专利名称：一种检测无鳞鱼致病菌温和气单胞菌的方法和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类致病菌的检测技术，特别是无鳞鱼致病菌温和气单胞菌的检 测方法和检测试剂盒以及相应的引物。
背景技术：
随着大口鲶、斑点叉尾鮰等名贵经济无鳞鱼的高密度养殖，细菌性疾病的发生日 益严重，特别是苗种阶段尤其明显。因此，只有不断地完善防治方法，认真贯彻“全面预防， 积极治疗”的方针，才能收到预期的防病效果。预防疾病的一个重要基础是判断养殖水体中 或鱼体内中是否存在某些特定的鱼类致病菌以及已经存在的致病菌的种类和数量，从而才 能够采取合适的方法对症下药。因此，如何快速、准确地检测和判断某些细菌的感染，以有 助于阐明其致病机理，及时治疗和控制鱼病的发生，一直就是众人所努力攻克的难题。目前，针对致病菌的检测和诊断技术多种多样，包括选择性培养基鉴别培养 法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(D0T-ELISA)、单克隆抗体技术 (Monoclonal Antibody Technique)等。这些方法各有其特点，但在生产应用中多表现出 培养时间较长、只能用于粗略检测，不甚精确、敏感性和特异性差等不足。而在检测和诊断 技术中，聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction, PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特 异、适于早期和大量样品检测的优点，已在该研究领域得到广泛应用。但是对于无鳞鱼中斑 点叉尾鮰和大口鲶主要致病菌柱状黄杆菌和温和气单胞菌，目前国内尚没有相关的PCR检 测技术方面的研究报告。为了及时监控无鳞鱼养殖中的鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内或养殖 水体中是否存在致病菌的技术。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测无鳞鱼致病菌的试剂盒，包含引物B，其核苷酸 序列如SEQ ID NO 1-2所示，扩增来自温和气单胞菌(Aeromonassobria)的基因。所述试剂盒还含有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的阳性对照物。本发明的另一目的是提供一种检测无鳞鱼致病菌的方法，包括以下步骤1)提取待检样本中的DNA ；2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO :1 2所 示；3)用SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列制备标准阳性模板，并进行稀释和定量；4)对DNA扩增结果进行检测。本发明方法步骤1)所述的待测样本取自鱼体或养殖水体。本发明的再一个目的是提供一种选自如SEQ ID NO :1 2所示寡核苷酸序列的用 途，其用于扩增或检测来自温和气单胞菌的基因。
图1温和气单胞菌常规PCR测试引物及检测体系11-19 引物对 AS1F/AS1R，11-13 为空白对照；21-29 引物对 AS2F/AS2R，21-23 为空白对照；31-39 引物对 AS3F/AS3R，31-33 为空白对照；M :DNA marker I.图2温和气单胞菌常规PCR检测体系的特异性1-2 空白对照；3 豚鼠气单胞菌ATCC 15468 ;4 嗜水气单胞菌；5 荧光假单胞 菌；6 河弧菌；7 柱状黄杆菌；8-9 温和气单胞菌；M =DNA markerI.图3温和气单胞菌常规PCR检测体系的灵敏度1-7 基因组DNA从50纳克到50菲克的10倍梯度稀释；8 空白对照；M =DNA marker I.图4草鱼样品检测结果(温和气单胞菌) 1 空白对照；2-14 鱼池采集的样品；15 阳性对照；M =DNA marker I.图5鲤鱼样品检测结果(温和气单胞菌)1 空白对照；2-8 待检测样品；9 阳性对照；M =DNA marker I.图6水体中温和气单胞菌检测结果1 空白对照；2-5 待测水样，6 阳性对照；M =DNA marker I
具体实施例方式根据已有文献资料报道，温和气单胞菌为常见的鱼类致病菌，在养殖无鳞鱼的发 病鱼体和养殖水体中常常存在，因此，我们选取温和气单胞菌作为研究靶标，以PCR作为技 术手段，以这些菌株的保守毒力基因序列作为靶标序列，研究和建立PCR快速检测技术体 系，从基因水平上，通过多学科的联合研究，在鱼致病性细菌的早期、快速、定量检测方面进 行一些积极的探索，加强鱼病的预防和诊断。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。本发明的实验方法均参照《精编分子生物学实验指南》(F. M.奥斯伯等主编，科学 出版社2005年出版)所建议的实验条件。 实施例一弓I物的设计和阳性对照物的筛选合成1、从GeneBank上查找靶标病原菌温和气单胞菌的保守基因序列，并根据这些序 列设计引物及探针。引物交由上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成。2、实验材料及试剂材料鱼类常见致病菌柱状黄杆菌、温和气单胞菌、河弧菌、荧光假单胞菌、豚鼠气 单胞菌和嗜水气单胞菌。前五个菌株均购自中科院武汉水生生物研究所，嗜水气单胞菌由 四川农业大学鱼病研究中心提供。使用前均用相应的培养基活化，并用细菌基因组DNA提 取试剂盒(Tiangen)提取基因组DNA。将提取的基因组DNA 10倍梯度稀释，用于评价PCR 体系的灵敏度；试齐[J:5U/yL Taq DNA polymerase (Promega，含 IOXreaction buffer 禾口 25mM Mg2+) > IOmM dNTPs (Promega)、DNA marker I (Tiangen) ；MilliporeH2O 高压灭菌后分装， 于-20度保存备用。
3、引物、菌株测试用常规PCR测试所设计的引物和购买的菌株，PCR反应体系根据各组分的浓度配 制，扩增程序根据引物的TM值及产物的大小编写。常规PCR扩增在Bio-Rad Mycycler梯 度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测所得到的PCR产物。4、PCR体系性能测试PCR体系优化好以后，测试该体系的检测特异性及灵敏度。结果温和气单胞菌A.常规PCR测试购买的细菌及设计的引物我们设计的三对引物序列如下AS1F/AS1R、AS2F/AS2R、AS3F/AS3R从图1可以看出，对于温和气单胞菌，我们所设计的三对引物均可扩增出靶标条 带，表明购买的温和气单胞菌、自行设计的引物以及使用的PCR扩增体系也均可用于后续 的实验。考虑到常规PCR产物需要电泳等特点，我们根据经验选用AS3F/AS3R引物对(其 核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示，)用于后续实验。B.常规PCR检测体系的特异性对于常见的几种非靶标鱼类致病菌，使用我们建立的常规PCR检测体系均为检测 阴性，对温和气单胞菌为检测阳性，这表明我们所建立的常规PCR检测体系具有极好的特 异性，可以用于温和气单胞菌的快速检测(图2)。C.常规PCR检测体系的灵敏度将提取的温和气单胞菌基因组DNA作10倍梯度稀释，用作模板测试所建立的常规 PCR体系的检测灵敏度。实验结果表明，我们所建立的常规PCR体系也可检测到pg级的基 因组DNA，说明该体系具有较好的检测灵敏度(图3)。实施例2试剂盒的制备和组成成分组成1、PCR反应液800 μ L (10 μ L/次，80次，含核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的 引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶缓冲液)2、Taq 酶20 μ L (0. 25 μ L/次，80 次)3,6% Chelex-100 16mL(DNA 提取液，200 μ L/次，80 次)4、DNA 阳性对照 160 μ L (2 μ L/次，80 次)5、灭菌超纯水 2mL制备方法将Taq酶缓冲液(终浓度2X)、上下游引物(终浓度0.6 μ M)、 dNTPs (终浓度0. 4mM)、Mg2+(终浓度4mM)依次加入离心管，用无菌超纯水补足总体积至 800 μ L0 Taq酶为商品酶，购于promega公司，-20度保存。DNA阳性对照制备方法见实施 案例3。灭菌超纯水使用Millipore纯水仪制备，高压灭菌后分装。以上成分均需_20°C保 存，使用时取出融化，短暂离心后使用。称取6g Chelex-100粉末(Bio-Rad)，溶于IOOmL无 菌超纯水中，即为6% Chelex-100溶液，4°C保存备用。实施例3检测待测病鱼样本1)提取疑似患病鱼取样组织的DNA采集了一些患病及疑似患病的草鱼和鲤鱼样品，使用Chelex-IOO(Bi0-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下取一小块患病组织块，加入200 μ L Millipore H2O,捣烂，取出 没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12，OOOrpm离心lmin，弃上清，加入200 μ L Millipore H2O 重悬。充分混勻后取50 μ L加入到200 μ L 6%的chelex-100中，混勻，56°C保温20min，剧 烈震荡混勻后于100°C保温8min，剧烈震荡，并于12，000离心3min，取上清作为PCR的模 板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。常规PCR扩增在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪 上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测分析得到的PCR产物。剩余的模板于_20°C 保存以备复检。2)用实施例1制备的引物扩增样本中的DNA，使用实施例2的试剂盒 用以下程序做PCR反应体系(终浓度)程序IXreaction buffer95"C 4min0. 3μΜ primer F/primer R 94"C 15s0. 2mM dNTPs56°C IOs X 382mM Mg2+72V 15s1. 25U Taq DNA polymerase 72°C 5min2μ L Template4°C holdAdd Millipore H2O to 20 μ L3)阳性对照物及标准模板的制备用建立的常规PCR体系扩增温和气单胞菌基因组DNA，2%琼脂糖凝胶电泳分离得 到特定的靶标条带。用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶标DNA。将回收的部分DNA加入到连接体系 中(10 μ L，含线性克隆载体、连接酶和连接酶buffer)，16°C连接过夜。次日，将全部的连接 产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37°C培养至长 出菌落。挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子。将 阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中培养过夜，并取ImL提取质粒DNA(普通质粒小 提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，从而得到阳性对照物。测定提取的质粒DNA 的浓度，稀释到一定倍数作为阳性对照用于PCR检测。4)检测扩增DNA (方法同实施案例3的样品制备和PCR检测)待测患病草鱼的鳃糜烂，灰色或紫色，腹部充血涨肿，尾部有红色或暗红色条纹， 与柱状黄杆菌感染引起的症状接近，但不排除有其它细菌的混合感染。待测患病鲤鱼皮肤糜烂或充血，有的鱼有白绒毛状物质附着，尾部及后腹部在水 中呈白色，死亡较快。温和气单胞菌检测结果(草鱼样品)见图4。在采集的13个草鱼样品中，样品10的扩增条带大小与阳性对照的一致， 表明为温和气单胞菌检测阳性；样品8产生的扩增条带不明显，怀疑存在少量的温和气单 胞菌感染；其余样品，包括空白对照无扩增产物。说明温和气单胞菌是草鱼的致病菌之一。温和气单胞菌检测结果(鲤鱼样品)见图5。在采集的7个鲤鱼样品中，样品3、7及8有靶标条带产生，表明有温和气单胞菌的存在；其余样品，包括空白对照均无扩增条带生成。说明温和气单胞菌是鲤鱼的致 病菌之一，且在鲤鱼的病鱼中，温和气单胞菌检出率较高。图4和图5显示检测结果较好。这表明我们建立的常规PCR检测体系具有很好的 检测效果，可以用于鱼病的检测和预测，为鱼病的防治提供科学依据。实施例4 水体中温和气单胞菌的检测1)细菌DNA的获取从养殖水体中采样，用无菌离心管取水样lmL，12，OOOrpm离 心lmin，弃上清，加入200 μ L Millipore H2O重悬。充分混勻后取50 μ L加入到200 μ L 6% 的chelex-100中，混勻，56°C保温20min，剧烈震荡混勻后于100°C保温8min，剧烈震荡，并 于12，000离心3min，取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。常规 PCR扩增在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测 分析得到的PCR产物。剩余的模板于_20°C保存以备复检。2)用实施例1制备的引物扩增样本中的DNA，使用实施例2的试剂盒及实施例3 的PCR程序进行检测。3)结果见图6。四个水样本中，第二泳道也就是样本1有温和气单胞菌检出，产 物条带大小与第六泳道的阳性对照一致，也与相应水体中的鱼的发病情况一致，表明该试 剂盒可以用于水体样本的检测。第一泳道为空白对照。也就是说在水体中检测出了温和气单胞菌，可以大致推测该水体的病鱼中的主要 致病菌与温和气单胞菌关系密切。本发明试剂盒能快速准确地检测病鱼和养殖水体中的温和气单胞菌，方法简便， 检测样本量大，为有针对性治疗和有效预防鱼病提供了可靠的诊断结果，避免了盲目施治 导致的农药滥用，为消费者提供安全的水产品提供了保证。本发明核苷酸序列SEQ ID NO :1 3如下SEQ ID NO :1、2(引物对)温和气单胞菌常规PCR特异性引物AS3F/AS3R扩增片段的序列(131bp)SEQ ID NO 1 AS3F =Sense primer :5-GCAATCTAGCCATCCAAACG-320bpSEQ ID NO 2 AS3R :Anti_sense primer 5-CCAACGTAAGTACAGCTATGC-32Ibp扩增产物Product :I3IbpSEQ ID NO 3温和气单胞菌常规PCR特 异性引物AS3F/AS3R扩增片段的序列(131bp)995 gcaatc tagccatcca aacggctatt1021 ttggttacca taacagagcc atccactgcc gccaagcaat aaaccgctggttccacctca1081 tcacccttgc tgtcactccc gaatgcatag ctgtacttac gttgg
权利要求
1.一种检测无鳞鱼致病菌的试剂盒，其特征是包含引物B，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示，扩增来自温和气单胞菌的基因。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒还含有如SEQID NO 3所示 核苷酸序列的阳性对照物。
3.—种检测无鳞鱼致病菌的方法，其特征是1)提取待检样本中的DNA;2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO :1 2所示；3)用SEQID NO 3所示的核苷酸序列制备标准阳性模板，并进行稀释和定量；4)对DNA扩增结果进行检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是步骤1)所述的待测样本为鱼体或养殖水体。
5.一种选自如SEQ ID NO :1 2所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于扩增或 检测来自温和气单胞菌的基因。
全文摘要
本发明公开了一种检测无鳞鱼致病菌温和气单胞菌的方法和检测试剂盒，试剂盒包含引物B，其序列如SEQ ID NO1～2所示，扩增来自温和气单胞菌的基因。用本发明的方法可以快速准确地检测无鳞鱼体内或养殖水体是否含有致病菌，做到有针对性的防治鱼病。
文档编号C12Q1/68GK102002523SQ201010180810
公开日2011年4月6日 申请日期2010年5月5日 优先权日2009年9月3日
发明者刘衍鹏, 康琦, 肖丹, 黄冠军 申请人:通威股份有限公司