专利名称：用于筛选具有优良精液品质的鸡的SPAG6基因SNPs位点、其单倍型组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业养殖动物分子标记辅助育种技术领域。具体涉及与鸡精液品质密切相关的位于SPAG6基因上的5个新的SNP标记SPAG6_SNP1_5及一种具有优良精液品质的SPAG6_SNPl-5位点的单倍型组合。本发明还包括检测SPAG6_SNP1_5位点基因型及其单倍型组合的引物、包含该引物的组合物及一种利用上述引物或引物组合物和单倍型组合筛选具有优良精液品质的鸡的方法。
背景技术：
精液品质是一个综合性状，其质量不仅反应了雄性动物的生殖状况，而且关系到精子的受精能力。在畜禽生产中，精液量、精子活力、精子活率和精子畸形率是评价精液品质的常规指标。精液量的多少不仅与雄性生育能力有一定的关系，而且直接影响到配种比例，是衡量精液品质最基本的指标之一。精子活力是评价精子运动能力的主要指标，精子的运动能力是保证精子能够与卵子相遇并完成对卵膜的机械性穿透作用的前提，精液中只有快速运动的群体才能与卵细胞结合完成受精过程，因此正确分析精子活力具有重要意义。 精子活率是指活精子数占总精子数的比率。只有活精子的细胞质膜是完整的，具有自身体积调节的能力，因此能够反映精子质膜的完整性的精子活率是评价精液品质的一项重要指标。精子形态学检查的目的是检测精子在睾丸中是否发育正常以及是否已在附睾中充分成熟。形态异常的精子(畸形精子)无法正常受精或者是产生的后代容易发生畸形，自然当形态异常的发生率增高时，受精率会降低。精液品质性状为可遗传的数量性状，在不同的品种、品系甚至家系内精液质量都存在差异。数量遗传学理论认为，数量性状在不同的品种品系内的差异可能是由于影响性状的微效多基因的基因频率或基因型频率的差异造成的。因此，可以通过引入外源基因或转基因等技术，改变影响精液品质性状的基因频率或基因型频率，对精液品质进行改良。受精是指从精子和卵子相互结合为发育做准备的一个过程。为了启动受精，雄性动物的精子细胞需要靠鞭毛产生一种推动力使之达输卵管处的受精部位，并穿过卵子的层层阻碍。所有的鞭毛都含有轴丝，它是结构元件和肌动蛋白的重要组成部分，肌动蛋白主要起协调和调整的作用并以波的形式产生推动力。轴丝是由一对中心微管(中心器)组成，中心器是由9个双联体微管和动力臂组成。在ATP的启动下，鞭毛轴丝中的双联微管通过微管间的不断地脱离和依附产生一个纵向力，与双联微管有关的各种附属结构使由支臂产生的纵向力转化为横向弯曲动力，使精子呈波浪式前进。纤毛和鞭毛的基本轴丝其结构在不同的物种间是保守的。衣虫滴目绿藻的遗传学研究发现了与鞭毛组成结构、轴丝结构稳定性及活动力相关的几个重要基因，其中的滴虫目PF16基因沉默将导致鞭毛瘫痪，同时，pfl6 突变体的鞭毛都被去膜形成轴丝，微管变得不稳定且和微管相连的多肽发生丢失(Smith E， Lefebvre P.Pf16 encodes a protein with armadillo repeatsand localizes to a single microtubule of the central apparatus in chlamydomonas flagella. Journalof Cell Biology, 1998,132 (3) :359-362)。2002 年，Sapiro 克隆了人和鼠科的直系同源基因PF16，其表达产物命名为精子相关抗原6 (Sperm associated antigen 6，SPAG6)。研究发现哺乳动物和藻类蛋白的氨基酸序列高度保守，都含有8个犰狳重复序列，这8个重复序列为微管上的PF16蛋白组装和维持鞭毛功能所必须的(Neilson L,SchneiderP,Van Deerlin P, Kiriakidou Μ,Driscoll D,Pellegrini Μ. cDNA cloning and characterization of a human spermantigen(spag6)with homology to the product of the chlamydomonas pf16 locus. Genomics, 1999,60 (3) =272-280)。为了确定Spag6蛋白是否在哺乳动物的轴丝中发挥重要作用，Sapiro使用基因敲出技术使小鼠的Spag6蛋白失活。研究发现，缺乏Spag6 蛋白雄性小鼠是不育的，因为他们的精子活动力显著不足，且常常出现断头或断尾的现象。 近50%的突变雌雄小鼠患有脑积水，症状为头部膨大，身驱变小和早期死亡，推测室管膜的纤毛功能异常导致脑脊髓液循环被破坏。缺乏Spag6蛋白的小鼠，由于中心粒微管的不稳定直接导致精子结构的破坏，精子头部易断，同时也使外周致密纤维和外周微管偶联体破坏。表明Spag6在精子从睾丸中释放出来后对维持中心器的结构起着重要作用，而中心器的稳定性对精子鞭毛结构的完整性是必须的。Sapiro研究认为Spag6蛋白通过维持中心粒的结构维持着精子鞭毛完整的结构，它的作用相当于精子鞭毛的支架蛋白，脑积水的发生也有力的证明了 Spag6影响室管膜纤毛的活动力，因此Spag6蛋白是精子鞭毛的活动的重要蛋白(Sapiro R，Kostetskii I，Olds-Clarke P，Gerton G，Radice G，Strauss Iii J. Maleinfertility, impaired sperm motility, and hydrocephalus in mice deficient in sperm-associated antigen 6. Molecularand cellular biology，2002，22(17) :6298)。 2005年，Horowitz对人小鼠和鸡的SPAG6、PF6、PF20基因序列进行比较分析，研究发现轴丝中心器SPAG6基因与PF6、PF20基因一样，都缺乏TATA盒子，也缺少精子细胞发生相关基因结合的结构域，但这些基因表达产物对维持正常的精子活动和精子的发生是必须的 (HorowitzE，Zhang Ζ,Jones B，Moss S，Ho C,Wood J. Patterns of expression of sperm flagella genes :Early expression ofgenes encoding axonemal proteins during the spermatogenic cycle and shared features of promoters of genesencoding central apparatus proteins. Molecular human reproduction，2005，11 (4) :307-312)。以上石if究表明，SPAG6蛋白在精子的生物学功能上起重要作用。 随着分子数量遗传学的发展，关联分析成为研究功能候选基因的一种可靠方法， 即利用候选基因多态性与能够说明某一性状的指标建立相关模型进行统计分析，从而找到显著影响某一性状的分子标记。因此，进一步研究SPAG6基因SNP标记与鸡精液品质的关系，确定SPAG6基因优良精液品质的单倍型组合。
发明内容
本发明包括与鸡精液品质密切相关的5个位于SPAG6基因上的新的SNP标记，如 SEQ ID NO 1 所示，分别是SPAG6_SNP1 为第 20352 位的 A/G 突变、SPAG6_SNP2 为第 20426 位的T/C突变、SPAG6_SNP3为第20496位的T/C突变、SPAG6_SNP4为第20568位的C/T突变、SPAG6_SNP5为第20586位的G/A突变。同时还包括一种检测SPAG6_SNP1_5位点上基因型的一对引物SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3及包含该引物的组合物。SPAG6_SNP1_5为首次在北京油鸡中得到，为鸡的标记辅助选择提供了新的分子标记。
本发明的第二个目的在于提供一种SPAG6_SNP1_5位点的单倍型组合GCTCA/ GCCCA，该单倍型组合个体在精液量、精子畸形率和精子活率方面显著优于其它组合。本发明的第三个目的在于提供了一种利用SPAG6基因筛选具有优良精液品质的鸡的方法。该方法包括获得来自鸡的DNA ；检测SPAG6_SNPl-5位点的单倍型组合；选择单倍型组合GCTCA/GCCCA的个体。其中检测SPAG6_SNP1_5位点的单倍型组合的可以通过利用上述引物或检测试剂盒，PCR-直接测序法检测SPAG6_SNPl-5位点上基因型；用PHASE程序由SPAG6_SNPl-5位点的基因型计算出单倍型。本发明通过以下技术方案实施一、与鸡精液品质密切相关的5个位于SPAG6基因上的新的SNP标记，分别是 SPAG6_SNP1 为第 20352 位的 A/G 突变、SPAG6_SNP2 为第 20似6 位的 T/C 突变、SPAG6_SNP3 为第 20496 位的 T/C 突变、SPAG6_SNP4 为第 20568 位的 C/T 突变、SPAG6_SNP5 为第 20586 位的G/A突变。二、一种检测SPAG6_SNPl-5位点上基因型的一对引物SEQ ID NO :2和SEQ ID NO: 3及包含该引物的组合物。该组合物可以是包括该引物的PCR反应组合物0. 5ml 2XTaq PCR Master Mix(0. IU TaqPolymerase/μ 1,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl(ρΗ8. 3), IOOmM KCL, 3mM MgCl2) ； IOmM 的 SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3 上下游引物各 0. Iml ；0. 28ml 纯水。该组合物为100只鸡的检测量，保存温度为-20°C。三、一种SPAG6_SNPl-5位点的单倍型组合GCTCA/GCCCA，该单倍型组合个体在精液量、精子畸形率和精子活率方面显著优于其它组合。四、一种利用SPAG6基因筛选具有优良精液品质的鸡的方法。该方法包括获得来自鸡的DNA ；检测SPAG6_SNPl-5位点的单倍型组合；选择SPAG6_SNP1_5位点的单倍型组合为GCTCA/GCCCA的个体。其中检测SPAG6_SNP1_5位点的单倍型组合的可以通过利用上述引物或含有该引物的组合物，PCR-直接测序法检测SPAG6_SNPl-5位点上基因型；用PHASE 程序由SPAG6_SNPl-5位点的基因型计算出单倍型。具体技术方案如下采取高盐法提取鸡外周血细胞的基因组DNA，包括消化、盐析、冰析、洗涤、溶解、保存；以SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3为上下游引物，提取的DNA为模版，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增50 μ 1 反应体系:25μ 1 2 X Taq PCR Master Mix (0. IU Taq Polymerase/μ 1,500 μ M dNTPeach, 20mM Tris-HCl (ρΗ8. 3), IOOmM KCL, 3mM MgCl2) ；IOmM 的上下游引物各 5 μ 1 ;1 μ 1 基因组 DNA及14 μ 1纯水。扩增条件95°C变性5min ；95°C变性30s，57 65°C退火30s，72°C延伸 30s，共35个循环；72°C再延伸lOmin。PCR产物测序分析，记录所有个体的SPAG6_SNP1_5 位点的基因型，输入PHASE程序，可以计算得到个体的单倍型，选择单倍型组合为GCTCA/ GCCCA的个体。
图1为鸡SPAG6基因SPAG6_SNP1_5位点2种纯合基因型测序图
具体实施例方式下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照[美]J.萨姆布鲁克和D. W.拉塞尔(J.萨姆布鲁克和D. W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)，北京科学出版社，2002年)。实施例1 鸡精液品质密切相关的SPAG6_SNPl-5标记的鉴定及检测SPAG6_SNP1_5 位点上基因型的引物和含有该引物的组合物1、试验数据采集选用了饲养在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的390只北京油鸡公鸡。所有试验鸡只来自同批孵化、在相同条件下饲养的鸡群。公鸡饲养至43周龄时，由一名实验员采用腹部按摩法采集精液，集精杯收集，立即进行精液量、精子活力、精子活率和精子畸形率的测定。2、提取以上群体中个体的基因组DNA采取高盐法提取鸡外周血细胞的基因组DNA。(1)消化向2ml离心管中加入30 μ 1鸡抗凝血，然后加入600 μ 1裂解液(50mM Tris-Cl-IOmM EDTA，Ph8. 0)混合，加入蛋白酶 K 30 μ 1 (10 μ g/μ 1)混勻，置于 56°C 水浴锅消化12h，至溶液澄清。(2)盐析向消化液中加入600 μ 1饱和NaCL (6M)，600 μ 1氯仿，充分摇勻lOmin，选用12000rpm离心速度离心5min，离心后溶液分为两层。(3)冰析取上清液于新2ml离心管中，加等体积(约600 μ 1)提前冰浴的90%乙
醇混勻，轻轻晃动有白色沉淀析出。(4)洗涤用枪头挑出白色沉淀，加入600μ170%乙醇清洗后，倒掉乙醇，自然干
O(5)溶解待乙醇完全挥发后，加入500 μ lddH20。(6)保存盖上管盖，56°C放置2h后放入_4°C冰箱。2、PCR 扩增以SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3为上下游引物，以上群体的DNA为模版，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增50μ 1反应体系25μ 1 2XTaq PCR Master Mix(0. IU Taq Polymerase/μ 1,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl(ρΗ8. 3),IOOmM KCL,3mM MgCl2) ；IOmM 的上下游引物各5μ 1 ；1μ 1基因组DNA及14 μ 1纯水。扩增条件95°C变性5min ；95°C变性308，57 651退火308，721延伸308，共；35个循环；72°C再延伸lOmin。PCR产物测序分析(见图1)，发现SPAG6上存在5个SNP标记，分别是:SPAG6_SNP1为第20352位的A/G 突变、SPAG6_SNP2 为第 20426 位的 T/C 突变、SPAG6_SNP3 为第 20496 位的 T/C 突变、SPAG6_ SNP4为第20568位的C/T突变、SPAG6_SNP5为第20586位的G/A突变。并记录所有个体的 SPAG6_SNPl-5位点的基因型。3、单个SNP位点与精液品质的关联性分析对SPAG6_SNP1_5位点的不同基因型与精液品质性状进行最小二乘分析，确定了 SPAG6_SNPl-5为与精液品质相关的5个SNP标记。单位点基因型与精液品质相关性状关联分析表明(表1) :SPAG6_SNP1 (SPAG6_ SNP2)位点多态性与精子畸形率显著相关；SPAG6_SNP3位点CC基因型个体的精子畸形率显著低于TT和CT基因型个体(P < 0. 05)，但精子活率和精子活力显著低于杂合子CT基因型个体(P < 0. 05)；在SPAG6_SNP4(SPAG6_SNP5)位点，CC(AA)型个体精子活力显著高于 TT(GG)基因型个体(P < 0. 05)，且精子畸形率显著低于TT(GG)基因型个体(P < 0. 05)。
因此，本实施例鉴定了与精液品质相关的5个SNP标记SPAG6_SNP1_5，并提供了检测标记位点基因型的引物及组合物。实施例2 具有优良精液品质的SPAG6_SNP1_5位点的单倍型组合的鉴定1、单倍型构建将经过以上PCR-直接测序法得到的所有的个体的SPAG6_SNP1_5位点的基因型数据输入PHASE程序，可以计算得到各个体的单倍型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度，用标准化的连锁不平衡系数D’表示。SPAG6_SNPl-5位点SPAG6基因5个位点的配对连锁不平衡分析结果见表2。分析结果显示，SPAG6_SNP1与SPAG6_SNP2、SPAG6_SNP4与SPAG6_SNP5碱基位点间连锁不平衡系数D’为1，为完全连锁不平衡；SPAG6_SNP1 (或SPAG6_SNP2)与SPAG6_SNP3碱基位点间处于连锁不稳定状态，标准化连锁不平衡系数D’为-0. 35 ；SPAG6_SNP1 (或SPAG6_SNP2)与 SPAG6_SNP4 (或 SPAG6_SNP5)碱基位点间和 SPAG6_SNP3 与 SPAG6_SNP4 (或 SNP^ 碱基位点间存在较松散连锁不平衡，标准化连锁不平衡系数D’均小于0. 5。因此，在无其它因素影响时，这5个SNP位点理论上可以出现8种单倍型，36种单倍型组合，但在本试验的390只北京油鸡群体中只发现了 7种单倍型，分别为GCTCA，GCTTG, GCCTG, ATTCA, ATTTG, GCCCA和 ATCCA ；11 种单倍型组合，分别为GCTCA/GCTCA，GCTCA/GCTTG, GCTCA/GCCTG, GCTCA/ATTCA, GCTCA/ATTTG, GCTCA/GCCCA, GCTCA/ATCCA, GCTTG/GCTTG, ATTCA/ATTCA, GCCCA/GCCCA 和 GCCCA/GCCCA。2、单倍型组合与精液品质性状的关联分析经最小二乘分析，北京油鸡SPAG6基因不同单倍型组合与精液量、精子活率和精子畸形率等性状存在相关性(P <0.05)，但与精子活力性状间的相关性不显著 (P彡0. 05)。由表3可知，GCTCA/GCCCA单倍型组合个体精液量、精子活率性状的最小二乘均数最高(P < 0. 05)，精子畸形率的最小二乘均值与GCTCA/ATCCA单倍型组合差异不显著 (P彡0. 05)，但低于其它单倍型组合(P < 0. 05)，因此，在本试验群体中GCTCA/GCCCA单倍型组合最佳。因此，本实施例鉴定了一个具有优良精液品质的SPAG6_SNP1_5位点的单倍型组合GCTCA/GCCCA，该组合可以作为筛选标记用于筛选具有优良精液品质的鸡。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。表1北京油鸡SPAG6基因单个SNP位点不同基因型与精液品质相关性状关联分析
权利要求
1.与鸡精液品质密切相关的5个SNP标记SPAG6_SNPl-5，其特征在于位于SPAG6基因 (核苷酸位置编码基于GeneBank No. NC_006089. 2)上，SPAG6_SNP1为第20352位的A/G突变、SPAG6_SNP2 为第 20似6 位的 T/C 突变、SPAG6_SNP3 为第 20496 位的 T/C 突变、SPAG6_ SNP4为第20568位的C/T突变和SPAG6_SNP5为第20586位的G/A突变。其序列见序列表 SEQ ID NO :1，多态位点用η表示。
2.一种如权利要求1所述的SPAG6_SNPl-5位点的单倍型组合，其特征在于单倍型组合为GCTCA/GCCCA，包含该单倍型的个体精液量和精子活率最佳，精子畸形率最低。
3.一种检测如权力要求1所述的SPAG6_SNPl-5位点基因型的引物，其特征在于含有 SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的碱基序列。
4.一种检测SPAG6_SNPl-5位点基因型的组合物，其特征在于含有权利要求3所述的引物序列。
5.权利要求4所述的组合物，其特征在于由以下试剂组成，100只鸡的检测量，保存温度为-20°c，包括0.5ml 2XTaq PCR Master Mix(0. IU Taq Polymerase/μ 1,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl(pH8. 3),IOOmM KCL,3mM MgC12)；IOmM 的 SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 上下游引物各 0. Iml0. 28ml 纯水。
6.一种筛选具有优良精液品质的鸡的方法，其特征在于包括a)获得来自鸡的DNA。b)检测如权力要求1所述的SPAG6_SNPl-5位点的单倍型组合。c)选择具有如权力要求2所述的单倍型组合的个体。
7.权利要求6的方法，其中检测SPAG6_SNPl-5位点的单倍型是由SNP1-5位点的基因型计算出单倍型。
8.权利要求7的方法，其特征在于用PHASE程序由基因型计算出单倍型。
9.权利要求7的方法，其中SPAG6_SNPl-5位点的基因型是用PCR-直接测序法检测得到。
10.权利要求9的方法，其中PCR-直接测序法利用选自如权力要求4、5所述的组合物来进行PCR检测。
全文摘要
本发明包括与鸡精液品质密切相关的位于SPAG6基因上的5个新的SNP标记SPAG6_SNP1-5及一种具有优良精液品质的SPAG6_SNP1-5位点的单倍型组合。本发明还包括检测SPAG6_SNP1-5位点基因型及其单倍型组合的引物、包含该引物的组合物及一种利用上述引物或引物组合物和单倍型组合，筛选具有优良精液品质的鸡的方法。所述SPAG6_SNP1-5位点为鸡SPAG6基因第20352位、20426位、20496位、20568位和20586位碱基位点，所述单倍型组合为GCTCA/GCCCA，该单倍型组合个体在精液量、精子畸形率和精子活率方面最优。
文档编号C12N15/11GK102373198SQ201010264778
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘冉冉, 文杰, 胡娟, 赵桂苹, 郑麦青, 陈继兰 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所