专利名称：德国镜鲤抗逆基因标记及其核心选育群体构建方法
技术领域：
本发明涉及鱼类抗逆基因标记及其核心选育群体构建方法。
背景技术：
德国镜鲤原种于1984年由原联邦德国引进，该鱼是欧洲地区池塘的主要养殖品 种，特点是人工驯养程度高、生长快、饲料转化率高。但它不适应我国的高密度肥水养殖条 件，抗逆能力低。在农业部和国家经委的资助下黑龙江水产研究所对其进行了系统选育，到 1995年选育到第4代的选育系通过了鉴定，抗逆能力有了一定的提高，生长速度比原种快 25%。德国镜鲤选育系由全国水产原良种审定委员会审定为适宜在全国推广的良种。目前， 德国镜鲤选育系作为一个重要鲤鱼养殖品种，具有体型好、肉味鲜美、含肉率高、食性杂、耐 低温、易捕捞、生长快(较普通鲤鱼快20%-30%)等优点，在我国许多养殖池塘，特别是在北方 地区该鱼深受养殖者和消费者喜爱，其养殖产量和经济效益逐年增加。然而，与我国土著 鲤鱼相比，其抗逆能力仍然较差，尤其是随着近几年养殖环境的恶化和高密度养殖需求，自 2000年以来德国镜鲤选育系在高密度网箱养殖的高温季节患病，并发生大规模的死亡事件 (死亡率高达90%)，而土著鲤鱼未受影响，德国镜鲤养殖业受到了巨大的经济损失，严重影 响了德国镜鲤产业的健康、稳定和可持续性发展。目前，未见有关德国镜鲤抗逆相关基因标 记的报道，也未见有关鱼类抗逆优良品种培育的报道。
发明内容
本发明提供了德国镜鲤抗逆基因标记及其核心选育群体构建方法。本发明德国镜鲤抗逆基因标记序列为MHC class I的HLJI-9扩增序列和MHC class IIB 的 HLJB 扩增序列，其中 MHC class I 的 HLJI-9 扩增序列为 5，-TGATGGCACCAAG GAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCTCCCTCACCTGGACTGCTGCC AATCCTCAAGCTGTCATTACCA-3，，第 28 个碱基 T 为抗逆基因位点；MHC class IIB 的 HLJB 扩 增序列为 5，-TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGACTGGGGTAAGATGAGACAC GCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATATGACATACTCCACAGATCC GTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGGGAATCATTATTGCAGCTG CTGGACTCATTTACA-3’，第214个碱基G为抗逆基因位点。本发明德国镜鲤核心选育群体构建方法如将要进行选育的德国镜鲤亲鱼群体应 用电子标记进行标记，结合已筛选两个抗逆相关基因位点，根据已经选择具有抗逆位点的 两对引物进行扩增、测序和抗逆位点碱基分析，将只在抗逆性差群体中出现的碱基做为抗 逆相关基因标记，剔除携带这些抗逆基因标记的个体，不携带这些基因标记个体形成核心 选育群体。本发明通过德国镜鲤抗逆基因标记，建立了德国镜鲤抗逆核心选育群体，本发明 针对性强，不受机体生长发育阶段和环境条件的影响，构建核心选育群体选择准确，能加速 育种进程，提高育种效率，从而有效的解决德国镜鲤高温季节患病导致大规模死亡的问题。本发明为鱼类抗逆分子育种选育开辟了一条分子育种技术途径，对鱼类抗逆品种培育具有 重要的意义和价值。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式德国镜鲤抗逆基因标记序列为MHC class I的 HLJI-9扩增序列和MHC class IIB的HLJB扩增序列，其中MHC class I的HLJI-9扩增序 列为 5，-TGATGGCACCAAGGAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCT CCCTCACCTGGACTGCTGCCAATCCTCAAGCTGTCATTACCA-3，，第 28 个碱基 T 为抗逆基因位点；MHC class IIB 的 HLJB 扩增序列为 5，-TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGAC TGGGGTAAGATGAGACACGCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATAT GACATACTCCACAGATCCGTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGG GAATCATTATTGCAGCTGCTGGACTCATTTACA-3'，第 214 个碱基 G 为抗逆基因位点。本实施方式中德国镜鲤抗逆基因标记序列通过如下方法获得的一、德国镜鲤抗 逆性强和抗逆性差群体样品的获得在高密度网箱养殖的德国镜鲤，在高温季节，开始发生 大规模的死亡事件，采集死亡个体鳍条作为抗逆性差的群体样品，待高温季节过后，采集存 活下来个体鳍条作为抗逆性强的群体样品，分别将抗逆性差的群体样品和抗逆性强的群体 样品保存于体积浓度为75%的酒精中；二、德国镜鲤MHC class I和MHC class IIB基因 遗传多态性根据其它亲缘关系相近鱼类的已知MHC class I和MHC class IIB基因外显 子和内含子的比对结果，应用oligo 6. O软件进行引物设计，其中G+C含量一般为40-60%， 尽量避免引物二级结构或二级结构控制在3个连续碱基以内以免形成引物二聚体，对于保 守性相对较低的序列，设计兼并引物；而后再对设计的引物进行筛选，其中引物筛选方法 为PCR扩增反应体系为 15 μ L :10 χ PCR buffer 1. 5 μ L, IOmM dNTP 0. 3 μ L, TaqDNA 聚 合酶0.6U，基因组DNA模板为50ng，上下游引物浓度各0. 15 μ M，灭菌双蒸水补足体积，基 因组DNA模板先采用5个个体的混合物，初步筛选的引物再经过10个个体进行验证；初步 筛选出5对扩增效果较好的引物，经验证后，3对引物能扩增出稳定、清晰的谱带；步骤二 中引物HLJI-9针对的是外显子3序列，引物HLJB针对的是外显子3至外显子4位点，引 物HLJB5针对的是外显子3序列。分别提取德国镜鲤MHC class I和MHC class IIB的 基因组DNA，而后分别进行PCR扩增，然后用电泳检测，将目的条带回收、二次扩增，扩增产 物由上海生物工程有限公司直接进行测序，测得到的序列SNP信息直接由软件Mutation Surveyor读取，每个SNP位点等位基因频率、观测和期望杂合度、Hardy-Weinberg平衡和 连锁不平衡由软件POPGENE version 1. 32进行统计，序列之间的比对应用软件Clustal W，其中，在HLJI-9位点，共鉴定出基因频率为1. 89%-41. 51%的10个不同基因型，其中在 外显子3序列上第66(A/C)、67 (T/G)、72 (Α/Τ)和102 (T/C)碱基位点上存在多态性并 均能改变所编码的氨基酸，观测杂合度为0. 0377-0. 3774，平均为0. 1745，所有位点均处于 Hardy-Weinberg平衡下，在第66和72碱基之间存在连锁不平衡情况(P<0. 05)；在HLJB 位点，经比对，与cyca-DAB3*01/ cyca_DAB4*01基因相似度为87. 33%_91· 33%，共鉴定出 基因频率为2. 94%-11. 76%的28个不同基因型，内含子序列长度为85_87bp，外显子3序列中第 350 (T/C)、374 (T/C)和外显子 4 第 36 (G/T)、71 (C/T)、74 (C/T)、75 (T/ G)碱基位点上存在多态性，两个位点能改变所编码的氨基酸，外显子序列观测杂合度为 0. 1176-0. 4706，平均为0. 3480，所有位点均处于Hardy-Weinberg平衡下；在外显子4第 71和74碱基之间存在连锁不平衡情况(P<0. 05)；在HLJB5位点，扩增序列可分为两个基 因座，第一个共鉴定出基因频率为3. 85%-26. 92%的9个不同基因型，其中在外显子序列上 第93 (T/G)、104 (G/A)、170 (G/A)、195 (G/C)、197 (G/C)碱基位点上存在多态性，其中 3个位点并均能改变所编码的氨基酸，观测杂合度为0. 0000-0. 6154，平均为0. 2308，在位 点97和197存在Hardy-Weinberg不平衡(P<0. 001)；在第195和197碱基之间存在连锁 不平衡情况(P<0. 05)；在HLJB5位点，第二个基因座共鉴定出基因频率为3. 85%_23. 08%的 11个不同基因型，其中在外显子序列上第125 (A/T)、127 (A/G)、139 (G/C)、176 (A/ T)、180 (C/T)、198 (A/G)碱基位点上存在多态性，其中6个位点能改变所编码的氨基 酸，观测杂合度为0. 0769-0. 8462，平均为0. 3333 ；位点180处于Hardy-Weinberg不平衡； 在第125和176碱基之间存在连锁不平衡情况(P<0. 05)；三、德国镜鲤抗逆相关基因标记 的筛选根据各多态碱基在抗逆性差和抗逆性强的个体中的分布，应用SPSS 13. 0软件进 行各多态位点抗逆关联性分析，经分析，在MHC class I序列外显子3第72碱基，经卡方 检验，A/T碱基在抗逆性强和抗逆性差个体中分布差异显著(Pearson c2=4. 046, df =1， P=O. 044)，T碱基在抗逆性强个体中出现频率为28%，在抗逆性差个体中出现频率为64. 3%， 在MHC class IIB序列外显子4第75碱基位点，经卡方检验，T/G碱基在抗逆性强和抗逆 性差个体中分布差异显著(Pearson c2=20. 526, df =1，P=O. 000)，G碱基在抗逆性强个体 中出现频率为0. 0%，在死亡个体中出现频率为71. 4%，从而获得了抗逆相关基因标记序列， 并确定了抗逆基因位点，其中步骤二中德国镜鲤MHC class I基因的PCR引物HLJI-9 上游 引物 5，-TGTTCACTCAGTCCAGCAGA-3，，下游引物 5，-TTGGTAATGACAGCTTGAGG-3，，PCR 反应条 件95°C变性5min，95°C变性30 s、58. 2°C退火30s、72°C延伸30s、共25个循环，再72°C延 伸5min，4°C保温；德国镜鲤MHC class IIB基因的PCR引物为HLJB与HLJB5，HLJB上游引 物 5，-CACTCT/AGAGCTGGAGTACAC-3，，下游引物为 5，-GTAAATGAGTCCAGCAGCTG-3，，PCR 反应 条件95°C变性5min，95°C变性30 s、56. 0°C退火30s、72°C延伸30s、共25个循环，再72°C 延伸 5min，4°C 保温，HLJB5 上游引物 5，- A/GTTAC/AA/GCTCAGG/TTC/TAGC/TGAG/AG-3，， HLJB5 下游引物 5，- TCTTCTCTCCAGATTTGGGGG-3，，PCR 反应条件95°C变性 5min，95°C变性 30 S、59. 5°C退火30s、72°C延伸30s、共25个循环，再72°C延伸5min，4°C保温；步骤二中 提取DNA的方法为分别将德国镜鲤采集鳍条从酒精中取出，用蒸馏水洗净、剪碎，在消化 液(10mmol/L Tris-HCl ρΗ 8. 0，100mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，0. 5% SDS , 100yg/mL 蛋白 酶K)中55 °C彻底消化，再分别用饱和酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提除蛋白、透析、乙醇 沉淀，然后溶解于1/10TE中，并将其浓度调至50 ng/yL，-20°C保存备用；步骤二中的鲤鱼 MHC class I和MHC class IIB基因已经得到克隆。 对步骤三进行验证对经过抗逆性死亡而存活下来个体进行了特定碱基检测分 析，在MHC class I基因中，在30个个体群体中，T碱基出现频率为0% ；在500个个体群体 中，T碱基出现频率39. 6%。在MHC class II基因中，在30个个体群体中，G碱基出现频率 为2. 8% ；在500个个体群体中，G碱基出现频率2. 9%。这两种碱基在存活个体中出现几率 均较低，与筛选结果一致，验证了与抗逆的相关性。
具体实施方式
二 本实施方式德国镜鲤核心选育群体构建方法如将要进行选育 的德国镜鲤亲鱼群体应用电子标记进行标记，结合已筛选两个抗逆相关基因位点，根据已 经选择具有抗逆位点的两对引物进行扩增、测序和抗逆位点碱基分析，将只在抗逆性差群 体中出现的碱基做为抗逆相关基因标记，剔除携带这些抗逆基因标记的个体，不携带这些 基因标记个体形成核心选育群体。本实施方式所述的德国镜鲤抗逆基因标记序列为MHC class I的HLJI-9扩增序 列和MHC class IIB的HLJB扩增序列，其中MHC class I的HLJI-9扩增序列为5’ -TGATG GCACCAAGGAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCTCCCTCACCTGGA CTGCTGCCAATCCTCAAGCTGTCATTACCA-3，，第 28 个碱基 T 为抗逆基因位点；MHC class IIB 的 HLJB 扩增序列为 5，-TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGACTGGGGTAAGAT GAGACACGCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATATGACATACTCCA CAGATCCGTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGGGAATCATTATT GCAGCTGCTGGACTCATTTACA-3'，第214个碱基G为抗逆基因位点。本实施方式通过德国镜鲤抗逆基因标记，建立了德国镜鲤抗逆核心选育群体，本 发明针对性强，不受机体生长发育阶段和环境条件的影响，构建核心选育群体选择准确，能 加速育种进程，提高育种效率，从而有效的解决德国镜鲤高温季节患病导致大规模死亡的 问题。本实施方式为鱼类抗逆分子育种选育开辟了一条分子育种技术途径，对鱼类抗逆品 种培育具有重要的意义和价值。
权利要求
德国镜鲤抗逆基因标记，其特征在于德国镜鲤抗逆基因标记序列为MHC class I 的HLJI 9扩增序列和MHC class IIB的HLJB扩增序列，其中MHC class I 的HLJI 9扩增序列为5' TGATGGCACCAAGGAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCTCCCTCACCTGGACTGCTGCCAATCCTCAAGCTGTCATTACCA 3'，第28个碱基T为抗逆基因位点；MHC class IIB的HLJB扩增序列为5' TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGACTGGGGTAAGATGAGACACGCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATATGACATACTCCACAGATCCGTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGGGAATCATTATTGCAGCTGCTGGACTCATTTACA 3'，第214个碱基G为抗逆基因位点。
2.德国镜鲤核心选育群体构建方法，其特征在于德国镜鲤核心选育群体构建方法如 下将要进行选育的德国镜鲤亲鱼群体应用电子标记进行标记，结合已筛选两个抗逆相关 基因位点，根据已经选择具有抗逆位点的两对引物进行扩增、测序和抗逆位点碱基分析，将 只在抗逆性差群体中出现的碱基做为抗逆相关基因标记，剔除携带这些抗逆基因标记的个 体，不携带这些基因标记个体形成核心选育群体。
全文摘要
德国镜鲤抗逆基因标记及其核心选育群体构建方法。本发明提供了德国镜鲤抗逆基因标记及其核心选育群体构建方法。德国镜鲤抗逆基因标记序列为MHCclassI的HLJI-9扩增序列和MHCclassIIB的HLJB扩增序列；方法如下采用基因标记和电子标记相结合的方法，将选育群体进行电子标记，根据基因标记检测结果，将只在抗逆性差群体中出现的碱基做为抗逆相关基因标记，筛选不携带这些抗逆基因标记的个体，构建核心选育群体。本发明构建的核心选育群体能够解决德国镜鲤高密度网箱养殖高温季节患病导致大规模死亡的问题，本发明对鱼类抗逆品种培育具有重要的意义和价值。
文档编号C12N15/11GK101892319SQ201010248328
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者李池陶, 石连玉, 贾智英 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所