专利名称：鸭源性冠状病毒ORF1a蛋白基因及其克隆方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla蛋白基 因及其克隆方法与应用。
背景技术：
1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第 一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其 形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和 核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表 株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊 膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的 一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该 病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如 大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界 的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。 1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100%，死亡率可达10 30%。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间 缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因。这使得IB对养 鸡业造成的威胁持续存在。而掌握流行毒株的生物学特性和流行特点是正确使用疫苗的前 提。2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB 疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达 20%以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个 1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成 大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿 大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”， 肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌 及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工 作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保 藏编号为CGMCC NO. 3842，其专利申请号为201010225577. 4，此为第一次有关家鸭感染IBV 的报道。IBV OREla蛋白基因编码IBV非结构蛋白，其相应表达的产物大小为440KD，根据 普遍存在于冠状病毒的核糖体移码规律，Ia与Ib蛋白基因共同表达一个约741KD的Ia Ib的融合多肽，后经细胞内蛋白酶裂解为相应功能的蛋白。ORFla蛋白基因包含一编码类 似细小病毒3C蛋白酶的功能域，后者参与病毒的复制，表明IBV ORFla蛋白具有RNA聚合 酶的活性，但是，尚未分离鉴定具有这一活性的蛋白。如果病毒ORFla蛋白的大小为440KD， 那么它的大小在同类酶中是罕见的，这可能反映了冠状病毒mRNA的合成具有更为复杂的 过程，对该蛋白基因开展研究对于揭示IBV病毒复制的机制具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是对鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla蛋白基因进行了 分析测序，并给出了克隆该ORFla蛋白基因的方法及其应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的ORFla蛋白基因， 其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的ORFla蛋白基因， 其特征在于，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的ORFla蛋白基因 的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以鸭源性冠状病毒ZZ2004株的同源序列为模 板设计出如下十二对引物片段位置(nt)长度(nt) 上游引物(nt)下游引物(nt)
Vl79 14021324CCTACAGCTGGTCCTCATAGTAGTACCTCTCGGTGCATTT
V21305 .23631059CTGGTTTTATGGGTGCTAAGGGACAATACCCAGATCTTCA
V32238 .34021165GCACTTGGTAGAGTTTCTGGTAAACTCGTCGACATCCTCT
V43061 ‘ 44621402ATTGTACACAAGGACGCTCTAGGCAACAAAGTCTGTAGGA
V54313 ‘53271015TGTACTTAAGTGGCGTGATGAGCACTACCTTCAACCCATA
V65262 .63381077GCACCAATTTACTACCCAGTGCTAACTTCATGCCTATTGC
V76293 ‘73291037TGAAGTGTGCAAGAGAGTTGTACCACTAATGACACCACCA
V87088 .89631876CTCGTGATAGAGGGTTTTTGCCTAGCCACAGTCCATTAAG
V98764 ‘98121049GGTTAGCTTATGCTTTGGACCCAAAACCAAGATGTAGCTC
VlO9621--10441821AGTGCTATAACGGGAGTTGACCTAAGCCATTAACCATGAC
Vll10252 11186935TTACTGCATACTCGGAAGGTCGCGTGTAGTGATGAAACTA
V1211100 120991000AGTCAGTAGACAGCGGAGAGGGTCACGAGTACCCTGATTA
2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株ORFla蛋白基因全长片段，PCR 的扩增条件 94°C，5min ；94°C lmin, 53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C
延伸10min，4°C结束反应；3)然后将ORFla蛋白基因片段分别与pMD18_T载体连接。所述鸭源性冠状病毒的ORFla蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗中的 应用，该ORFla蛋白基因片段可被克隆到质粒载体或真核表达载体上进一步研制出IBV核 酸疫苗及活载体疫苗对预防IBV将具有重要意义。所述鸭源性冠状病毒的ORFla蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的
4应用，该ORFla蛋白基因一旦被导入植物，并在植物中表达出活性蛋白，有望研制出转基因 植物可食疫苗，作为禽类饲料添加剂，家禽食用含有该种抗原的转基因植物，将激发肠道免 疫系统，从而产生对IBV的免疫能力。上述鸭源性冠状病毒(Avianinfectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已 于2010年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病 毒的保藏编号为CGMCC NO. 3842，其中国专利申请号为201010225577. 4。本发明具有积极有益的效果此前尚无有关家鸭感染IBV的报道，本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖 场，本病毒不仅可以引起鸡的大批发病及死亡，还可严重影响家鸭的生长发育，同时引起鸭 的感染和死亡；与其它禽类的冠状病毒相比，ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更 广；鉴于本病毒IBV ORFla蛋白具有RNA聚合酶的活性，同时本病毒的感染谱明显不同于其 它毒株，本发明对IBV ORFla蛋白基因所做的深入系统的研究，从分子水平上揭示了 IBV的 流行和变异机制，进而制备出IBV核酸疫苗、活载体疫苗及防治鸡传染性支气管炎药物，对 于预防和控制IB的发生与流行有着重要的意义。
图1为鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla蛋白基因的分段扩增结果之一，图中1， Marker DL2000 ；2，Vl ；3，V4 ；4，V8 ；5，V12 ；图2为鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla蛋白基因的分段扩增结果之二，图中1， V2 ；2，V3 ；3，V5 ；4，V6 ；5，V7 ；6，Marker DL2000 ；图3为鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla蛋白基因的分段扩增结果之三，图中1， Marker DL2000 ；2，V9 ；3，VlO ；4，Vll ；图4鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla基因推导的氨基酸序列同源性比对图谱(说 明书附图第2 18页为连续的图谱，即图4)；图5为鸭源性冠状病毒ZZ2004分离株与参考毒株ORFla蛋白系统进化树。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具 体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。实施例1 一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORFla基因的克隆方法(I)PCR引物设计选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以鸭源性冠状病毒ZZ2004株的同源序列为模板 设计出12对引物，见表1表IORFla蛋白基因扩增用引物
权利要求
一种鸭源性冠状病毒的ORF1a蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种鸭源性冠状病毒的ORFla蛋白基因，其特征在于，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3.一种鸭源性冠状病毒的ORFla蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤 1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以鸭源性冠状病毒ZZ2004株的同源序列为模板设计出如下十二对引物片段位置(nt)长度(nt)上游引物(nt)下游引物(nt)Vl79 14021324CCTACAGCTGGTCCTCATAGTAGTACCTCTCGGTGCATTTV21305--23631059CTGGTTTTATGGGTGCTAAGGGACAATACCCAGATCTTCAV32238--34021165GCACTTGGTAGAGTTTCTGGTAAACTCGTCGACATCCTCTV43061--44621402ATTGTACACAAGGACGCTCTAGGCAACAAAGTCTGTAGGAV54313--53271015TGTACTTAAGTGGCGTGATGAGCACTACCTTCAACCCATAV65262--63381077GCACCAATTTACTACCCAGTGCTAACTTCATGCCTATTGCV76293--73291037TGAAGTGTGCAAGAGAGTTGTACCACTAATGACACCACCAV87088--89631876CTCGTGATAGAGGGTTTTTGCCTAGCCACAGTCCATTAAGV98764--98121049GGTTAGCTTATGCTTTGGACCCAAAACCAAGATGTAGCTCVlO9621--10441821AGTGCTATAACGGGAGTTGACCTAAGCCATTAACCATGACVll10252 11186935TTACTGCATACTCGGAAGGTCGCGTGTAGTGATGAAACTAV1211100 120991000AGTCAGTAGACAGCGGAGAGGGTCACGAGTACCCTGATTA2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株ORFla蛋白基因全长片段， PCR 的扩增条件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C延 伸10min，4°C结束反应；3)然后将ORFla蛋白基因片段分别与pMDIS-T载体连接。
4.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的ORFla蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位 蛋白疫苗中的应用。
5.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的ORFla蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管 炎药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的ORF1a蛋白基因及其克隆方法与应用。该ORF1a蛋白基因序列11859bp，编码3952个氨基酸残基的ORF1a蛋白；通过随机PCR找到与其同源性较高的病毒序列，以该序列为模版设计12对特异性引物扩增出对应的片段，再将ORF1a蛋白基因片段分别与pMD18-T载体连接。鉴于IBV ORF1a蛋白具有RNA聚合酶的活性，同时本病毒的感染谱明显不同于其它毒株，所以对ORF1a蛋白基因的研究IBV，进而从分子水平上揭示IBV的流行和变异机制，研制出IBV核酸疫苗、活载体疫苗及防治鸡传染性支气管炎药物，对于预防和控制IB的发生与流行有着重要的意义。
文档编号C12N15/50GK101962648SQ20101026477
公开日2011年2月2日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘兴友, 刘金华, 姚四新, 王三虎, 王丽荣, 王宪文, 王自良, 王青, 赵坤, 赵淑秋 申请人:河南科技学院