专利名称：C基因型恩替卡韦耐药突变hbv稳定复制表达细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)稳定复制表达细胞系，特别是所含病毒来源 于我国C基因型HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷类似物恩替卡韦(ETV)耐 药突变位点的病毒稳定复制表达细胞系。
背景技术：
建立某种病毒的稳定复制细胞模型，产生具有完整的病毒生命周期并能长期持续 分泌病毒颗粒，是进行体外抗病毒药物筛选以及研究抗病毒机制的必需工具。特别是在需 要标准化的实验，如对抗病毒药物敏感性实验中，稳定复制病毒表达细胞系的建立及应用 尤其重要。由于乙型肝炎病毒(HBV)基因组不同的读码框架及调控序列之间相互重叠，需要 携带大于一个完整3. 2kb基因组序列的载体才能在转染的细胞系里建立稳定的HBV复制状 态，保证3. 5kb前基因组RNA的有效转录。已有的研究证实从1. 05拷贝至4. 0拷贝质粒均 可产生稳定复制细胞系。国内外学者经过不同的尝试，建立了数株HBV复制细胞系，如目前 公认并广泛应用的整合了 D基因型/ayw亚型野生HBV株的H印G2. 2. 15细胞Sells MA,et al.Proc Natl Acad Sci USA，1987,84 :1005_1009，可被四环素调控表达的 H印AD38 细胞Ladner SK, et al. Antimicrob. Agents Chemother，1997，41 :1715-1720 Huh7· 93 细 胞、H印G2. 117 细胞等Sun DX, et al. J H印atol，2006，45 :636-645。已知HBV至少分为A-H等8个不同的基因型和若干基因亚型，不同基因型的HBV复 制表达细胞系具有不同的病毒学特点，对疾病进展、临床转归，特别是抗HBV药物的敏感度 有较大影响。而上述建立的HBV复制细胞株所整合的HBV DNA是A基因型和D基因型HBV 株，而中国流行的HBV株主要为C基因型及B基因型，尤其是北方地区84%的HBV感染患 者为 C 基因型Li X，et al. J Clin Microbiol, 2010,48, doi :10. 1128/JCM. 01518-10.。 因此，已有的成熟细胞株并不适用于针对我国流行HBV的抗病毒药物的研究。此外，随着抗HBV药物核苷和核苷酸类似物种类增加及在临床长期广泛应用， HBV耐药变异株逐渐出现并成为临床抗病毒治疗失败或疗效不佳的主要原因。为满足耐 药突变株的病毒学特性研究以及一些新研发的抗病毒药物的药效评价，耐药突变HBV稳定 复制细胞株也相继在一些实验室建立。如Ladner等在1998年率先建立了拉米夫定耐药 突变(rtM204V/I)稳定复制细胞株Ladner SK, et al. Antimicrob Agents Chemother, 1998,42 2128-2131，Delaney等利用定点突变方法先后建立了拉米夫定耐药突变 (rtL180M士rtM204V/I)，阿德福韦酯耐药突变(rtA181V/T士rtN236T)细胞株Delaney WE, et al. Antimicrob Agents Chemother，2001，45 1705—1713，Seifer 等也人为突变 野生D基因型病毒，产生8株不同含拉米夫定耐药突变(rtL180M+rtM204V/I)、阿德福韦 酯耐药突变(rtN236T+rtA181V)、替诺福韦酯耐药突变(rtA194T)及替比夫定耐药突变 (rtL80I/rtM204I)稳定复制细胞株kifer Μ, et al. Antiviral Research, 2009,81 147-155，分析评价药物的抗HBV活性。
但是，以上这些耐药突变株都是通过定点突变技术人为产生的，得到的仅为非自 然存在的突变株，如果细胞模型的病毒来源并非从患者血清直接分离得到的，这种非自然 存在的突变可能影响到整个病毒的表型。通常情况下，HBV在产生耐药变异的同时会产生 补偿性突变来恢复自身的复制能力，人为突变会修改病毒的某些自然遗传特征，不能完全 反映耐药株的表型特征。恩替卡韦(Entecavir，简称ETV)是目前抗HBV效力最强、耐药率最低的核苷类似 物，对以前未使用过核苷类或核苷酸类药物的初治患者6年累积耐药发生率仅为1. 2%，但 随着应用时间的延长和治疗个体的不断扩大，尤其是针对拉米夫定治疗失败的患者，ETV挽 救治疗后耐药率显著增加(6年累积耐药率达59%)，这与耐药种群的产生密切相关。在 LAM耐药(rtL180M+rtM204V/I)基础上出现rtT184/rtS202/rtM250任意一个位点的氨基酸 替换突变即为ETV耐药。研究发现，在中国慢性HBV感染患者中ETV基因型耐药突变形式 以rtL180M+rtT184L+rtM204V最多见刘妍，等.解放军医学杂志，2010，35 621-624]0如果能够直接从长期用ETV治疗的中国乙肝患者血清分离克隆含有ETV耐药突变 位点的HBV全长基因组序列，建立中国流行的C基因型稳定复制细胞模型，对于抗C基因型 耐药HBV的防治和新药药效评价具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的是从来源于中国流行的C基因型HBV株中构建一种HBV稳定复制表 达细胞系，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有ETV耐药突变位点。该ETV耐药细胞系能用于各 种核苷和核苷酸类似物的耐药表型分析，可为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。本发明进行了如下工作1、从中国慢性乙肝患者血清中分离C基因型HBV全长基因组，挑选存在典型ETV 耐药突变位点克隆序列，构建含1. 1倍长HBV基因组的真核细胞表达质粒。2、建立了能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗 粒的肝癌细胞系。所建的细胞系具有SEQ ID NO :5所示的DNA序列。3、通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组化方法检测病毒抗原表达，通过对细 胞质内HBV复制中间体中核心颗粒DNA、细胞核内共价闭合环状cccDNA、培养上清中分泌的 病毒DNA载量进行实时荧光定量PCR测定，以透射电镜观察浓缩的培养上清中HBV颗粒，评 估稳定细胞克隆的复制表达情况。4、以四种核苷和核苷酸类抗病毒药物用于体外表型分析，证实该细胞系的耐药表 型特征。将拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF)分别作用 于该细胞系，计算并比较其核心颗粒DNA的荧光定量PCR及Southern杂交的结果。结果证 明对ETV和LAM高度耐药，对ADV和TDF敏感(见实施例4)。本发明的有益效果是本发明建立了自主复制HBV的肝癌细胞系，能够持续复制并产生特异性抗原和分 泌型病毒颗粒，病毒来源于中国流行的C基因病毒株，含有典型的ETV耐药突变位点，为研 究中国流行HBV的生物特性和药物筛选提供实用工具。
图1是重组载体pTriEx-1. I-HBV结构示意图；图2是H印G2. A64细胞各代HBsAg和HBeAg抗原表达情况；图3是H印G2. A64细胞、H印G2. 2. 15细胞和H印G2细胞内HBsAg和HBcAg免疫组 化染色结果；图4是H印G2. A64细胞分泌上清中HBV全长PCR电泳图；图5是Southern Blot检测H印G2. A64细胞内不同形式病毒复制DNA结果；图6是浓缩H印G2. A64细胞培养上清病毒颗粒电镜结果，图中A :42nm Dane颗粒 B :20nm小球状表面抗原颗粒(X200, 000 ；bar = 50nm)；图7是H印G2. A64细胞4种药物定量PCR表型分析结果，图中A =LAM B =ETV C ADVD =TDF ；图8是H印G2. A64细胞4种药物作用的Dot Blot结果；图9是H印G2. A64细胞TDF作用的Southern Blot结果。
具体实施例方式实施例中所使用的试剂和材料来源如下Taq DNA聚合酶及限制性内切酶均购自TaKaRa公司；JM109感受态细胞购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂及转染级质粒提取试剂盒均购自Qiagen公司；DMEM、无血清培养基购自Gibco公司； 转染试剂FuGENE HD及地高辛标记dUTP等kuthern杂交试剂均购自Roche公司；荧光定量PCR试剂SYBR green I PCR kit购自杭州博日公司；HBsAg和HBeAg定性检测ELISA试剂盒购自北京科卫公司。HBsAg定量检测由302医院临检中心完成。其他生化试剂购自Sigma公司。免疫组化抗体和显色试剂为中杉公司产品。引物由上海生工公司合成，克隆测序由北京天一辉远生物科技公司完成。人肝癌细胞系!fepG2细胞及表达neo基因抗性的质粒pSV2-ne0由解放军302医 院病毒性肝炎研究室保存；支持病毒复制的载体pTriEx-mod由法国里昂大学Fabien Zoulim教授馈赠。血清Sl 145取自2007年12月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者，男，35 岁，排除其他因素所致肝功能损害。分离扩增全长HBV基因组并克隆于pGEM-Teasy载体中， 进行全基因组测序，确定为C基因型。逆转录酶区核苷(酸)类似物耐药相关的氨基酸突 变:rtL180M, rtT184L, rtM204V。实施例1 1. 1倍长HBV表达载体构建(1)全长环状HBV模板的制备将克隆于pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组 (S1145)用BspQlAcal双酶切，纯化回收3. 21Λ片段，取10 μ L酶切产物用Τ4 DNA连接酶 连接过夜，连接产物备用。(2)双HBV片段扩增参照S1145测序结果，根据文献蒋林彬，等.解放军医学 杂志，2010，35 =635-638]设计合成两对用于扩增HBV的引物(表1)。取5μ 1环化的HBVDNA产物作为PCR模板，以A/B引物对扩增得到2735bp HBV部分基因组片段，以C/D引物对 扩增得到64;3bp HBV部分基因组片段，分别将AB和⑶片段克隆于pGEM-Teasy载体中。表1用于PCR扩增的弓丨物序列及位置
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒稳定复制表达细胞系，其特征在于具有SEQ ID NO :5所示序列的DNA。
2.权利要求1所述的细胞系，其特征在于所含病毒来源于中国流行的C基因型 HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶区含有典型的核苷类似物恩替卡韦耐药突变位点 rtL180M+rtT184L+rtM204V。
3.权利要求1或2所述的细胞系在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
4.权利要求4所述的应用，所述抗乙型肝炎病毒药物是核苷类似物。
全文摘要
本发明构建了一种乙型肝炎病毒稳定复制表达细胞系，病毒来源于中国流行的C基因型HBV株，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷类似物恩替卡韦耐药突变位点。本发明通过筛选方法使病毒基因组整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞染色体上，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。本细胞系抗原分泌稳定，病毒复制活跃，技术参数稳定，可为抗HBV药物的评价及新药研发提供稳定可靠的细胞模型，为临床治疗提供指导依据。
文档编号C12Q1/02GK102102091SQ20101058655
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者刘妍, 刘 文, 徐东平, 思兰兰, 戴久增, 王琳, 许智慧 申请人:中国人民解放军第三〇二医院