专利名称：全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由脱氧核苷一磷酸dNMP合成脱氧核苷三磷酸dNTP的方法。
背景技术：
脱氧核苷三磷酸是人工合成DNA的必备前体原料，人工合成DNA片段广泛应用于基因工程、分子生物学、生命科学、基因药物等方面。三磷酸脱氧核苷是各种DNA聚合酶促反应的底物，是DNA序列分析、基因分析、定点突变、PCR(Polymerase ChainReaction)、RT-PCR、反转录和DNA标记反应不可缺少的低分子量生物有机分子。而DNA序列分析、定点突变、PCR及DNA芯片技术是现代分子生物学、生物化学和现代生物医学研究不可缺少的技术。尤其是PCR技术具有操作简单应用广泛等特点，它在基因分子克隆、蛋白质工程、生物医药研发、遗传和传染性疾病诊断、法医鉴定、亲子检定等领域得到越来越广泛的应用。
随着生物技术研究和工业化中DNA合成的PCR应用，dNTP的需求在稳定地增长。目前世界上只有少数几家企业能够生产三磷酸脱氧核苷，所采用的方法主要是利用脱氧核糖核酸水解产物的酶促或化学磷酸化，终产物的获得要求多步反应，生产工艺繁琐，产物转化率低。
商业上主要通过化学方法生产dNTP，反应是以dNMP相应的三丁基铵盐和正磷酸为底物，以二环己基碳二亚胺(DCC)为催化剂，在吡啶或者二甲基酰胺(DMF)等有机溶剂中进行。化学法生产得到不同dNTP的产率为40～80％。然而，纯化反应混合物中的各个dNTP组分，其过程十分复杂并且成本很大，它需要分离非活性的dNMP、dNDP、DCC和正磷酸以及副产物如脱氧核糖核苷四磷酸或五磷酸等。另外，因为废气处理的原则很严格，吡啶或者DMF溶剂一定要被还原，分离，然后回收。因此，化学法有很大的环境污染，并且通过反应和纯化后它的得率很低，成本也相对较高。
从经济和环境因素考虑，近年世界上已出现酶法合成脱氧核苷三磷酸，此法比化学方法更具优势。dNTP的合成需要两个酶磷酸化的反应，从dNMP生成dNDP和第二步生成dNTP。Ladner和Whitesides由从鲱鱼精子DNA中分离的脱氧核苷一磷酸(dNMP)混合物合成dNTP[Ladner W，Whitesides G.Enzymatic synthesis of deoxyATP using DNAas starting material[J].J Org Chem，1985，501076-1079]。近年来，Jie Bao，Dewey D.Y.Ryu等人成功将编码四种脱氧核苷单磷酸激酶的基因从Saccharomyces cerevisiae ATCC2610菌株的基因组中分离出来，分别为编码脱氧腺苷酸激酶(AK)的ADK1，编码脱氧鸟苷酸激酶(GK)的GUK1，编码脱氧胞苷酸激酶(CK)的URA6，以及编码脱氧胸苷酸激酶(TK)的CDC8基因。他们将这些基因克隆到E.coli BL21(DE3)菌株中，并使AK，GK，CK，TK过量表达。用纯化的脱氧核苷酸激酶实现从脱氧核苷单磷酸到脱氧核苷二磷酸的转化。第二步加入从家兔肌肉中提取的丙酮酸激酶(PK)实现从dNDP到dNTP的转化[Bao J，Ryu DDY.Total Biosynthesis of Deoxynucleoside Triphosphates UsingDeoxynucleoside Monophosphate Kinases for PCR Application[J].Biotechnol Bioeng.2007，98(1)1-11]。尽管如此，dNTP的产率仍较低，只有25％左右[Bao J，Bruque GA，RyuDDY.Biosynthesis of deoxynucleoside triphosphates，dCTP and dTTPReaction mechanismand kinetics[J].Enzyme Microb Technol.2005，36350-356；Bao J，Ryu DDY.Biosynthesisreaction mechanism and kinetics of deoxynucleoside triphosphates，dATP and dGTP[J].Biotechnol Bioeng.2005，89485-491]。另外，世界上已有数家研究机构正在研发核苷酸还原酶，但这些正处在研发阶段的核苷酸还原酶大都有反应条件复杂和酶稳定性差等缺点，不适合工业化，应用范围有限。
目前国内外dNTP得率普遍不高、成本高并且生产工艺繁琐的一个重要原因在于能量再生和偶联效率低下。在dNTP的合成过程中需要消耗大量的能量(ATP)，因此需要两个酶系即ATP的再生体系和dNTP的合成酶系。ATP的再生体系以糖为底物，通过糖酵解途径(EMP)来实现，该途径是能量再生的最经济的途径之一，而供体ATP在dNTP合成过程中作为磷酸供体和能量而存在。因此dNTP合成的关键就在于如何建立一个高效的能量再生和自偶联体系。采用酵母全细胞催化技术，可以克服合成过程中底物利用效率低、产物得率低和生产成本高等问题。同时，与酶法相比，由于使用的是全细胞，酶的稳定性更好，耐有机溶剂的适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生。在现有技术中，糖通过EMP途径生成ATP的效率很低，只能维持酵母一般的生命代谢，要加大EMP途径的通量，超量表达底物磷酸化水平，只有通过基因工程技术或采用化学效应物质改变代谢流的方法来实现，采用后者更方便，易于实现。在化学效应物质的调节下，可使EMP途径的代谢流量发生明显改变，ATP再生的速率也得到了很大的提高，当其速率和dNTP合成体系的速率相匹配时，即实现dNTP的高效合成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单而高效的脱氧核苷三磷酸dNTP的制备方法，以克服dNTP传统制备复杂、成本高得率低、污染大等缺点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下 全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，以脱氧核苷一磷酸和磷酸根离子为底物，以糖为能量供体，利用有透性的酵母细胞，在化学效应物质的存在下建立高效的能量自耦联和再生系统来制备脱氧核苷三磷酸。
其中，所述的脱氧核苷三磷酸dNTP是指脱氧腺苷三磷酸dATP、脱氧鸟苷三磷酸dGTP、脱氧胞苷三磷酸dCTP和脱氧胸苷三磷酸dTTP中的任意一种，其结构式如下
其中，所述的脱氧核苷一磷酸dNMP是指脱氧腺苷一磷酸dAMP、脱氧鸟苷一磷酸dGMP、脱氧胞苷一磷酸dCMP、和脱氧胸苷一磷酸dTMP中的任意一种，其结构式如下
其中，所述的脱氧核苷一磷酸的起始反应浓度为1～100mM；所述磷酸根离子起始反应浓度为0.01～1.0M；糖的起始反应浓度为0.1～1.0M；所述磷酸离子可举出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等无机磷酸盐；所述的糖为葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖。
其中，所述的化学效应物质是指金属离子和有机化合物的组合；所述的金属离子为Mg2+、K+和Na+中的任意一种或几种；所述的有机化合物为乙醛和多元醇中的任意一种或两种的组合；Mg2+可以是硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机镁盐，起始反应浓度为1～100mM；K+可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化钾等无机钾盐，起始反应浓度为1～100mM；乙醛起始反应浓度为10～80mL/L，多元醇可以是乙二醇、丙三醇、山梨醇或甘露醇，优选丙三醇，多元醇起始反应浓度为5～100mL/L。
其中，所述的酵母细胞为酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中的任意一种，优选的例子可举属于酵母属的微生物酿酒酵母，面包酵母等；属于假丝酵母属的微生物近平滑假丝酵母；属于毕赤酵母属的奥默列氏毕赤酵母；属于球拟酵母属的微生物白色球拟酵母；属于德巴利酵母属的类球形德巴利酵母；属于接合酵母属的鲁氏接合酵母；属于克鲁维酵母属的马克斯克鲁维酵母；属于汉逊酵母属的杰丁汉逊酵母；属于酒香酵母属的异酒香酵母等。
酵母细胞的使用量为按湿菌体100～800g/L，优选200～600g/L，即对于总体积为1L的反应液，需加入100～800g湿菌体，优选加入200～600g湿菌体。
酵母的利用形式为酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、固定化细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母或废酵母泥。
其中，有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞，所述化学、物理或生物方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。
表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100，阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物，或阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐，表面活性剂使用量为0.1～50g/L，优选1～20g/L，即表面活性剂法处理生产菌株时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50g，优选加入1～20g。
有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，有机溶剂浓度为0.1～50mL/L，优选以1～20mL/L，即有机溶剂法处理生产菌株时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50mL，优选加入1～20mL。
其它处理细胞透性的方法，如冻融法、超声波处理法、风干法等，采用先将菌株细胞处理后，再将处理好的菌株加入反应液的方式。
上述制备脱氧核苷三磷酸的反应在水溶液中进行，在pH 5.0～9.0、20～50℃条件下反应2～24小时，优选在pH 7.0～8.0、30℃条件下反应2～24小时。
有益效果本发明的优点在于 1、本发明利用酵母细胞进行催化反应，酵母细胞含酶种类丰富，具有催化多种生化反应的潜力。特别酵母细胞具有辅酶(NADH，NADPH，ATP)再生功能，在催化氧化还原反应、磷酸转移反应方面可发挥重要作用。利用酵母细胞的酶系进行酶催化反应生产所需产品范围广泛、具有很好的市场前景。
2、本发明是建立在全细胞催化的基础上的，其特点在于克服了其他方法底物转化率不高、难于实现能量和辅酶再生等缺陷。与酶法相比，由于细胞具有维持其生命活动完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，反应所需要的能量和辅酶因子不需要外界供给，直接由细胞产生，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应，有转化率高、成本低，以及污染小的优点。同时与现有的化学方法相比，本发明是一种能明显降低环境污染的生物转化方法。
3、本发明建立了高效的能量自耦联和再生系统，反应利用了微生物体内的酶系糖酵解(EMP)途径酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶)和dNTP合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶)进行催化反应，EMP途径产生的ATP可以运用于dNTP合成，另外通过化学物质的加入，可以加快ATP的再生速率，形成高效的能量自耦联和再生系统，使得dNTP过量积累。
4、本发明利用代谢工程原理，加入镁离子、钾离子，以及乙醛和多元醇的组合物，主要起到以下几方面作用 1)调节代谢通量，使系统内的代谢途径流量发生明显改变，流向甘油的代谢流量大幅减少。代谢通量经调节后，EMP的支路途径被强烈抑制，使得EMP主途径得以加强，从而提高了对能量的利用率，而dNTP的积累正需要ATP供给能量与磷酸根，dNTP进而得以大量积累。
2)加快NADH再生，维持胞内NADH/NAD+比率，恢复细胞的氧化还原平衡。并且将NADH氧化途径转向乙醇发酵途径，从而加大糖酵解途径的通量，促进dAMP到dATP的转化。
3)加入镁离子、钾离子等金属离子，使得FDP的累积速率明显加快，刺激丙酮酸激酶活性；另一方面是由于磷酸烯醇式丙酮酸的分解，使得原来由甘油磷酸脱氢酶催化磷酸二羟丙酮引起的NAD的再生，仍由乙醇脱氢酶担当。而乙醛和多元醇可以有效地保证并加快NADH再生，维持酶活及其稳定性。由此，金属离子和有机物可以互相促进，两者产生高效的协同作用，使系统内的代谢途径流量发生明显改变，流向甘油的代谢流量大幅减少，实现dNTP的高效合成。
4)保证酵母酶系的酶活及其稳定性，有利于提高dNTP的合成效率。
具体实施例方式 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 酵母培养基(g/L)葡萄糖40，尿素2.0，磷酸二氢钾1.5，七水合硫酸镁0.5，七水合硫酸锌4.0×10-3，七水合硫酸亚铁3.0×10-3，四水合氯化锰0.3×10-3，无水氯化钙1.0×10-3，生物素0.05×10-3。酿酒酵母接种量10％，于30℃下120rpm摇床培养24小时，离心4000rpm，20分钟。取酵母泥，-7℃保藏备用。
以下实施例使用的酵母都是按上述培养方式培养。
实施例2利用dAMP制备dATP。
在容量为500mL的烧杯中调制由dAMP 1.49mmol，葡萄糖0.072mol，面包酵母泥100g，硫酸镁14.96mmol，磷酸二氢钠0.036mol，丙三醇3mL，十六烷基三甲胺.溴化铵0.3g和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至7.0，于30℃条件下低速搅拌反应6小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dATP进行定量分析，转化液中含dATP 2.59g/L，dATP的得率达到93.6％(mol计)。
实施例3利用dAMP制备dATP。
在容量为500mL的烧杯中调制由dAMP 1.66mmol，葡萄糖0.08mol，风干后的面包酵母泥110g，氯化钾8.05mmol，磷酸二氢钠0.036mol，乙醛3mL和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至7.0，于30℃条件下低速搅拌反应6小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dATP进行定量分析，转化液中含dATP 2.85g/L，dATP的得率达到92.4％(mol计)。
实施例4利用dCMP制备dCTP。
在容量为500mL的烧杯中调制由dCMP 1.50mmol，葡萄糖0.068mol，酿酒酵母90g，风干处理，氯化镁6.89mmol，氯化钾5.37mmol，磷酸二氢钠0.03mol，乙醛3mL，丙三醇3mL，曲拉通X-100 6g和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应18小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dCTP进行定量分析，转化液中含dCTP 0.71g/L，dCTP的得率达到25.6％(mol计)。
实施例5利用dCMP制备dCTP。
在容量为500ml的烧杯中调制由dCMP 1.61mmol，葡萄糖0.076mol，鲁氏接合酵母100g，反复冻融3次，氯化钾8.05mmol，磷酸二氢钠0.03mol，丙三醇3mL和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应18小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dCTP进行定量分析，转化液中含dCTP 0.80g/L，dCTP的得率达到26.9％(mol计)。
实施例6利用dGMP制备dGTP。
在容量为500ml的烧杯中调制由dGMP 1.30mmol，葡萄糖0.065mol，鲁氏接合酵母90g，硫酸镁16.62mmol，磷酸二氢钠0.03mol，乙醛3mL，十六烷基三甲胺.溴化铵0.3g和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应12小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dGTP进行定量分析，转化液中含dGTP 0.99g/L，dGTP的得率达到45.0％(mol计)。
实施例7利用dGMP制备dGTP。
在容量为500ml的烧杯中调制由dGMP 1.44mmol，葡萄糖0.068mol，酿酒酵母90g，风干处理，硫酸镁14.96mmol，磷酸二氢钠0.03mol，乙二醇3mL，曲拉通X-1006mL和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应12小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dGTP进行定量分析，转化液中含dGTP1.13g/L，dGTP的得率达到46.4％(mol计)。
实施例8利用dTMP制备dTTP。
在容量为500ml的烧杯中调制由dTMP 1.50mmol，葡萄糖0.09mol，异酒香酵母150g，硫酸镁14.96mmol，磷酸二氢钠0.036mol，乙醛3mL，甲苯3mL和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至8.0，于30℃条件下低速搅拌反应10小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dTTP进行定量分析，转化液中含dTTP 0.84g/L，dTTP的得率达到34.8％(mol计)。
实施例9利用dTMP制备dTTP。
在容量为500ml的烧杯中调制由dTMP 1.64mmol，葡萄糖0.10mol，酿酒酵母100g，风干处理，氯化镁6.89mmol，氯化钾8.05mmol，磷酸二氢钠0.036mol，乙醛3mL，丙三醇3mL，丙酮6mL和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至7.0，于30℃条件下低速搅拌反应10小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对dTTP进行定量分析，转化液中含dTTP 0.95g/L，dTTP的得率达到36.0％(mol计)。
权利要求
1.一种全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于以脱氧核苷一磷酸和磷酸根离子为底物，以糖为能量供体，利用有透性的酵母细胞，在化学效应物质的存在下建立高效的能量自耦联和再生系统来制备脱氧核苷三磷酸。
2.根据权利要求1所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的脱氧核苷三磷酸是指脱氧腺苷三磷酸dATP、脱氧鸟苷三磷酸dGTP、脱氧胞苷三磷酸dCTP和脱氧胸苷三磷酸dTTP中的任意一种，其结构式如下
3.根据权利要求1所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的脱氧核苷一磷酸是指脱氧腺苷一磷酸dAMP、脱氧鸟苷一磷酸dGMP、脱氧胞苷一磷酸dCMP、和脱氧胸苷一磷酸dTMP中的任意一种，其结构式如下
4.根据权利要求1所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的脱氧核苷一磷酸的起始反应浓度为1～100mM；所述磷酸根离子起始反应浓度为0.01～1.0M；糖的起始反应浓度为0.1～1.0M；所述的糖为葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖。
5.根据权利要求1所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的化学效应物质是指金属离子和有机化合物的组合；所述的金属离子为Mg2+和K+中的任意一种或两种的组合；所述的有机化合物为乙醛和多元醇中的任意一种或两种的组合；Mg2+起始反应浓度为1～100mM，K+起始反应浓度为1～100mM，Na+起始反应浓度为1～100mM，乙醛起始反应浓度为10～80mL/L，多元醇起始反应浓度为5～100mL/L。
6.根据权利要求5所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的多元醇为乙二醇、丙三醇、山梨醇或甘露醇。
7.根据权利要求1所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的酵母细胞为酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中的任意一种，酵母的使用量为按湿菌体计100～800g/L。
8.根据权利要求7所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的酵母细胞为酿酒酵母、近平滑假丝酵母、面包酵母、奥默列氏毕赤酵母、白色球拟酵母、类球形德巴利酵母、鲁氏接合酵母、马克斯克鲁维酵母、杰丁汉逊酵母或异酒香酵母。
9.根据权利要求1、7或8所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞，所述化学、物理或生物方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。
10.根据权利要求9所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或阴离子表面活性剂，使用浓度为0.1～50g/L。
11.根据权利要求9所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述的有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪酶、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1～50ml/L。
12.根据权利要求1所述的全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，其特征在于所述制备脱氧核苷三磷酸的反应在水溶液中进行，在pH 5.0～9.0、20～50℃条件下反应2～24小时。
全文摘要
本发明公开了一种全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术，是以脱氧核苷一磷酸dNMP和磷酸根离子为底物，以糖为能量供体，利用有透性的酵母细胞，在化学效应物质的存在下反应来制备脱氧核苷三磷酸。本发明通过运用全细胞催化和代谢工程的原理，采用化学效应物质调控代谢流量，建立了高效的能量自耦联和再生系统，最终实现脱氧核苷三磷酸的高效制备。本发明克服了传统脱氧核苷三磷酸生产工艺的不足，具有工艺简单、转化率高、成本低，以及污染小等特点。
文档编号C12R1/78GK101768617SQ20101902602
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者应汉杰, 姚月兰, 熊健, 陈勇, 柏建新, 苑巍, 张磊 申请人:南京工业大学, 南京同凯兆业生物技术有限责任公司