专利名称：一种食品中弯曲菌的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及细菌分离技术，特别是对食品中的弯曲菌(Campylobacter)的直接定量计数方法。
背景技术：
弯曲菌是全球范围内胃肠炎的主要病因，是主要的食源性病原菌，能引起散发性 和地方流行性的胃肠炎爆发，特别是在缺陷性的个体，如癌症病人、艾滋病病人、糖尿病 人、小孩和老人等，5岁以下儿童的发病率最高，另外，格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)是特定血清型空肠弯曲菌感染后最严重的并发症，可以导致呼吸肌麻痹而 死亡，因此，弯曲菌也是全球公共卫生关注的重点。近些年来，弯曲菌感染率在世界各地普 遍呈上升趋势，已成为最常见的、急性细菌性肠道传染病，据美国国家食品网的监测，弯曲 菌是发病率最高的病原菌，其病例数已超过李斯特菌病、沙门氏菌病和志贺氏菌病。弯曲菌流行病学研究表明，处理或消费食品，尤其禽肉，是人感染弯曲菌病的最重 要途径，对人的最低感染剂量为500CFU(菌落)。弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标， 在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是检测的项目，有重要的社会、经 济意义。弯曲菌是兼性微需氧菌，培养条件苛刻，常规培养需要丰富的营养条件和稳定适宜 的气体条件，国内外的研究起步较晚，其常规培养方法还有待于进一步完善。传统的弯曲菌 检测与分离主要依靠生化试验和血清凝集试验。由于弯曲菌具有对培养基营养要求高、培 养条件苛刻，对氧气都比较敏感，只能在低氧环境中生长，培养周期较长等特点，采用不同 的检验程序、方法，报告结果差异较大，尤其是无法实现对食品中弯曲菌的直接计数(定量 检测)。确诊检验结果至少需10 20天，检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷。 因此，快速、准确、简便的细菌检测方法将是发展的方向。建立一种快速检测食品中弯曲菌 的分离与定量分析具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于为人们提供一种能快速分离与定量分析出样本是否被弯曲菌污 染及污染数量的检测方法。本发明所说的弯曲菌的定量检测方法，是将样品在含抗生素和生长促进剂的固体 CCDA培养基培养后直接进行弯曲菌的分离与直接计数。以上CCDA固体培养基中抗生素包括多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌 酮、两性霉素B和头孢哌酮6种抗生素。所述抗生素在培养基中的含量为多粘菌素B :6· 7 X l(T3g/L ；甲氧苄氨嘧啶0· lg/L ；利福平0·lg/L ；放线菌酮lg/L;
头孢哌酮0·128g/L ；两性霉素B :0· 04g/L。以上CCDA固体培养基中生长促进剂包括丙酮酸钠、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁。培养 基中生长促进剂的最终浓度为0. 5g/L。本发明较经典方法的细菌培养、分离和鉴定方法简便、特异、准确。
图1为含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢哌酮和两性霉素B 6 种抗生素和生长促进剂的固体CCDA培养基直接分离食品中弯曲菌的效果图。图2为普通固体CCDA培养基直接分离食品中弯曲菌的效果图。图3为含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮等4种抗生素的固体CCDA 培养基直接分离食品中弯曲菌的效果图。图4为含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢哌酮和两性霉素B 6 种抗生素的固体CCDA培养基直接分离食品中弯曲菌的效果图。图5为含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢哌酮和两性霉素B 6 种抗生素、生长促进剂和10%鸡血清的固体CCDA培养基直接分离食品中弯曲菌的效果图。图6为含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢哌酮和两性霉素B 6 种抗生素、生长促进剂和10%绵羊全血的固体CCDA培养基直接分离食品中弯曲菌的效果 图。
具体实施例方式一、样品采集、样品预处理用灭菌棉拭采集样品(禽肉、猪肉，等)或直接将样品插入Carry-Blair运送培养 基中，于24h内送检，样品采集遵循统计学要求。从运送培养基中取出样品，置于含500 μ 1灭菌PBS(pH7. 2)的指形管中，充分浸 透，20min，间隔振荡数次；取出棉拭，收集浸出液。二、CCDA培养基配制培养基配制用水普通蒸馏水煮沸5-lOmin将水中氧气充分释放，冷却用于培养 基配制。CCDA培养基配制按CCDA产品说明书(0X0ID公司，CM0739)配制培养基，高压灭 菌后，冷却至50-60°C分别加入抗生素和生长促进剂。6种抗生素添加，培养基中抗生素的最终浓度分别为多粘菌素B :6· 7 X 10_3g/L ；甲氧苄氨嘧啶0· lg/L ；利福平0·lg/L;放线菌酮lg/L;头孢哌酮0·128g/L ；两性霉素B 0. 04g/L。弯曲菌生长促进剂丙酮酸钠、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁各称取5g，加入50ml蒸馏水充分溶解，用ο. 22μπι滤膜过滤备用，培养基中生长促进剂的最终浓度为0. 5g/L。配方一在CCDA培养基中添加多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢 哌酮和两性霉素B6种抗生素和生长促进剂配方二 普通固体CCDA培养基
配方三在CCDA培养基中添加多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮4种 抗生素配方四在CCDA培养基中添加多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢 哌酮和两性霉素B6种抗生素配方五在CCDA培养基中添加多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢 哌酮和两性霉素B6种抗生素、生长促进剂和10%鸡血清配方六在CCDA培养基中添加多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢 哌酮和两性霉素B6种抗生素、生长促进剂和10%绵羊全血三、食品样品中弯曲菌的直接计数与分离吸取样品处理液0. 1ml，均勻涂布于上述六种培养基中，晾干后，置2. 5L厌氧培养 罐中，加入微需氧产气袋后立即密封厌氧罐，以42°C培养箱中培养36h。结果如图1-图6所示，图1(含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢 哌酮和两性霉素B等6种抗生素和生长促进剂的固体CCDA培养基)分离食品中弯曲菌的效 果最好，杂菌生长数量很少、弯曲菌生长状态好、有利于计数和分离。而图2(不含抗生素和 生长促进剂)、图3 (含4种抗生素)生长杂菌数量多，无法对弯曲菌分离和计数；图4 (含6 种抗生素、不含生长促进剂)弯曲菌得到分离，但细菌生长状态差，难以计数、计数不准确； 图5(含6种抗生素、生长促进剂和10%鸡血清)、图6(含6种抗生素、生长促进剂和10% 绵羊全血)弯曲菌生长状态好，但杂菌多，也不利于直接对弯曲菌的计数和分离。用钼耳环挑取半透明、灰白或灰绿色、有金属光泽的小菌苔，再次接种于含抗生素 的CCDA平板，重复2-3次，直至得到单一纯培养菌落。分离株的进一步鉴定可采用国标方法和PCR方法。
权利要求
一种食品中弯曲菌的定量检测方法，其特征在于将样品在含抗生素和生长促进剂的固体CCDA培养基培养后直接进行弯曲菌的分离与计数；以上CCDA固体培养基中抗生素的含量为多粘菌素B6.7×10-3g/L；甲氧苄氨嘧啶0.1g/L；利福平0.1g/L；放线菌酮1g/L；头孢哌酮0.128g/L；两性霉素B0.04g/L；以上CCDA固体培养基中生长促进剂是丙酮酸钠、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁，生长促进剂的最终浓度为0.5g/L。
全文摘要
本发明涉及细菌分离技术，具体涉及一种特别是对食品中的弯曲菌(Campylobacter)的直接定量计数方法。该方法是将样品在含多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平、放线菌酮、头孢哌酮和两性霉素B6种抗生素和生长促进剂的固体CCDA培养基培养后直接进行弯曲菌的计数与分离。本发明较经典方法的细菌培养、分离和鉴定方法简便、特异、准确。
文档编号C12Q1/06GK101824462SQ20101018051
公开日2010年9月8日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者孙林, 张弓, 潘志明, 焦新安, 翟伟华, 黄金林 申请人:扬州大学