苋色藜抗病性相关基因ChaNDR1a及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种苋色藜抗病性相关蛋白ChaNDR1a，其具有序列2所示的氨基酸序列。同时，本发明还公开了编码上述蛋白的DNA分子、含有上述DNA分子的重组表达载体以及表达上述DNA分子的宿主细胞。此外，本发明还公开了制备上述DNA分子的方法、特异性扩增上述DNA分子的引物以及上述DNA分子在提高植物抗病性中的应用。本发明在揭示了苋色藜ChaNDR1a基因具有抗病性特性的基础上，不仅为进一步揭示苋色藜高效、广谱的抗病性分子机制奠定了基础，也进一步提高了苋色藜作为广泛应用的枯斑寄主，在植物抗病性中的应用。
【专利说明】苋色藜抗病性相关基因ChaNDRIa及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及苋色藜抗病性相关基因ChaNDRla及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]1995年，Centry等人在研究拟南芥与丁香假单胞菌(Pst)之间的互作时，发现了一个可能涉及拟南芥抗病途径的基因，由于其具有非小种专化抗病性，故命名为((non-race-specific disease resistancel, NDR1)。
[0003]NDRl基因位于拟南芥第三条染色体上，限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)标记出其位于 g6220 与 g4711 之间的 8.5 厘摩(cM)(Century, 1995)。NDRl蛋白是一个质膜蛋白，它经历了几个翻译后修饰，包括羧基末端处理和氨基端糖基化(Century, 1997 ；Coppinger et al.，2004)。基因组DNA序列分析显示，NDRl含有一个单一的660个碱基对的开放阅读框(ORF) (Century, 1997)。
[0004]Coppinger等(2004)通过序列分析预测NDRl是一个C-末端糖基肌醇(GPI)锚定蛋白，并通过选择离子监测质谱法(SM-MS)得到验证。NDRl蛋白结构中的ω位点、断裂位点和疏水尾巴为GPI锚定蛋白的基本特点。 [0005]Kn印per等(2011)通过与哺乳动物整合素蛋白LEA14进行同源建模，预测了 NDRl蛋白的高级结构。对预测结果进行进一步分析发现该蛋白与涉及信号感知和先天免疫反应的哺乳动物整合素蛋白具有几个极其相似之处。进一步的模拟表明NDRl的主要核心结构与膜结合亚单位(即纤连蛋白域)FNIII具有很强的相似性，NDRl和整合的假定跨膜结构域都连接到一个大的单一 β -片上(Hynes, 2009)。根据相邻的三个氨基酸的α -螺旋结构,确定了在溶剂中暴露的氨基酸178至180位置存在的一个类似整合素蛋白Arg-Gly-Asp (RGD)的NGD结构域(Asn-Gly-Asp)。在宿主-真菌互作中，防御信号中的NGD域是一个潜在的配体结合位点，该位点涉及质膜细胞壁粘附(Manning et al.，2008 ；Dodds et al.，2009)。此外，据推测NGD位点也是病原菌效应蛋白和分泌系统的靶标和作用模式，大概是通过破坏细胞壁质膜粘着斑而方便病原体进入(Wang et al.，2009)。
[0006]通过突变实验表明，NDRl是一个重要的诱导防御反应的抗性基因，并具有非小种专化抗病性(Century，1995)。在过去的十多年中，通过阐明NDRl参与的遗传相互作用，发现NDRl参与了植物防御信号，并作为防御信号激活所需的核心元件，激活CC-NB-LRR类R蛋白(Aarts et al.，1998)。
[0007]拟南芥突变体ndrl-Ι植株中，由细菌引起的水杨酸(salicylic acid, SA)或通过UV-C光或缺氧产生的活性氧(reactive oxygen species,R0S)都被减弱了，并且在由细菌或ROS诱导的SAR也受损，但外源SA类似物BTH诱导的SAR不受影响。从而表明，NDRl在ROS的下游和SA的上游发挥功能(Shapiro, 2001)。
[0008]通过拟南芥突变体ndrl-Ι的感病性检测，NDRl对携带无毒基因avrB, avrRpml, avrRpt2和avrPph3中任何一个的丁香假单胞菌具有抗性(Century, 1995)。同时，NDRl基因的突变严重削弱了拟南芥在响应携带无毒基因avrRpt2的丁香假单胞菌时，HR和SAR的诱导能力，也降低了突变体植株PRl基因的表达水平(Shapiro，2001)。Coppinger等人通过研究转基因技术,在拟南芥的ndrl_l突变体中过量表达NDR1,可以增强拟南芥抵御一些细菌的能力，如番茄丁香假单胞菌，但对非细菌性病原菌的抗性增强不明显，如芜菁皱缩病毒和白粉病。
[0009]通过抗病基因工程来研究NDRl的功能也有所报道。窦道龙等(2003)通过构建植物高效表达载体PNDR，利用农杆菌介导法，将从拟南芥Wassilewskija生态型中克隆到的NDRl基因转化到烟草中。获得转基因烟草植株后，选取PCR阳性植株进行Southern杂交分析，结果证实NDRl基因已整合到受体基因组中。然后，利用离体叶片鉴定了 10株转基因烟草对赤星病和晚疫病的抗性，结果发现转基因烟草中有3株抗性显著提高(接种I周时，仅在叶片摩擦部位形成坏死)，而且表达该基因的烟草没有种属专一性。
[0010]人们从拟南芥中发现了 45个与NDRl和HINl (烟草中与NDRl序列相似的抗病基因)相关的基因，这些基因属于NHL(似NDR1/HIN1)大家族。这些基因不同程度地参与了植物防御途径，如NHLlO 在黄瓜花叶病毒引起的过敏反应中被诱导表达。
[0011]由此可见，NDRl基因确实参与了植物的抗病反应，而且与NDRl序列相似的基因也可能具有抗病性，这为广泛克隆并研究植物抗病基因奠定了基础。
[0012]近年来，人们对其它植物中的NDRl同源基因的抗病性也做了一定的研究。例如，Cacas等人从咖啡中克隆到了与拟南芥NDRl功能上同源的基因CaNDRla，将该基因在拟南芥ndrl-Ι突变体中过量表达,能恢复拟南芥对丁香假单胞菌的抗性(Cacas et al., 2011) ?同时，他们还通过瞬时表达系统，确定CaNDRla蛋白和拟南芥NDRl蛋白一样也通过C末端处理定位于质膜上，且与类似RIN4的蛋白互作，从而证明了 NDRl蛋白在咖啡和拟南芥之间的功能上和生化特性上的保守性。
[0013]Lu等(2013)克隆了柑橘中的NDRl同源基因，即CsNDRl，并证实过表达CsNDRl能弥补拟南芥突变体ndrl-Ι对丁香假单胞菌的抗性，也能增强对卵菌纲病原体Hyaloperonospora arabidopsidis的抗性。这种过表达与SA产物的增加和防御标记蛋白PATHOGENESIS RELATED I (PRl)的表达正相关，这说明CsNDRl的过表达可激活SA介导的防御信号，从而导致广谱抗病性的产生。此外，他们还发现，在感染与柑橘火龙病相关的细菌病原体Candidatus Liberibacter的柑橘中，能诱导温和的PRl的表达和SA的积累，从而进一步证实CsNDRl是拟南芥NDRl的一个功能性同源基因。
[0014]觅色藜(Chenopodium amaranticolor)是一年生觅科藜属的草本植物(2n = 6x, x=9),可与多种植物病毒发生超敏反应(hypersensitive response, HR),是广泛应用于植物病毒学研究中一种枯斑寄主。据统计，苋色藜与至少16个植物病毒属的多种病毒互作，诱发HR,例如,黄瓜花叶病毒、大S.花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯Y病毒等危害严重的植物病毒，表现显著的抗病毒特性。苋色藜在初始侵染叶片上产生局部枯斑，通过HR将初始侵染的病毒杀死，完全限制病毒的系统扩散。尽管苋色藜是植物病毒研究中广泛应用的枯斑寄主，但其高效、广谱的抗病性分子机制迄今尚未深入研究，严重限制了苋色藜在植物抗病性中的应用。
【发明内容】
[0015]针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种苋色藜抗病性相关蛋白ChaNDRla，其具有序列2所示的氨基酸序列。
[0016]本发明另一方面提供了编码上述蛋白的DNA分子。
[0017]在本发明优选的实施方案中，编码上述蛋白的DNA分子具有序列I所示的核苷酸序列。
[0018]本发明另一方面提供了含有上述DNA分子的重组表达载体。
[0019]在本发明优选的实施方案中，上述重组表达载体为pCAM-35S-GFP_ChaNDRla或pCAMBIA2300-ChaNDRlao
[0020]本发明另一方面提供了表达上述DNA分子的宿主细胞。
[0021]在本发明优选的实施方案中，上述宿主细胞为农杆菌，更加优选为农杆菌EHA105菌株或LBA4404菌株。
[0022]本发明另一方面提供了制备上述DNA分子的方法，其包括以下步骤:
[0023]1、提取苋色藜总RNA并合成cDNA ;
[0024]2、利用苋色藜转录组数据资源，设计特异性引用，通过RT-PCR，获得扩增产物，其中特异性引物优选具有序列3和序列4所示的核苷酸序列；
[0025]3、将扩增产物与T载体连接，优选PMD18-T载体，对扩增产物进行测序分析，获得所述DNA分子。
[0026]本发明另一方面提供了一种特异性扩增苋色藜抗病性相关基因ChaNDRla的引物，其具有序列3和序列4所示的核苷酸序列。
[0027]本发明再一方面提供了本发明上述DNA分子在提高植物抗病性中的应用。
[0028]在本发明优选的实施方案中，上述病原体为TMV或CMV。
[0029]本发明从广谱抗病性植物苋色藜中克隆了与拟南芥NDRl同源的基因，即ChaNDRla基因。同时，在明确了 ChaNDRla表达量分析和亚细胞定位的基础上，通过ELISA检测了转基因T1代烟草植株对病毒的抗性，揭示了苋色藜ChaNDRla基因具有抗病性的特性，不仅为进一步揭示苋色藜高效、广谱的抗病性分子机制奠定了基础，也进一步提高了作为广泛应用的枯斑寄主，苋色藜在植物抗病性中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1:觅色藜ChaNDRla蛋白与拟南芥NDRl蛋白序列比对图。
[0031]图2:苋色藜NDRla蛋白与其它植物NDRl蛋白之间的进化关系图。
[0032]图3:接种TMV和CMV后，0h、16h、40h、60h时，苋色藜ChaNDRla表达量变化图。
[0033]图4:接种TMV和CMV前后，苋色藜ChaNDRla亚细胞定位图。
[0034]图5:转苋色藜ChaNDRla基因的T1代转基因烟草的PCR检测图。
[0035]图6:接种TMV后，烟草中病毒增长情况柱状图。
【具体实施方式】
[0036]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。[0037]下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。
[0038]下面实施例中采用的酶与试剂，其具体来源为=T4DNA连接酶、限制性内切酶购自
New England Biolabs (NEB)公司；Taq 酶、基因克隆试剂盒In-Fusion”'HD Cloning Kit 购
自Takara公司；质粒提取试剂盒与DNA凝胶回收试剂盒为Axygen公司生产；辣根过氧化物酶标二抗与TMB底物显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；提取植物总RNA的TRIzol 购自 Invitrogen 公司；M_MLV Reverse Trascriptase 和 oligo (dT)购自 Promega
公司；SYBR? Select Mix (Applied Biosystems, P/N4472897);其它实验试剂均为进口或
国产分析纯。
[0039]下面实施例中采用的实验仪器分别为:PCR仪，BIO-RAD TlOOTMThermal cycler ；凝胶成像仪器，Bio-Rad公司；电泳仪，Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪，ABI7500Real TimeSystem。其它仪器包括:恒温摇床，恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培
养箱等。 [0040]实施例1:觅色藜ChaNDRla基因的克隆及ChaNDRla蛋白进化树的构建[0041 ] 1、苋色藜叶片总RNA的提取和cDNA的合成
[0042]参照Chomczynski 等(Chomczynski P, Sacchi N.Single-step method of RNAisolation by acid guanidinium thiocyanate-pheno1-chloroform extraction[J].Anal, bioche.，1987，162 (I): 156-159.)的方法，取 50 ~150mg 的苋色藜叶片在液氮中充分研磨，用 TRIzol Reagent (Invitrogen)提取总 RNA。根据 M-MLV ReverseTranscriptase (Promega)试剂盒方法,进行 cDNA 合成。
[0043]2、苋色藜ChaNDRla基因的克隆
[0044]利用已完成的觅色藜转录组数据资源(Zhang Y, Pei X，Zhang C，et al.Denovo foliar transcriptome of Chenopodium amaranticolor and analysis ofits gene expression during virus-1nduced hypersensitive response[J].PloSone, 2012,7(9): e45953.)，设计特异引物，具体克隆引物参见表1。
[0045]表1.本发明所用引物序列表
[0046]
【权利要求】
1.一种苋色藜抗病性相关蛋白ChaNDRla，其具有序列2所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其具有序列I所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其为重组表达载体 pCAM-35S-GFP-ChaNDRla 或 pCAMBIA2300_ChaNDRla。
6.表达权利要求2或3所述DNA分子的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其为农杆菌，优选为农杆菌EHA105菌株或LBA4404 菌株。
8.一种制备权利要求2或3所述DNA分子的方法，其包括以下步骤: (1)提取苋色藜总RNA并合成cDNA； (2)利用苋色藜转录组数据资源，设计特异性引用，通过RT-PCR，获得扩增产物，其中特异性引物优选具有序列3和序列4所示的核苷酸序列； (3)将扩增产物与T载体连接，优选pMD18-T载体，对扩增产物进行测序分析，获得所述DNA分子。
9.一种特异性扩增苋色藜抗病性相关基因ChaNDRla的引物，其具有序列3和序列4所示的核苷酸序列。
10.权利要求2或3所述的DNA分子在提高植物抗病性中的应用，其中病原体优选为TMV 或 CMV。
【文档编号】A01H5/00GK103980356SQ201410255165
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】张永强, 李为民, 张超, 龚前园 申请人:中国农业科学院生物技术研究所