专利名称：添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法
技术领域：
本发明属于有机酸生产技术领域，涉及一种添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和 生产强度的方法。
背景技术：
丁二酸，俗称琥珀酸，作为一种常见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物 中，许多厌氧微生物以丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化 合物，丁二酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物前体，如可作为1， 4_ 丁二醇、四氢呋喃、脂肪酸、Y-丁内酯等的中间物，而这些化学制品都具有很大的市场 潜力。利用生物法转化可再生资源生产丁二酸，成本低，污染小，环境友好，且在发酵过 程中可吸收大量的CO2用于菌株的代谢，能够有效减轻温室效应，这也是丁二酸生产有别于 传统有机酸生产的一个重要特点。生物法生产丁二酸的主要原料是葡萄糖和木糖等糖类物 质，其来源广泛且价格低廉(玉米、废乳清、工业生产废料等)，可以减少石油、煤等不可再 生资源的消耗，大大缓解现今社会的能源短缺。美国能源部的报告表明，丁二酸的生物生产 法的应用每年将为全世界节约大约1. 034X1016J的能源。另外，生物法制备丁二酸的过程 中，吸收并固定大量的CO2温室气体，能够减少温室气体的排放，缓解由温室效应所导致的 全球气候变暖的现状。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1 公开了丁二酸生产 菌及其发酵方法，这些生产菌株大多是从瘤胃、狗的口腔等特征性厌氧环境中筛选出来的， 在发酵过程中存在产物收率较低、副产物较多、丁二酸浓度偏低、生产强度较低的问题，因 此开发高效的丁二酸生产方法是目前丞待解决的问题。在丁二酸生产菌发酵产酸过程中，由于有主要产物丁二酸及其甲酸，乙酸，乳酸等 副产物的产生会降低发酵罐中的PH，为了维持菌体生长的最适pH，在发酵过程中需要用氢 氧化钠、碳酸钠、碳酸镁等碱来中和产生的酸，随着在发酵过程中碱的不断流入，发酵罐中 金属离子浓度的不断升高必然导致渗透压的升高，过高的渗透压将影响菌体的生长和产 酸。而渗透压保护剂比如甜菜碱、海藻糖、脯氨酸、甘氨酸等渗透压保护剂能够很好的缓解 环境中渗透压过高的问题，因此发酵过程中添加适当的渗透压保护剂，从而提高了生产强 度。专利文件CN101457243公开了一种提高L-谷氨酸发酵产率的新工艺，发明了在发酵培 养基中添加甜菜碱、脯氨酸的方法，来有效提高L-谷氨酸发酵产率。目前国内外还未见利 用渗透压保护剂应用于丁二酸的发酵生产中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种添加渗透压保护剂提高厌氧发酵产丁二 酸生产强度的方法，以提高丁二酸的生产强度与浓度。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是，一种添加渗透压保护剂提高丁二 酸浓度和生产强度的方法，步骤如下
菌种活化菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37°C厌氧培养箱中活化培养 24h ；种子培养活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37°C培养10 12h后作为种 子液；发酵罐培养将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为体积比 3 10%，温度为35 40°C，始终通入CO2气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH控制 在6. 5 7. 0，搅拌速度为100 300rpm，发酵30 48h。其特征在于，在所述发酵罐培养的培养基中，添加有渗透压保护剂，所述的渗透压 保护剂的加入量为lg/L 6g/L。本发明所述的渗透压保护剂选自甜菜碱、海藻糖、甘氨酸或脯氨酸等中的一种或 多种。换言之，本发明菌种活化、种子培养与发酵罐培养等步骤，可以采用与传统方法基 本相同的步骤，其主要区别是在发酵罐培养步骤中加入了渗透压保护剂。本发明推荐接种量采用体积比7% ；搅拌转速为200rpm，37°C发酵培养，0)2通气 量为0. 25vvm。本发明推荐所述的渗透压保护剂的加入量为1 5g/L ；最佳值为2. 9g/ L0培养基加入了渗透压保护剂之后，菌体浓度明显比未添加的高，同时发酵周期得 到较大幅度缩短。其原理是根据微生物厌氧发酵产丁二酸的特性，在发酵体系中添加了适 量的渗透压保护剂，而这些渗透压保护剂大都是亲水性的物质，它们能够进入细胞，维持菌 体细胞在高底物、高产物和高金属离子浓度时的渗透压，防止菌体因渗透压过高而失水死 亡。较高的菌体量保证了丁二酸的浓度与生产强度较大幅度的提高，从而降低了丁二酸生 产过程中的能耗，提高了生产效率。本发明所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物为从特征厌氧环境中筛选出的丁 二酸生产菌株，包括产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO. 1716)，产琥珀酸放线杆菌 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)， 重组大肠杆菌Escherichia coli,产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirilum succiniciproducens(ATCC 53488)。以上菌种均为本领域早已公开使用，公开销售的菌种， 公众能够通过公开途径获得这些菌种。本发明所述的菌种活化步骤中，菌株活化的斜面培养基为pH6. 0 8. 0的能提供 碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，培养时将菌体在斜面培养基中平板划线后，在厌氧 培养箱中培养，培养箱含N2、CO2和H2的混合气体，温度为30 40°C，活化培养24 48h， 用于种子培养基接种和菌株保存。本发明所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH6. 0 8. 0的能够提供碳 源、氮源及无机盐的液体培养基，培养时在IOOmL的血清瓶中加入20 SOmL的种子培养 基，通入CO2气体lmin，在115 121°C灭菌15 30min，冷却后接入斜面培养菌株，在温度 为30 40°C，摇床转速为100 300rpm的条件下培养10 16h，用于发酵培养基接种。本发明所述的发酵步骤中，发酵培养的培养基为pH6. 0 8. 0的能够提供碳源、氮 源及无机盐的液体培养基，并加入渗透压保护剂，3L发酵罐中装1. 5L发酵培养基，接种量 为体积比3 10%，温度为35 40°C，始终通入CO2气体来保持厌氧环境，整个发酵过程
4中pH控制在6. 5 7. 0，搅拌速度为100 300rpm，发酵30 48h。本发明所述的渗透压保护剂包括甜菜碱、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸等中的一种或多 种。本发明通过在丁二酸发酵体系中添加了适量的渗透压保护剂，保护菌体细胞在高 底物、高产物和高金属离子浓度时的渗透压，维持菌体活力，实现丁二酸的浓度与生产强度 较大幅度的提高，降低丁二酸生产过程中的能耗，提高了生产效率，具有工业化应用价值。说明书附1为未添加脯氨酸的发酵进程曲线；图2为添加了脯氨酸之后的发酵进程曲线。
具体实施例方式以下所述实施例对本发明做了详细说明，但对本发明没有限制实施例1菌种产琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes NJ113(CGMCC NO. 1716) 该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为Cm00537744C。斜面培养基(g/L)葡萄糖10(分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4 · 2H20 9. 6， K2HPO4 · 3H20 15. 5，琼月旨 20，pH 7. 0，121°C 灭菌 15min。种子培养基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4 · 2H20 9. 6， K2HPO4 · 3H20 15. 5，pH 7. 0，121°C 灭菌 15min。发酵培养基(g/L)葡萄糖60(分消)，酵母膏10，富马酸二钠1，KH2P0 3， MgCl2 · 6Η200· 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，脯氨酸 2. 9，pH 7. 0，121°C 灭菌 15min。菌种活化将冻存于_70°C冰箱的菌种融化后在斜面培养基中进行平板划线后， 在37°C厌氧培养箱中活化培养24h后转接到种子培养基中，200r/min，37°C培养10 12h 后作为种子液。3L发酵罐培养3L发酵罐培养时装液量为1.5L，将活化好的种子液和灭好的葡 萄糖接入发酵罐中，接种量为7%，(ν/ν)，搅拌转速为200rpm，37°C发酵培养，0)2通气量为 0.25vvm。结果见表1、图Α、图B通过添加了 2. 9g/L的脯氨酸之后菌体浓度明显比未添加 的高，同时发酵周期缩短了 30%。表1未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比
丁二酸甲酸乙酸发酵周期(g/L)(g/L)(g/L)(h)未添加脯氨酸42.087.659.1233添加了 2.9 g/L脯氨酸41.017.359.2123实施例2本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法。在3L发酵罐中添加了 2. 9g/L的脯氨酸。结果见表2。经过48h发酵，添加2. 9g/ L的脯氨酸，丁二酸的产量比未添加脯氨酸的增加了 21. 7%。
表2未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比
发酵周期残糖丁二酸甲酸乙酸㈨(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)未添加脯氨酸481646.238.911.2添加了 2.9g/L脯氨酸48256.749.813.2实施例3本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法在3L发酵罐中添加了 5. 35g/L的脯氨酸。结果见表3。添加5. 35g/L的甜菜碱比 未添加甜菜碱的发酵周期缩短了 18%。表3未添加甜菜碱与添加甜菜碱结果对比丁二酸甲酸乙酸发酵时间(g/L)(g/L)(g/L)(h)
未添加甜菜碱 添加了 5.35g/L甜菜碱42.08 41.037.65 7.419.12 9.3133 26实施例4本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法在3L发酵罐中添加了 5. 35g/L的甜菜碱。结果见表4，通过添加5. 35g/L的甜菜 碱比未添加甜菜碱的丁二酸的浓度提高了 11.9%。表4未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比
发酵时间残糖丁二酸甲酸乙酸(h)(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)未添加甜菜碱485.546.258.6510.12添加了 5.35 g/L甜菜碱480.2551.758.4810.32实施例5菌种产琥拍酸厌氧螺菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens (ATCC 53488)。斜面培养基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，蛋白胨5，NaHCO3 10， Na2HPO4 · 2H2015, KH2PO4 · 3H20 4，琼月旨 20，pH 7. 0，121°C 灭菌 15min。种子培养基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，蛋白胨5，NaHCO3 10， Na2HPO4 · 2H2015, KH2PO4 · 3H20 4，pH 7. 0，121°C 灭菌 15min。发酵培养基(g/L)葡萄糖60(分消)，酵母膏10，蛋白胨10，MnCl2O. 05，FeCl2 0. 05，K2HPO4 2. 0，CaCl2 0. 05，脯氨酸 2. 9，pH 7. 0，121°C 灭菌 15min。菌种活化将冻存于-70°C冰箱的菌种融化后在斜面培养基中进行平板划线后，
6培养24h后转接到种子培养基中，200r/min，37°C培养10 12h后作为种子液。3L发酵罐培养3L发酵罐培养时装液量为1. 5L，将活化好的种子液和灭好的葡 萄糖接入发酵罐中，接种量为7%，(ν/ν)，搅拌转速为200rpm，37°C发酵培养，0)2通气量为 0. 25vvm0发酵结果见表5，通过添加了 2. 9g/L脯氨酸之后，在相同初糖浓度下，葡萄糖完全 耗完，发酵周期缩短了 23%。表5未添加脯氨酸与添加脯氨酸结果对比
「00581 发酵时间 il 丁二酸 _(h)(g/L)(g/L)
权利要求
一种添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特征在于，步骤如下菌种活化菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37 ℃厌氧培养箱中活化培养24 h；种子培养活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37 ℃培养10~12 h后作为种子液；发酵罐培养将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为体积比3~10 %，其特征在于，在所述发酵罐培养的培养基中，添加有渗透压保护剂，所述的渗透压保护剂的加入量为1 g/L~6 g/L。
2.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其 特征在于，所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物选自产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJl 13、产琥珀酸放线杆菌 Jciiflo^ciBiAs succinogenes 130Z、重组大肠 木干菌 Escherichia cc^i，或产Jl^i白酸厌氧 累菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens。
3.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特 征在于，所述的渗透压保护剂选自甜菜碱、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特 征在于，所述的菌种活化步骤中，菌株活化的斜面培养基为PH6. (Γ8. O的能提供碳源、氮源 及无机盐的固体斜面培养基，培养时将菌体在斜面培养基中平板划线后，在厌氧培养箱中 培养，培养箱含N2、CO2和H2的混合气体，温度为3(T40 rpC,活化培养24、8 h，用于种子培 养基接种和菌株保存。
5.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特 征在于，所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为PH6. (Γ8. O的能够提供碳源、氮源及 无机盐的液体培养基，培养时在IOOmL的血清瓶中加入2(T80 mL的种子培养基，通入CO2气 体1 min，在115 121 rpC灭菌15 30 min，冷却后接入斜面培养菌株，在温度为30 40 ？ C， 摇床转速为ΚΚΓ300 rpm的条件下培养l(Tl6 h，用于发酵培养基接种。
6.根据权利要求1所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其 特征在于，所述的发酵步骤中，发酵培养的培养基为PH6. (Γ8. O的能够提供碳源、氮源及无 机盐的液体培养基，并加入渗透压保护剂，3 L发酵罐中装1.5 L发酵培养基，接种量为体 积比7%，温度为35、0 ？ C，始终通入CO2气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH控制在 6. 5 7.0，搅拌速度为100 300 rpm，发酵30 48 h。
7.根据权利要求6所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特 征在于，所述发酵罐培养的条件是搅拌转速为200 rpm，37°C发酵培养，CO2通气量为0. 25 vvm0
8.根据权利要求广7之一所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方 法，其特征在于，所述的渗透压保护剂的加入量为广5 g/L。
9.根据权利要求8所述的添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，其特 征在于，所述的渗透压保护剂的加入量为2. 9 g/L。
全文摘要
添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法，步骤是，菌种活化菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37℃厌氧培养箱中活化培养24h；种子培养活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37℃培养后作为种子液；发酵罐培养将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为体积比3~10%，特征是，在发酵罐培养基中添加有渗透压保护剂，渗透压保护剂的加入量为1g/L~6g/L。本发明通过添加渗透压保护剂，保护菌体细胞在高底物、高产物和高金属离子浓度时的渗透压，维持菌体活力，实现丁二酸的浓度与生产强度较大幅度的提高，降低丁二酸生产过程中的能耗，提高了生产效率，具有工业化应用价值。
文档编号C12R1/19GK101955978SQ20101026807
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者奚永兰, 姜岷, 张敏, 方晓江, 李建, 欧阳平凯, 郑晓宇, 韦萍 申请人:南京工业大学