基因位点的突变情况，对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人进行 药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。现有临床用药方法的缺陷在很多疾病的治疗过程中，常发生用药不当而导致副 作用或因剂量不足无法达到治疗目的。因此针对这些病患的基因型进行个体化用药具有特 别重要的意义。以前，医生如果需要调整病人的用药，需要长时间观察，病人也需要做大量 的检测。这种调整用药的过程程序复杂，费时，延误治病时机。本发明的有益之处是(1)本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法； (2)本发明通过检测病人肿瘤组织中的EGFR-Exonl9，EGFR_Exon21，Kras_codonl2/13， Kras-codon61基因位点的突变情况，对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人进行 药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤的治疗过程中，易瑞沙、特罗凯类药 物的疗效在不同病人间的明显差异，提供一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药 方案的基因组合及其应用方法。本发明的目的是提供一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组 合，包括:EGFR-Exonl9, EGFR_Exon21, Kras_codonl2/13, Kras_codon61 基因。本发明的另一个目的是提供该基因组合在指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗 中的应用。基于上述目的，本发明采用以下技术方案针对上述基因的特异性位点设计引物，各基因引物序列如表1所示。表权利要求
1.一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合，其特征在于该基因组 合包含 EGFR-Exon 19, EGFR_Exon21，Kras-codonl2/13, Kras-codon61 基因。
2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于针对EGFR-EXonl9位点设 计的正向引物序列为TAACGTCTTCCTTCTCTCTCTG (SEQ ID No. 1)，反向引物序列为 GTGGAGATGAGCAGGGTCTA (SEQ ID No. 2)；针对 EGFR_Exon21 位点设计的正向引物序列 为 TCTTCTCTGTTTCAGGGCA (SEQ ID No. 3)，反向引物序列为 ACAATACAGCTAGTGGGAAGG (SEQ ID No. 4)；针对 Kras-codonl2/13 位点设计的正向引物序列为 ACTGGTGGAGTATTTGA(SEQ ID No. 5)，反向引物序列为 AAGATTTACCTCTATTGTTG (SEQ ID No. 6)；针对 Kras-codon61 位点设计的正向引物序列为TTCTCCCTTCTCAGGATTC (SEQ ID No. 7)，反向引物序列为 TTACTCCTTAATGTCAGCTTAT(SEQ ID No. 8)。
3.如权利要求2所述的引物序列在检测其相应的基因突变中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下(1)提取病人肿瘤组织基因组DNA；(2)以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，用权利要求2所述的扩增引物进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物凝胶电泳分析；(4)PCR扩增产物测序。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应体系每20μ 1组成 如下待测病人肿瘤组织基因组DNA 50 100ng，Taq酶0. 125 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5πιΜ)2μ 1，10XPCR 缓冲液(含 Mg2+) 2 μ 1，余下为无菌蒸馏水。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测EGFR-EXonl9的PCR 扩增反应条件是95°C变性2min，随后95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，进 行45个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测EGFR-EXOn2IWPCR 扩增反应条件是95°C变性2min，随后95°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，进 行45个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测KraS-C0d0nl2/13 的PCR扩增反应条件是95°C变性2min,随后95°C变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸 Imin，进行45个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测Kras-codonei 的PCR扩增反应条件是95°C变性2min,随后95°C变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸 Imin，进行45个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4)中测序PCR扩增的反应条件 为95°C预变4min，随后95°C变性30sec，50°C退火15sec，进行35个循环，最后60°C延伸 4min，4°C 保存。
全文摘要
本发明属于基因技术领域，提供一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合，包括EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61。本发明通过检测病人肿瘤组织中的EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因位点的突变情况，对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人进行药物敏感指导，以使疗效达到最大，副作用降到最低。
文档编号C12N15/11GK102146434SQ20101010738
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者徐玲丽, 楼敬伟, 黄慧 申请人:上海宝藤生物医药科技有限公司