改进的2-酮基-l-古洛糖酸的生产的制作方法

专利名称：改进的2-酮基-l-古洛糖酸的生产的制作方法
改进的2-酮基-L-古洛糖酸的生产本发明涉及用于生产2-酮基-L-古洛糖酸O-KGA)和/或L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)的重组微生物(特别是GluconcAacter属的)的产生，其中该微生物已被修饰，以过量表达L-山梨糖脱氢酶(SDH)。该过量表达已通过将编码SDH的多核苷酸的一个或多个拷贝引入宿主微生物的基因组中来实现，这导致较之未经修饰的微生物而言 2-KGA和/或维生素C生产的产率、产量和/或效率提高。sdh的所述一个或多个额外拷贝的表达依赖于整合位点。本发明还涉及经遗传工程改造的微生物和它们用于生产2-KGA和 /或维生素C的用途。维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素 C 生产的发展被概括于 Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Vol. A27(1996)，pp.547ff 中。2-KGA是用于生产L-抗坏血酸的重要的中间体。已知AcetcAacter属、 Gluconobacter属或I^seudomonas属的微生物可用于从D-山梨糖醇生产2-KGA。这些微生物能在生产2-KGA的需氧条件下氧化D-山梨糖醇。可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从L-山梨糖起始来生产2-KGA，或者通过属于GluconcAacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-KGA。底物(例如D-山梨糖醇)向2-KGA的转化是涉及若干种酶(例如若干种脱氢酶) 的多步工艺。D-山梨糖醇向L-山梨糖的转化，例如是通过D-山梨糖醇脱氢酶(SLDH)催化的。L-山梨糖被进一步转化为L-山梨糖酮，这由L-山梨糖脱氢酶(SDH)催化。最后， L-山梨糖酮被转化为2-KGA，该步骤通过L-山梨糖酮脱氢酶(SNDH)催化。2-KGA再被还原为L-艾杜糖酸，L-艾杜糖酸由L-艾杜糖酸脱氢酶氧化回2-KGA (Hoshino et al. Agric. Biol. Chem. Vol. 54，No. 9，p. 2257-2263,1990)。或者，L-山梨糖酮还可被直接转化为维生素C，该步骤是通过另一类型的SNDH催化的。可通过，例如增加转化过程中涉及的酶的活性，来增加从给定底物进行的2-KGA 和/或维生素C生产。一种已被选择作为用于此类实验的目标的酶是SDH。当在给定的微生物中增加SDH-活性(例如通过引入sdh的多个拷贝)时，人们能增加目标产物(例如 2-KGA或维生素C)的产量。但是，目标产物的产率仍可被改进。本发明的一个目标是改进2-KGA和/或维生素C生产的产率和/或生产能力。令人吃惊地，我们现在发现，在携带sdh的多个额外拷贝的宿主细胞中，2-KGA和/ 或维生素C生产的增加强烈地依赖于宿主细胞基因组中的整合位点。已选择了合适的基因座，其中对各基因的打断(用于sdh的整合)不对2-KGA和/或维生素C生产负面影响。
具体地，本发明的目标是产生下述微生物(例如Gluconobacter，优选 Gluconobacter oxydans)，所述微生物是编码SDH的基因的二倍体，以作为通过过量表达 sdh来增加L-山梨糖到L-山梨糖酮的氧化的手段。本发明涉及sdh基因的一个或多个拷贝向G. oxydans的基因组的引入，以及其使用不同的启动子的表达。合适的整合位点和启动子显示出改进了 SDH的表达。可用于本发明的编码SDH的多核苷酸可选自已知的编码SDH的基因，例如在EP 1846553中公开的，其已从Gluconobacter oxydans DSM 17078分离出。因此，本发明涉及整合于合适的宿主细胞的基因组中的编码SDH蛋白的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链， 其中所述多核苷酸选自下述组，所述组由(a)编码包含根据SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(C)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有山梨糖脱氢酶的活性；(e)编码山梨糖脱氢酶的多核苷酸，其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码山梨糖脱氢酶的多核苷酸，其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同；构成。根据SEQ ID NO 1的多核苷酸，可使用根据SEQ ID NO :3和4的引物通过PCR获得的多核苷酸，编码根据SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸、编码根据SEQ ID NO :2的多肽的含有经保守取代的氨基酸残基的片段/衍生物的多核苷酸，编码SDH并在严谨条件下与SEQ ID NO :1杂交的多核苷酸，或与所述多核苷酸至少70、85、90或95%相同的多核苷酸被详细描述于EP 1846553中，特别参见所述参考文献的第17页第6行到第观页第23行。示于 SEQ ID NO :1 中的 sdh 已从 G. oxydans DSM 17078 分离出。可用于本发明的目的的另一 SDH是从G. oxydans T-100分离的多核苷酸，其公开于 EP 753575 中，或被 Saito 等人(Applied and Environmental Microbiology, Vol. 63, No. 2，p. 454-460，1997)描述过。可用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得，例如，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Germany、American Type Culture Collection (ATCC), P. 0. Box 1549, Manassas, VA 20108USA 或 Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan (以前是 Institue for Fermentation, Osaka(IFO),17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686，Japan)。保藏至IFO的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans (以前被禾尔为 G. melanogenus) IF03293>Gluconobacter oxydans (以前被禾尔为 G. melanogenus)IF03292、Gluconobacter oxydans (以前被禾尔为 G. rubiginosus) IF03244、Gluconobacter frateurii (以前被禾尔为 G. industrius) IF03260、Gluconobacter cerinus IF03266、 Gluconobacter oxydans IFO 3287 禾口 Acetobacter aceti subsp. orleanus IFO 3259,上述这些都于1卯4年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693 和 1977 年 12 月 8 日保藏的 Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13773。菌株Acetobacter sp. ATCC 15164也是优选细菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans (以前被称为G. melanogenus)N44-1是优选细菌的另一个例子，其是菌株 IFO 3293 的衍生物，在 Sugisawa et al.，Agric, Biol. Chem. 54 1201-1209， 1990中对其有所描述。此外，还可使用Gluconobacter oxydans (以前被称为G. albidus) IFO 3250> Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. albidus) IFO 325U Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. albidus) IFO 3253、Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. suboxydans) IFO 3255、Gluconobacter oxydans (以前被禾尔为 G. cerinus) IFO 3263、 Gluconobacter oxydans (以前被禾尔为 G. cerinus) IFO 3264>Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. cerinus) IFO 3265、Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. cerinus) IFO 3267、 Gluconobacter oxydans (以前被禾尔为 G. cerinus) IFO 3268、Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. cerinus) IFO 3269、Gluconobacter oxydans (以前被称为 G. melanogenus) IFO 3294、Gluconacetobacter Iiquefaciens (以前被禾尔为 Acetobacter liquefaciens) IFO 12257 禾口 Gluconacetobacter liquefaciens (以前被禾尔为 Acetobacter liquefaciens) IFO 12258。特别地，本发明提供了用于直接生产2-KGA和/或维生素C的工艺，所述工艺包括将底物转化为2-KGA和/或维生素C。这例如可在包含微生物的培养基中进行，所述微生物可以是静止微生物或生长中的微生物。合适的宿主细胞和培养条件(包括可用的底物)已被描述于EP 1846553中，具体参见第8页第1行到第17页第5行，其中针对生产维生素C 概括的条件可以加以必要变更适用于2-KGA生产。优选的宿主细胞是 Gluconobacter 或 Acetobacter aceti,例如 G. oxydans、 G. cerinus、G. frateurii> A. aceti subsp. Xylinum 或 Α. aceti subsp. orleanus,优选 G.oxydans DSM 17078。在关于使用微生物进行上述工艺的方面，应当理解，上述微生物还包括此类菌株的具有同样生理属性的异名(synonym)或基原异名(basonym)，其如hternational Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义。本文中使用的对微生物的命名是 International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Union of Microbiological Societies官方接受的(在优先权申请的提交日期时)，并被其官方出版物hternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)所公开。具体白勺参考文献是 Urbance et al. , IJSEM(2001) vol 51 1059-1070，以及 IJSEMQ001) vol 51: 1231-1233 上的修订通知,其中描述了对作为 Ketogulonicigenium vuIgare 的 G. oxydans DSM 4025的分类学上的重新归类。本文中使用的静止细胞指下述微生物的细胞，所述微生物例如是存活但不能活跃生长的，或者是以低的比生长速率[μ]生长的，例如，低于0.021Γ1的生长速率，优选地，低
5于0. Oir10显示出上述生长速率的细胞被称为“静止细胞模式”。在关于使用微生物进行上述工艺的方面，在生长阶段中，比生长速率例如为至少 0. 021Γ1。对于以分批、补料分批或半连续模式生长的细胞而言，生长速率取决于，例如，生长培养基的组成、PH、温度等。通常，生长速率可以例如在大约0.05至大约o.ar1的范围内， 优选地，在大约0. 06至大约0. 151Γ1的范围内，最优选地，在大约0. 07至大约0. I^T1的范围内。本文中使用的以“静止细胞方法”进行的测量包括(i)通过本领域技术人员公知的任何方法培养细胞，(ii)从生长培养基收获细胞，以及(iii)在含有将被转化为想要的产物(例如2-KGA)的底物的培养基中，于其中细胞不再生长的条件下，温育收获的细胞 (即，在该所谓的转化步骤期间，生物质没有量上的增加)。根据本发明的另一目的，提供了上文定义的编码具有SDH活性的多肽的多核苷酸或者已用此类多核苷酸进行过遗传工程改造的微生物在生产2-KGA和/或维生素C中的用途。为使宿主微生物产生一个或多个拷贝的SDH基因(S卩，过量表达该基因)和/或蛋白而进行的修饰包括使用强启动子，或者对SDH基因(的部分)或其调控元件加以突变 (例如，插入、缺失或点突变)。其还包括将基因的多个拷贝(或仅单拷贝)插入到合适的微生物中，所述微生物可有或可没有SDH基因。如果基因的转录水平较之野生型基因有所增强，那么认为该基因被“过量表达”。这可通过例如对mRNA的量加以定量的Northern印迹分析来测量，mRNA的量被用作为对基因表达的指示。在本文中，如果产生的mRNA的量较之野生型基因产生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200% 或者甚至超过500%，那么基因是过量表达的。本发明包括改变微生物的步骤，其中，本文中使用的“改变”包括下述工艺，该工艺以使得发酵产物(特别是2-KGA和/或维生素C)的产率和/或生产能力较之野生型微生物有所提高的方式来进行“遗传改变”或“改变细胞培养基的组成和/或改变用于培养的方法”。本文中使用的“2-KGA和/或维生素C的提高的产率”表示较之野生型微生物(即， 没有被遗传改变的微生物)而言增加至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、 200%或者甚至超过500%。当使用不具有功能性sdh基因的微生物并通过整合到本发明示例的整合位点将sdh基因引入时，2-KGA和/或维生素C的产率可从没有产量提高到显著水平，这在下文中示出。在关于使用微生物进行上述工艺的一个方面，本发明的工艺导致2-KGA的产率通常为至少约1. 8g/l、优选至少约2. 5g/l、更优选至少约4. Og/Ι和最优选至少约5. 7g/l或超过66g/l。在一种实施方式中，通过本发明的工艺生产的2-KGA的产率在大约1. 8g/l到 600g/l的范围内。2-KGA的产率指直接来自生产容器的收获流(即包含2-KGA的不含细胞上清液)中2-KGA的浓度。术语“遗传工程改造”或“遗传改变”表示对活的生物体(即微生物)中遗传物质结构的科学改变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地，这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程改造或修饰的生物。遗传工程改造可通过本领域已知的多种技术来进行，例如，基因替换，基因扩增，基因打断，使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的微生物，例如，经遗传修饰的微生物通常还被称作重组微生物。
本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供，优选地，被纯化至均质。术语“经分离的”表示物质被移出其原来的环境(例如，如果其天然存在的话，就是天然环境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是这样的DNA或RNA，它们与从中获得该多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两条编码序列(5’末端一条，3’末端一条)并非紧密相邻。因此，在一种实施方式中，核酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。术语“经分离的多核苷酸”因此包括，例如，加入到载体中、加入到自主复制质粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括是杂合体基因的一部分的重组DNA，所述基因编码基本不含细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学物质(当通过化学方式合成时)的额外多肽。此外，“经分离的核酸片段”是这样的核酸片段其天然并不作为片段存在，并且将不会在天然状态被发现。术语“同源性”或“相同性百分比，，在本文中可互换使用。就本发明的目的而言， 在此定义为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比，本着最优比较的目的 (例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对)，对序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％相同性=相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数X 100)。优选地，这两条序列长度相同。技术人员会知道有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间相同性百分比的确定。在一种优选的实施方式中，使用 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. (48) :444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG软件包(可从http://WWW. accelrys. com获得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到上述的所有不同参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体％相同性不会有显著改变。在又一种实施方式中，使用GCG软件包(可从http://WWW· accelrys. com获得)的 GAP程序来确定两条核苷酸序列间的相同性百分比，其中使用NWSgapdna. CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E. Meyers 和W.Miller(CABI0S，4 :11-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2. 0版)(可从http://vega. igh. cnrs. fr/ bin/align-guess. cgi获得)中，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度惩罚(penalty)为12，缺口惩罚为4。本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列，，来进行针对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用AltschUl，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. 0版)来进行此类搜索。可以用 BLASTN程序，以分数=100，字长(word length) = 12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分数=50，字长=3来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用 Altschul et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如 BLASTX 禾口 BLASTN)的缺省参数。见 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。待整合进合适的宿主细胞的sdh基因可被可操作地连接到合适的启动子上，启动子可以是组成型启动子或可诱导的启动子。技术人员知道如何选择合适的启动子。表达构建体可以含有用于转录起始、终止的位点，还可在转录区域含有核糖体结合位点，以用于翻译。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可优选包括处于起点的起始密码子，以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。有用的启动子和将所述启动子克隆进合适的载体的方法被描述于例如Mito等人(见前文)或EP 453575中。优选地，启动子可从I^sndh 和PtufB选择。此外，可使用对所选择的宿主起作用的任何启动子。可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入合适的宿主细胞中。本文中使用的术语“转化”、“转桥联(transconjugation) ”和“转染”意指本领域内已知的、用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的多种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook，et al.(上文所述的)，Davis et al. ,Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。为对已将外源DNA整合进它们基因组的细胞进行鉴定和选择，通常，将编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物(例如卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素和链霉素)抗性的那些。编码选择标记的核酸优选在与编码根据本发明的蛋白的载体相同的载体上引入宿主细胞，或者其可在单独的载体上引入，例如该载体例如是自杀性载体，其不能在宿主细胞中复制。可通过药物选择鉴定出经过引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已合并有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞会死亡)。可选择地，通过使用其技术为本领域技术人员熟知的sacB系统的方法，此选择标记在外源DNA整合进基因组后可被去除。术语“产量”或“生产能力”是本领域已知的，其包括给定的时间和给定的发酵体积中形成的发酵产物(例如2-KGA和/或维生素C)的浓度(例如，每升每小时的kg产物)。 术语“生产效率”包括获得的特定水平的生产所需要的时间(例如，细胞达到发酵产物的特定速率输出所需时间有多长)。术语“产率”是本领域已知的，其包括碳源向产物(即， 2-KGA和/或维生素C)转化的效率。这通常写作，例如，kg产物/kg碳源。“增加”化合物的“产率和/或产量和/或生产能力”表示，给定的时间中给定量的培养物中回收的该化合物分子或回收的该化合物有用分子的量增加。术语“生物合成”或“生物合成途径”是本领域已知的，其包括通过细胞，以可能是多步骤且被高度调控的过程，从中间产物化合物对化合物(优选地，有机化合物)的合成。措辞“代谢”是本领域已知的，其包括对生物中发生的生化反应的总称。然后，特定化合物的代谢(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代谢)包含细胞中与该化合物相关的总的生物合成、修饰和降解途径。措辞“转运”或“运入”是本领域已知的，其包括一种或多种分子在协助下移动经过该分子本来不能经过或不能高效经过的细胞膜。本发明与对2-KGA和/或维生素C的发酵生产中涉及的一种关键酶的过量表达 (即SDH的过量表达)有关。“SDH的过量表达”包括将sdh的一个或多个额外拷贝引入本文所定义的合适的微生物中，其中所述一个或多个拷贝被整合进宿主细胞的内源性质粒或染色体上的基因座中，该整合不会抑制微生物生长和sdh基因的表达。用于测量SDH活性的检验被描述于例如Saito等人的(见前文)或Sugisawa等人的(Agric. Biol. Chem. 55， ρ· 363-370，1991)中。在一种实施方式中，sdh的一个或多个额外拷贝已被整合进L-山梨糖还原酶(SR) 基因的基因座中。SR催化L-山梨糖向D-山梨糖醇的转化，其已被，例如Siinjoh等人 (Journal of Bacteriology，Vol. 184，No. 3，ρ· 861-863，2002)或在 EP 1859031 中描述过。在另一实施方式中，sdh的一个或多个额外拷贝已被整合进2-KGA还原酶(KR) 基因的基因座中，其在例如 Hoshino 等人(Agric. Biol. Chem. 54，p. 1211-1218，1990)和 Manning等人(USP 5082785)中描述过，他们没有指出将SDH基因引进用Tn5打断的基因中而导致无KR活性的实例。在另一实施方式中，sdh的一个或多个额外拷贝的已被整合进葡糖脱氢酶(⑶H) 基因的基因座中。编码⑶H的基因已在例如EP 1931785或EP 1934337中描述过。在一个具体的实施方式中，sdh的一个或多个额外拷贝已被整合进细胞色素bd氧化酶(CydB)基因的基因座中。涉及电子传递系统并可被用于实施本发明的此类酶的例子被描述于WO 2006/084730中。特别地，sdh的一个或多个额外拷贝被引入GluconobacteH特别是 Gluconobacter oxydans，优选G. oxydans DSM 17078)中，其中优选地，在上述整合位点/ 基因座(即，sr、kr、gdh和/或cydB)中的至少一个中发生整合。用于将外源DNA整合进微生物中的方法(例如Gluconobacter oxydans)是本领域已知的，并且其被示例于在实施例中。已令人吃惊地发现，sdh整合进kr、gdh或cydB基因座导致2-KGA与相关的产物 (例如L-山梨糖酮、维生素C和L-艾杜糖酸)一起的高产量。而将sdh整合进sr基因座， 获得了非常低的2-KGA和相关产物的产量。含有sdh盒的整合构建体可再与代替天然启动子I^sndh的启动子(例如PtufB)结合。但是，已证明，当使用其中sdh基因已被打断的菌株(例如得自G. oxydans DSM 17078 的菌株6020 )时，在本文描述的染色体的sdh整合方面，Psndh是最好的启动子。可通过本领域已知的方法，特别是通过本文描述的薄层色谱法(TLC)或高效液相色谱法(HPLC)分析，来进行对2-KGA或维生素C的产量的测量。天然存在的任何启动子或衍生物可用于在合适的宿主微生物中表达sdh基因。本文中使用的维生素C可以是水性溶液中发现的L-抗坏血酸的任何化学形式，例如未离解的、以其游离酸形式存在的或离解为阴离子的。L-抗坏血酸的溶解的盐形式的特
9征为在通常发现于发酵上清液中的任何种类的阳离子(例如，钾、钠、铵或钙)存在时的阴离子。还包括在内的可以有L-抗坏血酸的游离酸形式的经过分离的晶体。另一方面，用其相应的盐的名称来命名L-抗坏血酸的盐形式的经过分离的晶体，即抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸钙等。可用于将sdh整合进宿主细胞基因组中而不带入载体部分的载体是本领域已知的。此类有用的载体的一个具体的例子是dK18(见http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ nuccore/207845)。在本发明中有用的载体可以是自杀性质粒，其不能在作为宿主的微生物中复制，或当质粒具有温度敏感性复制起点时不能在一定条件(例如较高的温度，例如 420C )下复制的质粒。本领域的技术人员将意识到，用于整合期望的多核苷酸而没有载体部分的载体的设计可能取决于以下因素例如对将被转化的宿主细胞的选择，期望的蛋白质的表达水平等。本发明的用于整合的载体(下文中为整合载体)可被引入宿主细胞中，由此以协助用具有整合位点基因的上游和下游侧翼序列的期望的多核苷酸片段替换整合位点基因。该事件可通过下述两种方法中的任一种来完成(1)在上游和下游侧翼序列上同时发生双交换事件。(2)通过在上游和下游侧翼序列之一上进行第一次单交换事件，然后在另一侧翼序列上进行第二次单交换事件以缺失整合载体的载体部分，将具有期望的多核苷酸片段的整合载体一次整合到染色体或内源质粒中。两种方法最后都产生具有替换整合基因序列的期望的多核苷酸片段序列的重组微生物。本发明中期望的多核苷酸片段序列可被引入宿主细胞中，由此生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，其包括但不限于本文所述的核酸编码的突变体蛋白、其片段、其变体或功能等同物以及融合蛋白，例如，SDH蛋白、SDH蛋白的突变体形式、融合蛋白等。本发明的有利的实施方式通过从属权利要求而显而易见。根据本发明的教导，本领域技术人员将明白本发明的上述和其它方面以及上述和其它实施方式。将通过下述实施例进一步阐述本发明，所述实施例不应被理解为起限制作用。本文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容都通过引用并入本文。图例

图1具有侧翼区域FRl和FR2片段的载体的构建。用于PCR的引物表示为p7_pl0。图2Ampr_Psndh和sdh盒的构建。用于PCR的引物表示为pl_p6(SEQ ID NOs 21-26)。图3使用pK18: :FR1_FR2构建整合载体。图4针对Amp^promotei^sdh盒的整合位点的替换。产生的质粒在右边示出。图5验证实施例3的不同的构建体的PCR方案。图6根据SEQ ID NO 1多核苷酸序列，即从G. oxydans DSM 17078分离的sdh。图7根据SEQ ID NO 2的氨基酸序列，即从G. oxydans DSM 17078分离的SDH0图8根据SEQ ID NO :3和4的多核苷酸序列，即用于扩增根据SEQ ID NO=I的sdh 的引物。
实施例
实施例1 携带 Gluconobacter oxydans DSM 17078 的 L-山梨糖脱氢酶(SDH)基因的整合载体的构建下述整合位点已被选择作为用于在Gluconobacter oxydans DSM 17078中整合 sdh基因的额外拷贝的靶基因(a)山梨糖还原酶(sr)基因座、(b)葡糖脱氢酶(gdh)基因座、(c)2-KGA还原酶(kr)基因座和(d)细胞色素bd氧化酶(cydB)基因座。在pK18上克隆将被敲除的靶基因的侧翼区域FRl和FR2。为了稍后切割整合盒，设计了 HindIII和 XbaI位点。在第一轮PCR(High Fidelity系统Roche Diagnostics，以本领域技术人员已知的标准条件，例如“94°C变性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸1分钟的35个循环”进行)，设计引物对p7/p8，来制备具有FR2的5'-末端的部分序列的FR1，以及设计引物对p9/pl0来制备具有FRl的3'-末端的部分序列的FR2。然后使用引物对p7/pl0，在第二轮PCR(HighFidelity系统Roche Diagnostics,以本领域技术人员已知的标准条件，例如“94°C 2分钟，10个循环的[94°C 30秒，63°C 30秒，68°C 6分钟]，接着是20个循环的 [940C 30秒，63°C 30秒，68°C 6分钟以及每个循环额外的20秒]以及在68°C最后延伸10 分钟”来进行)中将第一轮PCR的两种产物连接。G. oxydans DSM 17078的基因组DNA被用作模板。在FRl和FR2的连接处，设计MlI和SpeI限制性位点，以插入即将被分别制备的Amp-promoter-sdh基因片段。实验的示意图在图1中表示。针对不同的整合位点，使用下述引物序列p7_cydB(SEQ ID NO 17) :ctcgagaagcttcaagatcgccatcccctatctgp8_cydB (SEQ ID NO :18)gtccgtattcgatccgcatgggtcgactctcactagtgttcttactccgccatgccagcp9_cydB (SEQ ID NO :19)gctggcatggcggagtaagaacactagtgagagtcgacccatgcggatcgaatacggacplO_cydB(SEQ ID NO :20) :ctcgagtctagatgtcctgttcagtctggggtg构建了命名为pK18: :sr、pK18: :kr、pK18: :gdh 和 pK18: :cydB 的四种整合载体。 载体被引入G.oxydans DSM 17078中，通过测序验证了 FR1_FR2片段对靶基因的替换。含有sdh基因的额外拷贝和强启动子Psndh的整合盒被如下构建用图2中示出的流程，通过PCR制备具有SpeI和ClaI限制位点的amp^Psndh盒。同时，制备了具有ClaI 和SalI位点的sdh基因盒。使用的PCR引物(见图2)如下pi(SEQ ID NO :21) :ctcgagactagtaaacttggtctgacagttaccp2 (SEQ ID NO :22):gtcagggacgctgaggccactcgagccgctcatgagacaataaccctgp3(SEQ ID NO :23) :ctgactcgagtggcctcagcgtccctgacp4(SEQ ID NO :24) :ctcgaatcgataactaactcctgtgcgaactatggtgcp5 (SEQ ID NO :25):gcaccatagttcgcacaggagttagttatcgatgacgagcggttttgattacatcgp6(SEQ ID NO :26) :ctcgaggtcgactcaggcgttcccctgaatgaaatcAmp^Psndh和sdh盒被克隆进上述4个整合载体中，验证了完整的序列。产生的载体被命名为 pK18: :sr-ampr_Psndh_sdh、pK18: kr_ampr_Psndh_sdh、pK18: :gdh_ampr_ Psndh_sdh 和 pKl8: : cydB_ampr_Psndh_sdh (见图 3)。实施例2 :用组成型启动子替换Psndh为了进一步改进sdh的表达，将实施例1的整合载体与组成型启动子PtufB组合(Saito et al. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 63, No. 2, p. 454-460, 1997)。使用引物prim3/prim4和作为模板的G.oxydans DSM 17078的染色体DNA，通过 PCR，构建启动子片段prim3(SEQ ID NO 45) :ctgactcgagttgaagtccgcgccgagcgprim4(SEQ ID NO :46) :ctcgagtcgactttctccaaaaccccgctc因为PtufB内部具有ClaI位点，在构建整合载体的情况下，设计AccI位点，并将其与ClaI位点连接。将PtufB与sdh基因盒组合(见实施例1)，将获得的构建体与各整合载体连接，产生下述构建体pK18: wr-amptPtufB—sdh、pK18: kr-ampr_PtufB_sdh, pK18: : gdh-ampr_PtufB_sdh、ρΚ18: : cydB-ampr_PtufB_sdh。所述方法在图4中被示意性概括出。实施例3 将整合盒转化进G. oxydans G02026中已获得了全部8个不同的整合载体(见实施例1和2)，其被用于G.oxydans G02026(基于G. oxydans DSM17078的图变体，其中天然sdh基因已被敲除)的感受态细胞的转化。没有进行纯化步骤的单切割载体直接被用于转化G.oxydans G02026，其中用 EcoRI 将 pK18: :sr-Ampr_Psndh_sdh 线性化，并用 BglII 将 pK18: :kr(gdh 或 cydB)-Ampr_ Psndh_sdh 线性化。将DNA片段(IOOng或400ng)添加到50 μ 1的感受态G. oxydans G02(^6细胞中。 电穿孔脉冲设置为1.7kV、25yF*100Q。电穿孔之后，将细胞悬浮进Iml的MB培养基， 在下振荡QOOrpm)温育3小时，将250 μ 1的细胞培养物涂布于含有Km和Amp (每种 40 μ g/ml)的MB琼脂平板(含有组成型启动子的转化子含有50 μ g/ml Km和40 μ g/ml Amp的MB琼脂平板)和含有40 μ g/ml Km和20 μ g/ml Amp的那些MB琼脂平板上。在27 °C 下温育3天后，菌落被转移到含有40 μ g/ml Km和30 μ g/ml Amp的MB (液体培养基)中， 在下振荡(150rpm)培养2天。使用转化子的染色体DNA，通过PCR扩增整合部分周围的4个不同基因座，来验证整合事件(见图5)。使用下述引物对进行四套不同的PCR流程㈧到(D)。(A)进行PCR，以验证整合位点的缺乏针对 sr (SEQ ID NO 27 禾口 28)的 sr_fwd (cgccggactgggcgatcgttgg)禾口 sr_ rev (gccttttccagcgggggacgacca)针对 kr (SEQ ID NO 29 禾口 30)的 kr_fwd (tcgcaaccacccagaacac)禾口 kr_ rev (tgtccacgaccagattagcca)# gdh(SEQ ID NO :31 禾口 32)的 gdh_fwd(aatcgtcccggctccggaaa)禾口 gdh_ rev(gcttgccgttgatcgcataggtg)针对 cydB(SEQ ID NO 33 禾口 34)的 cydB_fwd(agcttcgactggttctcc)禾口 cydB_ rev(agtacgaataggccgtgtag)(B)进行PCR，以验证FRl位点上的重组sr_FRl_ 上游(gcatggaccagcttctcaagagcg ；SEQ ID NO :35)禾口 amp_ fwd(ttgctcacccagaaacgctggtg ；SEQ ID NO 39)kr_FRl_ 上游(catgtgctggaacgtgaaattgc ；SEQ ID NO 36)禾口 amp_fwdgdh_FRl_ 上游(caatgcgatagttcgtggacg ；SEQ ID NO 37)禾口 amp_fwdcydB_FRl_ 上游(ggcattccggacatgaagaacg ；SEQ ID NO 38)禾口 amp_fwd(C)进行PCR，以验证FR2位点上的重组sdh_ 内部 _fwd(gtcatcgggtgttcctgatctc ;SEQ ID NO :40)和 sr_FR2_ T 游 (gatttcctgcagcgcgtgcacc ；41)sdh_ 内部 _fwd 禾口 kr_FR2_ 下游(acggcatgaattatggaacggttg ；SEQ ID NO :42)sdh_ 内部 _fwd 禾口 gdh_FR2_ 下游(ggtcgatctgacagaggacggt ；SEQ ID NO 43)sdh_ 内部 _fwd 禾口 cydB_FR2_ 下游(gtgtcgtatgtggttcccgagg ；SEQ ID NO 44)(D)进行PCR,以验证启动子(例如Psndh :p3和p6)的存在实施例4 静止细胞反应中的2-KGA生产通过静止细胞反应系统，分析整合体(见实施例3)的2-KGA生产能力。通过 TLC (薄层色谱法)和HPLC (高效液相色谱法)分析2-KGA和其它代谢产物。将实施例3中获得的整合体在含有Km和Amp每种40 μ g/ml的MB琼脂平板上
13接种，并在27°C下温育3天。再将菌落完全涂布于具有含有Km和Amp每种40 μ g/ml的 No. 3BD-7%山梨糖醇琼脂培养基的培养皿上，并在27°C下温育3天。然后回收细胞物质， 将其在500 μ 1的无菌水中悬浮，适当稀释，然后测量600nm下的OD。最后，制备0D_ = 20 的细胞悬浮液，将其用于静止细胞反应。反应混合物由250 μ 1的细胞悬浮液(0D_ = 20)、 50 μ 1的20%山梨糖溶液、125 μ 1的4%CaC03+1.2%NaCl溶液、75μ1的无菌水构成。反应混合物在30°C下振荡O20rpm)温育20小时。将反应混合物离心，并回收上清液用于TLC 分析。或者，将上清液与等体积的0. OlM 混合并冷冻，直到HPLC分析。对于TLC 分析，使用正丙醇H2O 1 % H3PO4 HCOOH = 40 10 1 1 的溶剂， 将2μ 1 的样品或标准物(10mg/ml)应用到 TLC 平板(Merck Silica gel 60 F254 5x20cm) 上，对四元碱(tetrabase)、四唑蓝(bluetetrazolium)禾口间萘二酚(naphtoresorcinol)的检测按照下文所述进行四元碱喷雾0. 5% KIO4,良好风干，随后将经四元碱饱和的溶液喷雾进2N乙酸15% MnS04(处于水中)=1 1。四唑蓝将0.5%的四唑蓝喷雾进MeOH 6N NaOH = 1 1中，并在100°C加热。间萘二酚将0. 2%间萘二酚喷雾进KOH &H2S04 = 50 1中，随后在100°C加热。对于所有被测试的整合体，在TLC上检测到了 2-KGA和/或维生素C与L-山梨糖酮和艾杜糖酸一起被生产，这表示通过将不同的构建体整合进突变菌株G. oxydans G02(^6，对SDH活性产生了再活化。用具有与Aminex-HPX-78H(300x 7. 8mm)柱(Biorad, Reinach, Switzerland)相的 LiChrospher-100-RP18(125x 4. 6mm) ft (Merck, Darmstadt, Germany)的 Agilent
1100HPLC 系统(Agilent ^Technologies，Wilmington，USA)，进行 HPLC 分析。移动相为 0.004M硫酸，流速为0.6ml/min。用UV探测器(波长254nm)组合折射系数探测器，记录了 2 个信号。此外，使用氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II，YMC，he. ,Kyoto，Japan)，在 254nm 处进行UV探测，来进行对L-抗坏血酸的鉴定。移动相为50mM NH4H2PO4和乙腈 60)。HPLC检验验证了 sdh盒(包括作为启动子的Psndh)在所有四个整合位点—— sr、kr、gdh和cydB中的整合，导致了 2-KGA和/或维生素C与L-山梨糖酮和艾杜糖酸一起被生产。整合体生产的SDH-相关产物(L-山梨糖酮、2-KGA、维生素C、L-艾杜糖酸)在由G. oxydans DSM 17078生产的这些产物的30%到80%的范围内，但宿主菌株G. oxydans G02026不产生它们中的任何一种。使用kr、gdh和cydB基因的sdh盒的整合尤其适于生产2-KGA和/或维生素C，但使用sr基因没有那么适合。包括PtufB作为启动子的sdh盒的整合也导致当其被整合进kr、gdh和cydB基因时，SDH相关产物的产生在由G. oxydans DSM 17078产生的那些的1-5%的范围内。
权利要求
1.重组微生物，其包含整合的多核苷酸片段，所述片段含有编码具有L-山梨糖脱氢酶 (SDH)活性的蛋白的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述多核苷酸选自下述组，所述组由(a)编码包含根据SEQID NO 2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组 DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应来获得；(d)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SDH多肽的活性；(e)编码SDH多肽的多核苷酸，所述多核苷酸的互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码SDH多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同；构成并且其中所述多核苷酸被整合进重组微生物的基因组中。
2.根据权利要求1的重组微生物，其中所述sdh基因进一步与外源启动子序列组合。
3.根据权利要求1或2中任一项的重组微生物，其中所述sdh基因被整合进内源质粒或染色体上的基因座中，其整合不抑制所述微生物的生长和所述sdh基因的表达。
4.根据权利要求1到3中任一项的重组微生物，其中在所述染色体上的所述基因座选自针对L-山梨糖还原酶、2-酮基-L-古洛糖酸还原酶、葡糖脱氢酶和细胞色素bd氧化酶的基因座构成的组。
5.根据前述任一项权利要求的重组微生物，其中所述微生物选自Gluconobacter、 Gluconacetobacter 禾口 Acetobacter0
6.根据权利要求5的重组微生物，其是Gluconobacteroxyckns，特别是 Gluconobacter oxydans DSM 17078。
7.用于产生重组微生物的方法，所述方法包括下述步骤(a)产生整合载体，所述载体包含下述多核苷酸片段，所述片段具有L-山梨糖脱氢酶基因盒的一个或多个拷贝以及整合位点的上游和下游侧翼多核苷酸序列，和(b)产生推定的整合位点基因的敲除，这通过将(a)的整合载体引入微生物中，用根据权利要求1或2的多核苷酸片段替换所述整合位点基因来实现。
8.根据权利要求7的方法，其中在步骤(a)之后，在所述L-山梨糖脱氢酶基因引入整合位点之前，启动子被克隆于L-山梨糖脱氢酶基因之前。
9.根据权利要求7的方法，其中在步骤(a)之后，在所述L-山梨糖脱氢酶基因引入整合位点之前，标记基因被克隆进L-山梨糖脱氢酶基因的上游或下游。
10.生产2-酮基-L-古洛糖酸和/或维生素C的方法，其中使用根据权利要求1到6 中任一项的微生物。
全文摘要
本发明涉及用于生产2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)和/或L-抗坏血酸(下文也称为维生素C)的重组微生物(特别是Gluconobacter属的)的生产，其中所述微生物已被修饰，以过量表达L-山梨糖脱氢酶(SDH)。通过将编码SDH的多核苷酸的一个或多个拷贝引入宿主微生物的基因组中，来实现该过量表达，导致较之未经修饰的微生物的2-KGA和/或维生素C生产的产率、产量和/或效率提高。sdh的所述一个或多个额外拷贝的表达依赖于整合位点。本发明还涉及经遗传工程改造的微生物和它们用于生产2-KGA和/或维生素C的用途。
文档编号C12N9/04GK102356153SQ201080010633
公开日2012年2月15日 申请日期2010年3月4日 优先权日2009年3月5日
发明者奈杰尔·约翰·芒希亚, 新城雅子, 星野达雄, 清水亚希子 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司