专利名称：一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物厌氧发酵制氢的方法，尤其是一种利用高效厌氧菌制 氢的方法。
背景技术：
氢气作为新一代绿色能源，具有清洁、高效、可再生等特点，假如能够产业化生产， 未来必定能够代替石油、天然气等化石能源，减轻对环境的压力。此外，氢能不是一次能源，需要从含氢的化合物中制取。目前全世界90%以上的氢 来自化石燃烧，其余为水电解制氢。不论是哪种制氢方法都要直接或间接消耗大量的化石 能源。化石燃料储量有限，且趋于枯竭，同时，化石燃料燃烧时生成的温室气体，有毒气体等 其他有机化合物，造成了严重的环境污染并使得全球气候发生变化。生物制氢以其原料来 源丰富、价格低廉等特点越来越收到人们的关注，一旦规模化生产，将会是最有潜力的一种 制氢方法。生物制氢最先是在1966年由lewis提出的，然后20世纪70年代经历的石油危机 使全球认识到了生物制氢的实用性和迫切性。直到90年代，当世界面临着能源与环境的双 重压力时，生物制氢被再度提上了议事日程。生物制氢包括光合生物制氢和厌氧发酵制氢 两种途径。后者具有产氢率高、产氢速率快、产氢持续稳定、反应装置的设计操作简单、原料 来源广泛且成本低等特点，更易于实现规模化生产，因而成为生物制氢研究的主要方向。厌 氧发酵制氢菌种包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌，其中，专性厌氧菌的培养、运输及工业化条 件苛刻，而兼性厌氧菌具有广泛的适应性，但兼性厌氧菌产氢效率没有专性厌氧菌高，在适 当条件下合理培养，可以克服其缺点，专性厌氧菌将会是生物制氢工业化更理想的细菌。目 前，专性厌氧菌种类比较少，缺乏新型菌种，产氢效率偏低，并且制氢条件待进一步优化。通过专利检索，目前已有专利主要是对发酵底物、发酵装置和提高产氢效率的研 究，如一种污泥与有机垃圾混合生物制氢的方法(申请号200710032658. 0周少奇等)，光 合微生物制氢反应器(申请号200620032282.4)，生物发酵制氢装置(申请号=00231651. X沈建权)，一种利用CO2使藻类快速增殖直接用于生物制氢的方法(200710010804. X) 和高效发酵法生物制氢膨胀床设备(申请号=03260012. 7任南琪等)等，而对于发酵菌种 特别是高效产氢菌种的筛选研究相对薄弱，仅有一种生物制氢方法及其专用菌(申请号 200910088408. 8邢新会等)，但该方法所用菌种是通过基因导入后的重组菌，操作较复杂， 且发酵条件要求严格厌氧，不易推广。所以，对于新型专性厌氧新型菌种的筛选以及制氢工 艺条件的探索优化十分必要。
发明内容
本发明主要包括一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，该方法是在严格厌 氧条件下，使用巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum) JCM1408T,以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式，24小时后即可开始产氢过程。本发明所筛选的专性厌氧菌具体为梭菌属(Clostridium ffinogradsky, 1895)的 巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum) JCM1408T，购自日本生物技术研究所微生物菌种保 藏中心(Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Institution, MBIC)。本发明的技术方案为一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧 条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐 酸盐一水、刃天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发 酵的方式进行制氢，所述的专性厌氧菌为巴氏梭菌JCM1408T。培养基的组成为蛋白胨10. 0 15. 0g、牛肉膏2. 0 3. 0 g、酵母提取物5. 0 10. Og^Na2HPO4 3. 0 4. 0g、L_半胱氨酸0. 2 0. 5g、L_半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g、 0.2% wt的刃天青指示剂lmL、马血清4(T60ml和蒸馏水1L。所述的发酵底物葡萄糖的浓度为5. 0 20. 0g/L
具体步骤为无菌厌氧环境下，将培养基用磷酸盐缓冲液调pH为5. 5 6. 5，水浴加热 瓶内培养基，同时从瓶口充氮气5分钟，待液相变为无色，最后封上瓶盖，115°C高温灭菌， 烘干后将巴氏梭菌的菌株接种至装有培养基的瓶中，在37 40°C条件下静置培养至0D_ 值为1.402后作为接种物，然后将接种物与培养基按体积比1 :1(Γ40的比例接种于发酵瓶 中的培养基中得到发酵液；于37 40°C条件下进行恒温振荡培养，连续产氢。该条件下产 氢效率高，对发酵环境条件要求低，具有广阔的应用前景。有益效果
首先，筛选出一种新型发酵制氢菌种，此菌种为专性厌氧菌，具有生长迅速，产氢效率 高等优点；
其次，确定了发酵工艺条件，确定发酵底物为浓度是5. 0 20. 0g/L的葡萄糖，培养 基配制为蛋白胨10.0 15. 0g，牛肉膏2.0 3.0 g，酵母提取物5.0 10. 0g, Na2HPO4 3. 0 4. 0g, L-半胱氨酸0. 2 0. 5g，L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g，刃天青指示剂 (0. 2%)lmL，马血清40 60 mL /L，蒸馏水IL ；培养基用磷酸盐缓冲液调pH为5. 5 6. 5， 水浴加热瓶中液体并充氮气5分钟，试管内保持厌氧环境，发酵和接种都在厌氧箱内操作， 采用分批发酵的方式；于37 40°C条件下静置培养24小时作为接种物，然后按接于发酵 瓶中，37 40°C条件下进行恒温振荡培养，可以连续产氢。此外，巴氏梭菌在发酵罐内批量 培养，产氢量明显高与小样培养，产氢比率达到1.7mol H2Aiol葡萄糖。
图1为本发明的制氢装置示意图。其中，1为氮气冲洗口和液体取样口，2为气体取样口，3为气体收集管，4为水准 瓶。图2为葡萄糖的质量浓度对气体总产量的影响。图3为葡萄糖的质量浓度对细胞成长的影响。图4为初始pH对氢气总产量的影响。
图5为初始pH对细胞成长的影响。
具体实施例方式菌种的扩大培养
实施例1 确定菌种扩大培养的基础培养基
培养基组成为蛋白胨1(^/1，牛肉膏2.4 g/L，酵母提取物5. Og/L，Na2HPO4 4g/L，L_半 胱氨酸0. 2 g/L, L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 5 g/L,马血清40 60 mL /L,蒸馏水1000mL。 此外，另添加刃天青指示剂(0. 2% ) lmL/L。调节pH= 6. 5，每IOOmL培养液装入250mL盐 水瓶(带瓶塞，能密闭)，水浴加热瓶内液体，同时从瓶口吹入氮气，待液相变为无色(瓶内 为无氧环境)，封上瓶盖。120°C高温灭菌25min，于60°C烘箱中烘干后，将菌株Clostridium pasteurianum接种至装有培养基的瓶中(无菌厌氧操作)，于37°C下静置培养24 48h。在培养过程中，用756紫外可见分光光度计在600 nm处定时测定样品的吸光度 值，48h细菌生长OD值为1.402。实验结果表明细菌总生长时间为45h，最终0D_值为1.402，细菌繁殖迅速，厌氧 条件控制的好，适合细菌生长。菌种的发酵产氢
实施例2 菌种发酵基底物浓度配置的选择确定
发酵用培养基的组成为蛋白胨10g/L，牛肉膏2. 4 g/L，酵母提取物5. 0g/L, Na2HPO4 4g/L，L-半胱氨酸0. 2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 5g/L，马血清40 60 mL /L,刃天青 (0. 2%)lmL/L,葡萄糖5 20g/L;调节初始pH=5.5飞.5;配制培养基过程中，利用加热煮 沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相空气的方式，保证严格厌氧于115°C高温灭菌 25min ；无菌厌氧操作下，将之前培养的Clostridium pasteurianum OD6tltl值为1. 402的接 种物高浓度菌液与培养基按表1中的接种量接种于200ml发酵瓶中的培养基中，在37°C的 厌氧箱内静置培养，具体试验因素和水平见表1 表权利要求
一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4 、L 半胱氨酸、L 半胱氨酸盐酸盐一水、刃天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进行制氢，所述的专性厌氧菌为巴氏梭菌JCM1408T。
2.如权利要求1所述的利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，培养基 的组成为蛋白胨10.0 15. 0g、牛肉膏2.0 3.0 g、酵母提取物5.0 10. Og、Na2HPO4 3. 0 4. 0g、L-半胱氨酸0. 2 0. 5g、L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g、0. 2% wt的刃 天青指示剂lmL、马血清4(T60ml和蒸馏水1L。
3.如权利要求1所述的利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，所述的 发酵底物葡萄糖的浓度为5. 0 20. Og/L。
4.如权利要求1所述的利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，具体步骤为无菌厌氧环境下，将培养基用磷酸盐缓冲液调pH为5. 5 6. 5，水浴加热瓶内培养 基，同时从瓶口充氮气5分钟，待液相变为无色，最后封上瓶盖，115°C高温灭菌，烘干后将 巴氏梭菌的菌株接种至装有培养基的瓶中，在37 40°C条件下静置培养至OD6tltl值为1. 402 后作为接种物，然后将接种物与培养基按体积比1 :1(Γ40的比例接种于发酵瓶中的培养基 中得到发酵液；于37 40°C条件下进行恒温振荡培养，连续产氢。
全文摘要
本发明提供了一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、刃天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进行制氢，所述的专性厌氧菌为巴氏梭菌JCM1408T。培养基的组成为蛋白胨10.0～15.0g、牛肉膏2.0～3.0g、酵母提取物5.0～10.0g、Na2HPO4 3.0～4.0g、L-半胱氨酸0.2～0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐一水0.2～0.5g、0.2％wt的刃天青指示剂1mL、马血清40~60ml和蒸馏水1L。可以连续产氢。
文档编号C12R1/145GK101988075SQ20101058649
公开日2011年3月23日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者王瑞兴, 钱春香, 陈璐圆 申请人:东南大学