免疫佐剂组合物及其应用的制作方法

专利名称：免疫佐剂组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫佐剂组合物、疫苗组合物、对非人类动物的免疫方法、活化免疫细胞制剂以及所述制剂的生产方法。
背景技术：
作为与疫苗抗原的混合物来给药的佐剂激活天然免疫，并通过抗原呈递辅助诱导抗原特异性免疫应答。已知有各种用于动物实验的佐剂。一般的非生物来源的化合物由于其吸附抗原例如病原体的性质被用作佐剂，这类化合物的实例包括氢氧化钠、氢氧化铝、磷酸钙、明矾和羧乙烯聚合物。然而，这些沉淀性佐剂易于引起注射位点硬结。油性物质例如液体石蜡、羊毛脂和弗氏佐剂，由于其囊封水性抗原溶液并形成胶束的能力也被用作佐剂。然而，因为这种油基佐剂与疫苗抗原的混合物形成包含胶束的乳液，因此混合物具有高粘度，其可能引起注射疼痛并易于引起注射位点硬结。除了上述佐剂之外，几乎不引起内毒素休克等的相对安全的细菌牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis) (BCG)，也被用作佐剂。然而，BCG菌体易于在注射位点处引起溃疡。因为高效佐剂一般具有强毒性，因此一直希望开发安全有效的佐剂。JP-2008-100919-A描述了作为天然产物来源的佐剂的核酸/多糖复合物，所述复合物由具有天然磷酸二酯骨架和poly (dA)尾的CpG寡核苷酸和分子量为25000以上的 β -1，3-葡聚糖构成。该专利文献表明这种核酸/多糖复合物能够促进建立Thl细胞活性优势的细胞因子和抗体的产生，因此该复合物可用作免疫佐剂。发明概述技术问题本发明的主要目的是提供新的免疫佐剂组合物。问题的解决方案为了解决上述问题，发明人进行了广泛研究并获得下列发现(i)其中基因已被破坏的同源敲除小鼠(Zc3hl2a+小鼠)显示出浆细胞数量的增加和浆细胞向肺的浸润。小鼠还显示出血清免疫球蛋白水平升高和自身抗体生产。(ii)大多数脾脏T细胞显示出效应/记忆细胞特征，并对T-细胞受体刺激做出响应产生干扰素-Y。因此，Zc3hl2a的破坏激活获得性免疫系统，结果浆细胞和记忆性T细胞数量增加。(iii)来自k;3hl2a+小鼠的巨噬细胞显示出对TLR(Toll样受体)配体做出响应，IL-6和IL-12p40的生产大量增加。相反，TNF的生产没有对TLE配体作出响应而显著增加。因此，Zc3hl2a的破坏增加了特定细胞因子的生产。(iv) Zc3hl2a蛋白具有锌指区并与RNA结合。(v)Zc3hl2a基因含有推定的N-端核酸酶结构域，并且表达的蛋白具有核糖核酸酶活性。鉴于特定mRNA的降解有助于维持其稳态，在小鼠中Zc3hlh核糖核酸酶活性的缺失抑制了分子、包括特定细胞因子的mRNA的降解，并增加了分子的生产。(vi)总之，这些发现表明ZC3hUa基因抑制剂或蛋白抑制剂可以适合用作免疫佐剂。根据上述发现完成了本发明，并提供了下述免疫佐剂组合物、疫苗组合物、活化免疫细胞制剂和制剂的生产方法。(1)免疫佐剂组合物，所述组合物包含选自基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种作为活性成分。(2) (1)的免疫佐剂组合物，其还包含另一种免疫佐剂。(3)疫苗组合物，所述组合物包含疫苗抗原以及选自Zc3hl^i基因抑制剂和 Zc3hl2a蛋白抑制剂的至少一种。(4) (3)的疫苗组合物，其还包含另一种免疫佐剂。(5)对动物进行免疫的方法，所述方法包含向非人类动物给药( 或(4)的疫苗组合物。(6)活化免疫细胞的生产方法，所述方法包含将从对象收获的免疫细胞与选自 Zc3hl2a基因抑制剂和ZC3hUa蛋白抑制剂的至少一种进行接触、从而活化免疫细胞的步
马聚ο(7)活化的免疫细胞，所述细胞通过(6)的方法生产。(8)用于增强疫苗抗原的免疫原性的化合物，所述化合物是选自Zc3hlh基因抑制剂和ZC3hUa蛋白抑制剂的至少一种。(9)化合物在免疫佐剂生产中的应用，所述化合物是选自Zc3hl^i基因抑制剂和 Zc3hl2a蛋白抑制剂的至少一种。(10)用于增强疫苗抗原的免疫原性的方法，所述方法包含将疫苗抗原与选自 Zc3hl2a基因抑制剂和Zc3hlh蛋白抑制剂的至少一种进行混合的步骤。(11)用于激活免疫力的组合物，所述组合物包含疫苗抗原以及选自Zc3hl^i基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种。(12)组合物在疫苗组合物生产中的应用，所述组合物包含疫苗抗原以及选自基因抑制剂和ZC3hUa蛋白抑制剂的至少一种。发明的有利效果本发明的免疫佐剂组合物抑制基因或&池123蛋白的功能，从而激活获得性免疫以及天然免疫。由于大多数常规佐剂只激活天然免疫，因此本发明的免疫佐剂组合物可用作不仅激活天然免疫而且激活获得性免疫的强力佐剂。此外，因为所述免疫佐剂组合物是基因抑制剂或蛋白抑制剂，因此该免疫佐剂组合物可以被设计成核酸例如siRNA、低分子化合物等，并因此高度安全。附图简述

图1是在LPS诱导下表达的基因(LPS诱导性基因)的Northern印迹分析结果 (a)和Zc3hl2a的细胞内定位的Western印迹分析结果(b)。图加是小鼠基因(野生型等位基因)、靶向载体(靶向构建物)和靶等位基因的示意图。图2b是杂合杂交后代中的Southern印迹分析结果。图2c是用LPS刺激的野生型(WT)和巨噬细胞的RNA的RT-PCR分析结果。图3a是显示了野生型(ZC;3hl2av+)和小鼠的存活率的图。图北是来自野生型和小鼠的脾脏(上图)、肠系膜淋巴结(左下图)和腹股沟淋巴结(右下图)的照片。图3c是来自野生型小鼠的肺脏、脾脏和淋巴结的组织学照片。图4是来自野生型(WT)和小鼠的肝脏和胰腺切片的组织学照片。图5是显示了小鼠中血清免疫球蛋白水平(a)、抗核抗体和抗双链DNA 抗体生产的测量结果(b)和组织学检查结果(C)的图。图6是显示了来自小鼠的抗体染色的脾细胞的流式细胞分析结果的图。图7是显示了抗体染色的小鼠脾细胞的流式细胞分析结果的图。图8是显示了在脾脏T细胞中对⑶3/^拟8刺激做出响应而生产的干扰素-Y (a)、 IL-17(b)和 IL-4(c)的图。图9是显示了抗体染色的小鼠脾细胞的流式细胞分析结果的图。图10是显示了抗体染色的小鼠脾细胞的流式细胞分析结果的图。图11是显示了来自野生型和&池123+骨髓嵌合小鼠的抗体染色脾细胞的流式细胞分析结果的图。图1 是显示了通过ELISA测量的源自于刺激过的腹膜巨噬细胞的IL_6、 IL-12p40和TNF的浓度的图。图12b是使用源自于LPS刺激的巨噬细胞的RNA，对IL-6、 KC、TNF、I κ B α、RANTES, IP-IO和β -肌动蛋白的表达进行的Northern印迹分析结果。图13是在野生型和腹膜巨噬细胞的微阵列分析的基础上选择的LPS诱导性基因的表达的热图表示。图14是从野生型和巨噬细胞中的LPS诱导性基因的微阵列分析得到的热图表示和树状图。图15是用LPS刺激过的巨噬细胞的核提取物中，转录因子-DNA结合活性的电泳迁移率变动分析(EMSA)的结果。图16a是k;3hl2a mRNA的去稳定机制的Northern印迹分析结果。图16b是显示了剩余mRNA水平的时间过程的图。图17是Northern印迹分析的结果(a)和显示了剩余mRNA水平的时间过程的图 (b)。执行这些实验是为了通过用质粒转染HEK293Tet-off细胞来确定IL-6 3，-UTR中的 Zc3hl2a响应性区域。图18是IL-6 3’ -UTR及其缺失构建物的示意图。图19是作为RNA稳定性的度量的萤光素酶活性的测量结果。图20是IL-6 3’ -UTR及其缺失构建物的示意图。图21是与IL-6 3，-UTR(1-403)mRNA结合的检查结果。图22是突变体蛋白表达水平的Northern印迹分析(a)和免疫印迹分析 (b)的结果。图23是IL-6表达的Northern印迹分析(a)和免疫印迹分析(c)的结果，以及显示了剩余mRNA水平的时间过程的图(b)。图M是小鼠和人类k;3hl2a中N-端和CCCH结构域的序列比对。
图25是k;3hl2a的N-端结构域的结构模型。图沈是k;3hl2a的内切核糖核酸酶活性的测量结果。图27是&池123的内切核糖核酸酶活性的测量结果。图观是Northern印迹分析的结果(a)和显示了剩余mRNA水平的时间过程的图 (b)。实施方案描述下面将对本发明进行详细解释。(I)免疫佐剂组合物本发明的免疫佐剂组合物包含选自ZC3hUa基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种作为活性成分。Zc3hl2aS@Toll样受体(TLR)是识别微生物组分并唤起炎性和免疫应答的受体。TLR刺激激活了一组复杂的基因表达，调控免疫应答的幅度和持续时间。Zc3hl^i基因是可由TLR刺激诱导的免疫应答调节基因。ZC3hUa基因的碱基序列在NCBI中登记在登录号NM_025079 下。Zc3hlh基因抑制剂ZC3hUa基因抑制剂可以是任何能够抑制基因表达的物质，抑制剂的实例包括低分子化合物、核酸、蛋白质和糖蛋白。其中，由于易于用作药物，低分子化合物是优选的。此外，由于易于设计和低毒性，核酸例如siRNA、shRNA或stRNA也是优选的。 siRNA和shRNA的设计方法是公知的，并分别描述在例如Elbashir，S. M.， Harborth, J. , Lendeckel, W. , Yalcin, A. , Weber, K.禾口 Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. (21个核苷酸的RNA双链体在培养的哺乳动物细胞中介导RNA干扰。)Nature 411，494-498.；以及 Paddison, P. J. , Caudy,A. A. ,Sachidanandam,R.& Hannon,G. J. Short hairpin activated gene silencing in mammalian cells.(哺乳动物细胞中短发夹序列活化的基因沉默。) Methods Mol. Biol. 265,85-100(2004)。siRNA 和 shRNA 可以根据需要从 ABI，Dharmacon 等获得。Zc3hl2a基因抑制剂的筛选可以通过例如下述过程来进行将被测物质与试验细胞进行接触，所述试验细胞用ZC3hUa基因表达质粒和其中IL-6基因等的3’ -UTR被置于表达萤光素酶、荧光蛋白等的基因的下游的质粒进行转染；然后，使用萤光素酶测定法、荧光检测等筛选被测物质降低基因表达的能力。或者，将被测物质与用含有调控区和结构基因的Zc3hlh基因表达质粒转染的试验细胞进行接触，然后使用Western印迹、Northern印迹等筛选被测物质降低基因表达的能力。Zc3hUa蛋白抑制剂ZC3hUa蛋白抑制剂可以是能够抑制蛋白活性的任何物质，抑制剂的实例包括低分子化合物、核酸、蛋白质以及糖蛋白。其中，由于易于用作药物，低分子化合物是优选的。Zc3hlh蛋白抑制剂的筛选可以通过例如下述步骤来进行比较在存在和不存在被测物质的情况下执行的测定之间的RNA降解活性水平，并选择降低RNA降解活性的物质。具体来说，首先，如下合成重组人类&池1加蛋白。将人类基因(NCBI登录号NM_025079)插入到质粒例如pGEX_6Pl中，然后用质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-Gold(DE3)pLysS(Stratagene)以表达蛋白。在该蛋白表达后，收集细胞并将其重悬浮在PBS中。通过超声然后添加Triton X-100至终浓度为1 %并在4 °C下轻摇温育30分钟，使细胞裂解。然后通过离心除去碎片，并将上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B(GE Healthcare)在4°C下轻摇温育30分钟。收集树脂并用PBS洗涤5次，重新悬浮在 PreScission 蛋白酶切割缓冲液(50mM Tris, 150mM NaCl, ImM EDTAiPlyM DTT)中。加 Λ PreScission蛋白酶(GE Healthcare) (80U)，并在4°C下轻摇温育4小时。收集上清液并储存在_80°C下，作为ZC3hUa蛋白溶液。接下来，使用体外转录方法合成具有与IL-6的3’ -UTR保守结构域序列同源的序列的RNA。在体外转录中，RNA标记使用[32P]标记的RNA(5000cpm)来进行。将该标记的RNA与klBhUa蛋白在含有或不含5mM Mg(Oac)2的切割缓冲液05mM Hepes, 50mM KOAc 和 5 μ M DTT)中、在 Rnasinplus (40U) (Promega)存在下混合。使用 TRIzol(InvitroGen)纯化切下的RNA，并通过使用6% TBE-尿素凝胶QnvitroGen)的变性PAGE和放射自显影对其进行分析。切下的RNA可以作为移动较快的RNA检测到。将被测物质作用于该系统以便筛选降低切割活性的物质。但是，用于切割活性的分析方法不限于此。ZC3hUa蛋白抑制剂的筛选可以通过与上述不同的方法来进行。例如，将被测物质与试验细胞进行接触，所述试验细胞用1加基因表达质粒和其中IL-6基因等的3 ’ -UTR 被置于表达萤光素酶、荧光蛋白等的基因的下游的质粒进行转染；然后，使用萤光素酶测定法、荧光检测等筛选被测物质降低基因表达的能力。制剂本发明的免疫佐剂组合物中上述抑制剂的浓度随抑制剂的种类而异，但是可以是例如约 10 μ g/ml 至 100mg/ml。免疫佐剂组合物可以是无菌水性或非水性溶液、悬液或乳液的形式。免疫佐剂组合物还可以包含可药用稀释剂、助剂、载体等，例如盐、缓冲剂等。可以计划将免疫佐剂组合物包含在人类的食品或饮料中或动物的饮用水或饲料中来摄入。也就是说，免疫佐剂组合物包括食品或饮料组合物。食品或饮料中抑制剂的浓度可以是例如约ι μ g/ml至100mg/ml。在免疫佐剂组合物中的抑制剂是核酸的情形中，该抑制剂可以是脂质体制剂。含有核酸的脂质体制剂的制备方法是公知的，这样的方法描述在例如Whitehead ΚΑ, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers :advances in siRNA delivery.(抑制屏障 siRNA 递送的进展)Nat Rev Drug Discov. 20098(2) :129-38 中。除了上述抑制剂之外，本发明的免疫佐剂组合物还可以包含已知免疫佐剂。可以组合的免疫佐剂没有具体限制，并可以是任何已知的免疫佐剂。这类已知免疫佐剂的实例包括被杀死的微生物例如弗氏完全佐剂和结核杆菌、以及amla佐剂。还包括由具有天然磷酸二酯骨架和poly (dA)尾的CpG寡核苷酸与分子量为25000以上的β_1，3_葡聚糖构成的核酸/多糖复合物；疟原虫色素；和β-正铁血红素。准备组合在免疫佐剂组合物中的免疫佐剂的浓度可以是例如约1 μ g/ml至100mg/ml。在本发明的免疫佐剂组合物含有多种组分的情形中，组分可以被混合包含或分开包含。(II)疫苗组合物上面描述的抑制剂可以与疫苗抗原组合并制成疫苗组合物。通过将抑制剂与疫苗抗原混合，可以增强疫苗抗原的免疫原性。除了上述抑制剂之外，疫苗组合物可以含有另一种已知的免疫佐剂。对疫苗的种类没有具体限制，可以使用任何已知疫苗。已知疫苗的实例包括抗食物过敏原、室内尘埃过敏原、花粉过敏原例如雪松花粉、或诸如动物毛发的过敏原的过敏疫苗。花粉过敏原的实例包括雪松花粉过敏原(Cry j 1和Cry j 2)、豚草过敏原(Ambal、 Amba2、Amba5、Ambt5和Ambp5)以及果园草过敏原(Dacg2)。食物过敏原的实例包括酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白、卵类粘蛋白、卵清蛋白和伴清蛋白。室内尘埃过敏原的实例包括螨过敏原(Derfl、Derf2、Zen 1、Derpl 禾口 Derp2)。疫苗可以是感染疫苗，其实例包括失活的全细胞疫苗、亚基疫苗和类毒素。这些疫苗可以在动物中发展出针对病原体例如细菌、病毒、立克次氏体和寄生虫的免疫性。在感染疫苗用于人类的情形中，疫苗可以针对例如流感例如甲型和乙型流感、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎、结核杆菌、人类乳头瘤病毒、疟原虫、SARS、能够侵染人类的禽流感、伤寒热、副伤寒热、鼠疫、百日咳或斑疹伤寒。在感染疫苗用于非人类动物的情形中，疫苗可以针对例如马流感病毒、马疱疹病毒、马脑膜脑炎病毒、口蹄疫病毒、狂犬病、猫泛白细胞减少症、猫鼻气管炎、传染性牛鼻气管炎、3型副流感、牛病毒性腹泻、牛腺病毒、猪细小病毒、犬腺病毒、犬瘟病毒、犬细小病毒、犬副流感、禽流感、布鲁氏菌病、弧菌病、钩端螺旋体病、梭状芽胞杆菌感染或沙门氏杆菌病。在本发明中使用的疫苗可以是癌症疫苗。对癌症疫苗没有具体限制，并且可以是已知疫苗。癌症疫苗可以是例如WT-I疫苗、抗乳腺癌的HER2/neU疫苗、抗恶性黑素瘤的 MAGE疫苗或抗结肠癌的CEA疫苗。疫苗组合物可以是无菌水性或非水性溶液、悬液或乳液的形式。疫苗组合物还可以含有可药用的稀释剂、助齐U、载体等，例如盐、缓冲剂等。疫苗组合物中抑制剂的浓度可以是例如约10 μ g/ml至100mg/ml。在疫苗组合物与本发明的免疫佐剂之外的免疫佐剂组合的情况下，待组合的免疫佐剂的浓度可以是例如约1 μ g/ml至100mg/ml。疫苗组合物中疫苗的浓度可以是例如约1 μ g/ml至100mg/ml。本发明的疫苗组合物包括食品和饮料组合物。在疫苗组合物是食品或饮料组合物的情况下，组合物中抑制剂的浓度可以是例如约ι μ g/ml至100mg/ml。在疫苗组合物与本发明的免疫佐剂之外的免疫佐剂组合的情况下，待组合的免疫佐剂的浓度可以是例如约 1 μ g/ml至100mg/ml。食品或饮料组合物中疫苗的浓度可以是例如约1 μ g/ml至IOOmg/ ml ο在疫苗组合物包含多种组分的情况下，组分可以被混合包含或分别包含。(III)免疫佐剂组合物或疫苗组合物的使用上述的疫苗组合物可以作为免疫佐剂组合物与疫苗抗原的混合物给药。或者，免疫佐剂组合物和疫苗抗原可以分开给药。通过疫苗组合物的给药，可以对动物进行免疫。也就是说，可以激活动物的免疫力(获得性免疫和天然免疫)。在免疫佐剂组合物含有上述抑制剂和另一种免疫佐剂的情况下，这些佐剂可以分开给药，或者可以作为混合物给药。在本发明的免疫佐剂组合物或疫苗组合物是药物组合物的情况下，组合物可以治疗性给药。在免疫佐剂组合物或疫苗组合物是食品组合物的情况下，组合物可以非治疗性给药。本发明的免疫佐剂组合物或疫苗组合物可以给药到具有免疫系统的任何动物 (人类或非人类)。动物的实例包括哺乳动物例如人、猴、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、豚鼠、大鼠和小鼠，以及鸟类例如鸡、鸭和鹅。具体来说，本发明的免疫佐剂组合物或疫苗组合物可用作人类的过敏疫苗或感染疫苗、宠物例如狗和猫的过敏疫苗或感染疫苗、或家畜例如牛、猪和鸡的感染疫苗。免疫佐剂组合物或疫苗组合物可以口服、肌肉内、真皮内、皮下、鼻内、气管内、经皮或经其他途径接种。可以计划将上述的本发明的免疫佐剂组合物或疫苗组合物包含在人类的食品或饮料中或包含在动物的饮用水或饲料中摄取。本发明的免疫佐剂组合物或疫苗组合物可以单剂给药，或者可以采用约2天至8 周的间隔多剂给药。疫苗的剂量可以根据目标过敏或感染的种类、或根据准备给药疫苗的动物种类而变，但是单剂剂量可以是几十纳克至几毫克。抑制剂的单剂剂量可以是约1 μ g/ml至100mg/ml。在免疫佐剂组合物或疫苗组合物与本发明的免疫佐剂之外的免疫佐剂组合的情况下，待组合的免疫佐剂的单剂剂量可以是约 1 μ g/ml 至 100mg/ml。(IV)疫苗细胞制剂将本发明的免疫佐剂组合物与从对象收获的免疫细胞(例如树突状细胞、淋巴细胞等)进行接触，从而活化免疫细胞。通过这种方式，可以获得活化免疫细胞。预计活化免疫细胞向人类的给药将引起活化免疫的疫苗效应。这种活化免疫细胞制剂通常可以静脉内给药。收获的免疫细胞可以在培养基例如RPMI中在细胞因子的存在下预培养。然后将免疫细胞与免疫佐剂组合物混合，并在适合于细胞生长的温度例如约37°C下温育约1至M 小时。免疫细胞和免疫佐剂组合物的使用比率可以是例如约1 1至1 10000。 实施例在实施例中使用的试剂和试验方法如下。〈试剂和细胞〉用于小鼠IL-4、IL-6、IL_12p40、IL-17、IFN-γ 和 TNF 的 ELISA 试剂盒从 R&D systems公司购买。小鼠ANA抗体(抗核抗体)ELISA试剂盒从Alpha Diagnostic公司购买。单克隆抗YYl (H-IO)抗体和HRP标识的单克隆抗β-微管蛋白(D-IO)抗体从 SantaCruz公司购买。HRP标识的抗FLAG抗体从Sigma公司购买。包括MALP-2的TLR配体、 poly(I:C)、源自于明尼苏达沙门氏菌(Salmonella Minnesota) Re595株的脂多糖(LPS)、 R-848和 CpG寡核苷酸(0DN1668)，按照Kawagoe，T.等，Sequential control of Toll-like receptor-dependent responses by IRAKI and IRAK2.(通过 IRAKI 和 IRAK2 顺序控制iToll样受体依赖性应答)Nat Immunol 9,684-91(2008)中所述获得。小鼠用aiil 4. 0%巯基乙酸盐培养基(Sigma)注射3天后，通过用冰冷的Hank’ s 缓冲盐溶液(Invitrogen)洗涤腹膜腔，分离出腹腔渗出细胞。HEK 293 Tet-off细胞系从 Clontech公司购买。HEK 293细胞从ATCC购买。〈表达质粒〉将&311123cDNA(NCBI 登录号 NM_153159)插入到 pFLAG_CMV2 载体(Invitrogen) 中，得到Zc3hUa表达质粒。pFLAG-CMV2载体(Invitrogen)用作Zc3hUa表达质粒的空对照质粒。使用上述&池1加表达质粒，利用QuickChange II位点定向诱变试剂盒 (Stratagene)按照随附的指导手册执行点突变(C306R或D141N)和CCCH结构域的缺失。 含有全长(1-403)或部分(1-70、58-173或172-403) IL-63，-UTR序列的pGL3载体，由 Dr. W. Zhao禾口Dr. K. Kirkwood提供(Zhao，W.等，p38alpha stabilizes interleukin-6 mRNA via multiple AU-rich elements. (p38 α通过多个富含AU的元件稳定白介素_6mRNA) J Biol Chem 沘3，1778-85 (2008))。按照 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆实验指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述的方法，将IL-6 3，-UTR cDNA 的部分(1-92、1-102、1-112、1-132、1-142 或 122-197)分别插入到 pGL3 载体中。按照Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆实验指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，将带有或不带有 IL-6 3，-UTR(77-108) 序列的 β -珠蛋白的 3，-UTR cDNA(1-130)、IL_12p40 的 3，-UTR cDNA(1-781)、CalcR 的 3'-UTR cDNA(1-1601)和Y-干扰素的3，_UTR cDNA(1-631)分别插入到pGL3载体中。按照Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆实验指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，将 IL-6 CDS 和 IL-6CDS+3，-UTR 插入到 pTREtight 载体(Clontech)中，分别产生了 pTREtight_IL6_CDS 和 pTREtight_IL6_CDS+3，-UTR。按照 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆实验指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，将野生型 k3hl2a cDNA 和突变体(D141N) k3hl2a cDNA 插入到 pGEX-6Pl 载体(GE Healthcare)中，分别产生 pGEX_6PUc3hl2a 质粒和 k3hl2a D141N突变体质粒。按照Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆实验指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，将 IL-6 3，-UTRcDNA 插入到 pBluescript 中 T7 启动子的下游，产生 pBluescript_IL63，-UTR(1-430) <ELISA>培养上清液中的IL-4、IL-6、IL-12p40、IL_17、IFN-γ和TNF-α以及血清中的小鼠ANA抗体，通过ELISA按照制造商的方案进行测量。用于小鼠血清中IgM、IgGU IgG2a, IgG2b、IgG3和抗双链DNA抗体的ELISA，按照下述文献中描述的方法来进行Sato，S.等， Essential function for the kinase TAKl in innate and adaptive immune responses. (激酶TAKl在先天性和适应性免疫应答中的基本功能)Nat. Immunol 6,1087-95(2005)；和 Fukuyama The inhibitory Fcgamma receptor modulates autoimmunity by limiting the accumulation of immunoglobulin G+anti-DNA plasma cells.(抑制性 Fc γ 受体通过限制免疫球蛋白G+抗DNA浆细胞的积累来调节自体免疫Nat Immunol 6，99-106 (2005)。〈Northern印迹、免疫印迹和EMSA>Northern印迹、免疫印迹和EMSA按照下述文献中描述的方法执行Sato，S.等，
10Essential function for the kinase TAKl in innate and adaptive immune responses. (激酶TAKl在先天性和适应性免疫应答中的基本功能)Nat. Immunol 6，1087-95 (2005)。〈血液学值的测定〉从野生型和小鼠制备的血样的血液学分析在SRL Inc公司进行。〈流式细胞术〉用于流式细胞分析的抗体从BD公司购买。通过过滤和轻柔吸打制备脾细胞悬液。 为了进行表面染色，将细胞在4°C下维持在暗处。将细胞用冰冷的FACS缓冲液(含2% FCS、 0. 02% NaN3的PBS)洗涤，并与每种抗体温育15分钟，然后用FACS缓冲液清洗3次。FoxP3+ 调节性T细胞用小鼠调节性T细胞染色试剂盒(eBioscience)，按照制造商的说明书染色。 细胞内细胞因子使用BD Cytofix/Cytoparm Plus固定/通透化试剂盒(BD)按照制造商的说明书染色。数据在FACS Calibur (注册商标)或FACS Canto (注册商标)II流式细胞仪 (BD)上获取，并使用FlowJo (来自于Tree Mar的软件)进行分析。<RNA稳定性的测量〉使用下列三种独立方法测定mRNA的稳定性。(1)巨噬细胞中mRNA的稳定性将源自于野生型和小鼠的腹膜巨噬细胞(lx IO6)分别用LPS(100ng/ ml)刺激2小时。然后向培养基加入放线菌素lK2yg/ml)以终止转录，并在指定时间后制备总RNA。对RNA进行Northern印迹分析以确定IL_6、TNF、KC和β -肌动蛋白mRNA水平。O) Tet-off 系统将HEI^93 Tet-off 细胞(3x IO6)用 pTREtight_IL6_CDS (具有 IL-6 编码序列) 或pTREtight-IL6-CDS+3，-UTR(具有IL-6编码序列和非编码的3，-UTR序列)与野生型 ^^hlh表达质粒或突变体^^hlh表达质粒或空对照质粒一起进行转染。3小时后，将细胞再分到三个60-mm平皿中并培养过夜。通过加入Doxdyg/ml)终止从pTREtight载体的mRNA转录，并在指定时间后制备总RNA。对RNA进行Northern印迹分析以确定IL-6和 β-肌动蛋白mRNA水平。(3)萤光素酶测定法 将HEK293细胞用pGL3_IL6_3’ -UTR质粒或pGL3空质粒与表达质粒或空对照质粒一起进行转染。在培养48小时后，将细胞裂解，并使用双重萤光素酶报告测定系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System) (Promega)测定裂解液中的萤光素酶活性。 将细胞同时用海肾萤光素酶基因进行转染，用作内部对照。<体外RNA切割测定法>按照 Miyoshi, K.等，In vitro RNA cleavage assay for Argonaute-famiIy proteins.(对 Argonaute 家族蛋白的体外 RNA 切割测定法)Methods Mol Biol 442， 29-43(2008)中描述的方法，分析k;3hl2a的野生型和突变体形式的切割活性。在将重组 k;3hl2a蛋白与体外转录的[32P]-标记的RNA温育后，将切开的RNA纯化并通过变性PAGE 和放射自显影进行分析。具体来说，将重组蛋白与体外转录的[32P]-标记的RNA(5000cpm)，在含有或不含 5mM Mg (Oac)2 的切割缓冲液 Q5mM Hepes,50mM KOAc 和 5μΜ DTT)中、在 Rnasin plus(40U) (Promega)存在下混合。使用TRIzol (Invitrogen)纯化切开的RNA，并通过使用6% TBE-尿
11素凝胶(Irwitrogen)的变性PAGE和放射自显影进行分析。〈骨髓移植〉从野生型小鼠和小鼠分别制备骨髓细胞。将制备的骨髓细胞静脉内注射到经致死性辐射的CD45. 1 C57BL/6小鼠中(小鼠在大阪大学微生物疾病研究所传染病动物实验资源中心饲养)。在饮用水中向嵌合小鼠提供4周的新霉素和氨苄青霉素。在重构后至少8周对小鼠进行分析。来自嵌合小鼠的90%以上的脾细胞是CD45. 2阳性的。<Zc3hUa蛋白在细菌中的表达〉在用pGEX_6PUc;3hl^i或k;3hl2a (D141N)突变体质粒转化的大肠埃希氏杆菌 (Escherichia coli)BL21-Gold(DE3)pLysS(Stratagene)中表达蛋白。在蛋白表达后，收集细胞并将其重悬浮在PBS中。将细胞通过超声裂解，然后加入Triton X-100至终浓度为 1%，并在4°C下轻摇温育30分钟。然后通过离心除去碎片，并将上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B (GE Healthcare)在4°C下轻摇温育30分钟。收集树脂并用PBS清洗5次，并重新悬浮在 PreScission 蛋白酶切割缓冲液(50mMTris，150mM NaCl, ImM EDTAiPlyM DTT)中。 加入PreScission蛋白酶(GE Healthcare) (80U)，并在4°C下轻摇温育4小时。收集上清液并储存在-80°C下，作为重组蛋白溶液。< [32P]标记的RNA的合成>使用pBluescript-IL6 3’ -UTR (1-430)质粒作为模板，合成具有 IL63’ -UTR 序列的RNA。体外RNA合成和[32P]标记使用Riboprobe体外转录系统(ftOmega)，按照制造商的说明书进行。5’ -末端标记使用未标记的RNA和激酶Max 5’ -末端标记试剂盒(Ambion)， 按照制造商的说明书进行。3’ -末端标记通过将未标记的RNA与T4 RNA连接酶(Takara) 和[32P]pCp(GE Healthcare)温育来进行。<RNA结合测定法〉将[32P]标记的RNA (lx 106cpm)与重组蛋白或BSA (Pierce)在缓冲液Q5mM Hepes,50mM KOAc和5 μ M DTT)中混合，并在室温下温育20分钟。然后加入肝素至终浓度为5 μ g/ml,并继续温育10分钟。通过使用FUNA-UV-LINKER FS-800 (Funakoshi)，用 254-nm紫外光在距光源5cm处在冰上辐照20分钟，对样品进行交联。将交联后的样品用 RNaseT(IOOU)在室温下处理20分钟，然后用RNaseA (1 μ g)在37°C下处理15分钟。在消化后，通过SDS-PAGE和放射自显影分析与[32P]标记RNA结合的蛋白。〈微阵列分析〉将来自于野生型小鼠(从日本CLEA购买)、MyD88+小鼠(通过下述文献中描述的方法产生:Adachi 0, Kawai Τ, Takeda K, Matsumoto Μ, Tsutsui H, Sakagami Μ, Nakanishi K, Akira S.Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-I-and IL-18-mediated function. (MyD88 基因的靶向破坏导致 IL-1 和 IL-18 介导的功能丧失)Immunity. 1998Jul ；9(1) :143-50.)和1Trif+小鼠(通过下述文献中描述的方法产生Yamamoto Μ, Sato S, Hemmi H, Hoshino K, Kaisho Τ, Sanjo H, Takeuchi 0, Sugiyama Μ, Okabe Μ, Takeda K, Akira S. Role of adaptor TRIF in the MyD88—independent toll-like receptor signaling pathway.(接头 TRIF 在 MyD88 不依赖性 toll 样受体信号传导途径中的作用)Science. 2003 Aug 1 ；301 (5633) :640-3)的腹膜巨噬细胞，用IOOng/ ml LPS刺激0、1和4小时。使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提取总RNA,并使用 superscript 选择系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用 T7- (dT) 24 引物引发，从 10 μ g 总 RNA合成双链cDNA。通过使用T7 RNA聚合酶，在生物素标记的核糖核苷酸存在下按照制造商的方案(Enzo Diagnostics,Farmingdale,NY)执行的体外转录反应，将cDNA用于制备生物素标记的cRNA。使用RNeasy试剂盒^jiagen)纯化cRNA产物，将其片段化，并按照制造商的方案，与Affymetrix小鼠表达阵列A430微阵列芯片(Affymetrix，Santa Clara, CA) 杂交。为了测定&池12￡1+巨噬细胞中LPS诱导性基因，将腹膜巨噬细胞用lOOng/ml LPS 刺激。然后使用 TRIzol (Invitrogen Life Technologies)提取总 RNA 并使用 RNeasy 试剂盒进一步纯化。使用Ovation生物素RNA扩增和标记系统(Nugen)，按照制造商的方案，从 IOOng纯化的RNA合成生物素标记的cDNA。Affymetrix小鼠基因组430 2. O微阵列芯片的杂交、染色、清洗和扫描按照制造商的说明书进行。使用R和Bioconductor affy软件包计算稳健多芯片平均(Robust multichip average,RMA)表达值。对于分层聚类来说，选择在刺激后与O小时处相比RMA表达值增加2倍或5倍以上的探针。对与每个探针，将RMA表达值进行变换以将平均值和标准偏差拟合到零和一。为了分析MyD88+和Trif+巨噬细胞中的LPS诱导基因，使用泊松(Pearson’ s)相关系数计算探针之间的距离作为距离函数。为了分析巨噬细胞中的LPS诱导基因，对RMA值进行主成分分析，并使用第一至第五主成分计算探针之间的欧几里得(Euclidean)距离。使用这些距离，采用沃德(Ward's) 法执行分层聚类。这些计算和热图表示法的产生使用R和Bioconductor来进行。〈免疫组织化学分析〉将组织用10%中性福尔马林缓冲溶液固定，包埋在石蜡中，并切成5-μπι厚的切片。将切片在靶恢复溶液(Dako，Glostrup，丹麦)中在98°C下加热40分钟以促进抗原恢复。将切片与用抗体稀释剂(产品名ChemMate，Dako)l 50稀释的抗小鼠IgA( α链) 的过氧化物酶标识的山羊IgG级份(MP Biomedicals, LLC, Solon, OH)、或用抗体稀释剂 1 25稀释的抗小鼠IgG(完整分子)的过氧化物酶标识的亲和纯化山羊F(AB’)2片段(MP Biomedicals)，在室温下温育30分钟。与小鼠IgA和IgG免疫反应的细胞使用二氨基联苯胺(Dako)可视化。将切片用苏木精轻度复染。将染色的切片在光学显微镜下观察。〈结构模型建立〉如下所述构建k;3hl2C N-端结构域的模型。首先，将序列提交给BioInfoBank Meta服务器(http://bioinfo.pl)，并使用缺省设置建立排名前十的模型。然后通过将每个模型提交给&SAW功能注释服务器(http:// pdbjs6.pdbj.org/SeSAff/)并选择具有最高分值的模型，来选择最佳模型。使用FFASO3 服务器(http://ffas. ljcrf. edu/ffas-cgi/cgi/ffas. pi)和 Modeller (Eswar，N.等， Comparative protein structure modeling using Modeller.(使用 Modeller 建立比较性蛋白结构模型)，《生物信息学现代方法》(Curr Protoc Bioinformatics)第5章，5. 6 单元O006))，从结构基因组学模板2qip建立所选的模型。该模型也具有最高的3D Jury 分值，含有一簇保守天冬氨酸(D141、D226、SM2、D244和D248)，其在Flap内切核酸酶 (例如PDB ID lut5)的活性位点中也是保守的(Feng, Μ.等，Roles of divalent metal ions in flap endonuclease-substrate interactions· (二H属离子flap 内切t亥酸酶-底物相互作用中的作用)Nat Struct Mol Biol 11,450-6 (2004)) 使用eF-surf 月艮务器(http://ef-site.hgc.jp/eF_surf/)禾口 eF—site(Kinoshita，K. & Nakamura，H. eF—site and PDBjViewer database and viewer for protein functional sites. (eF-site和PDBjViewer :用于蛋白质功能位点的数据库和浏览器)Bioinformatics 20， 1329-30(2004))制备静电表面。〈实施例1>Zc3hl2a作为LPS诱导基因的鉴定为了全面调查Toll样受体(TLR)诱导的基因表达，发明人使用来自LPS刺激的野生型(WT)、Myd88+和Trif+小鼠的小鼠巨噬细胞，执行了微阵列分析。选择了野生型细胞在刺激后1或4小时时其表达被诱导两倍以上的214个基因。 这些LPS诱导基因的分层聚类显示，它们可以分类成三个主要簇(数据未显示)。在这些簇中，第III簇中的基因以MyD88依赖性方式被快速诱导。该簇包含Tnf、NflibiZ和Zfp36 等。第III簇还包含编码的基因(数据未显示)。为了调查&31112￡1、IL-6、ΙκΒζ和 β -肌动蛋白的表达，从用 LPS(100ng/ml) 刺激指定时间长度的巨噬细胞提取总RNA，并进行Northern印迹。结果显示在图Ia中。 Northern印迹分析证实，在小鼠巨噬细胞中，在LPS刺激后k;3hl2a mRNA被快速诱导，然后随时间逐渐降低(图la)。ZC3hUa具有CCCH型锌指(Zf)基序，并与类似蛋白Zc3hl2b, Zc3hl2c和k3hl2d形成家族。使用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)，将 HEK293 细胞用或不用带有 Flag 标签的ZC3hUa转染。从用或不用带有Flag标签的ZC3hUa转染的HEK293细胞制备细胞质 (CP)和核提取物(NE)。使用抗FLAG抗体，通过Wfestern印迹测量&池12￡1的表达。使用抗β-微管蛋白抗体和抗YY-I抗体分别作为CP和NE的对照(上样对照)。结果显示在图 Ib中。分级实验显示，ZC3hUa蛋白主要位于细胞质而不是核中(图lb)。〈实施例2>k3hl2a+小鼠的产生为了调查&池1加在体内免疫应答控制中的功能作用，发明人产生了 ZC3hUa缺陷(Zc3hl2a+)小鼠。使用Elongase (Invitrogen)，通过PCR从GSI-I胚胎干细胞分离含有k3hl2a的基因组DNA。将分离的含有的基因组DNA通过限制性酶作图和测序分析进行表征。 对靶向载体进行设计，以用新霉素抗性基因代替含有CCCH型锌指结构域的外显子3至外显子5。使用1. 1-千碱基(kb)的ClaI-BamI片段作为3，同源区，5. 9_kb的NotI-SalI片段用作5’同源区。将总共30yg的NotI线性化的载体经电穿孔进入GSI-I胚胎干细胞中。 在用G418 (Nacalai Tesque)选择后，挑取药物抗性克隆，并通过PCR和Southern印迹分析进行筛选。将这些克隆分别微注射到源自于C57BL/6小鼠的囊胚(从日本CLEA购买)中， 并将囊胚移植到假孕雌性小鼠中。嵌合雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠的交配导致突变体等位基因传递到生殖系中。将生成小鼠互交以产生&池12&+小鼠。所有动物实验在大阪大学微生物病研究所的动物实验委员会批准下进行。图加是小鼠基因(野生型等位基因)、靶向载体(靶向构建物)和靶等位基因的示意图。在图加中，H表示Hindlll。图2b是杂合杂交后代的Southern印迹分析结果。从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)提取基因组DNA，将其用HindIII切割，通过电泳分离，并与放射性标记的探针杂交。Southern印迹显示出对于野生型(v+)小鼠的5. 91Λ单一条带，纯合型("_)小鼠的3. Skb单一条带，以及杂合型(+/_)小鼠的5. 9kb和3. Skb的两个条带。为了调查&池12￡1 mRNA的表达，本发明人使用图加中显示的两种引物对RNA进行了 RT-PCR 分析，所述引物是Fw :ATATGAGTGACCCTTGTGGAACGAAGC(SEQ ID :N0. 1)和 Rev TCTGTACACAGCATACATGTGTCCTCC (SEQ ID :N0. 2)。使用同样的 RNA 分析 β -肌动蛋白基因的表达。图2c显示了用LPS(100ng/ml)刺激指定时间长度的的野生型(WT) (Zc3hl2a+/+) 和k3hl2a+巨噬细胞的RNA的RT-PCR分析结果。RT-PCR分析显示出Zc3hlh的表达在 Zc3hl2a^巨噬细胞中受到抑制(图2c)。〈实施例3>小鼠中胎儿期自体免疫疾病的早期发作小鼠按照孟德尔定律出生。它们中的大多数显示出生长迟缓，并在出生
后12周内自发死亡(图3a)。图3a是显示了野生型(Zc3hl2a+/+)和Zc3hl2a^小鼠(n = 10)的存活率的图。图北是来自野生型(Zc3hl2av+)(顶部)和(底部)小鼠的脾脏(上图)、肠系膜淋巴结(左下图)和腹股沟淋巴结(右下图)的照片。Zc3hl2a+小鼠
、+
显示出严重脾肿大和淋巴腺病(图北)。图3c是来自野生型(Zc3hl2a+/+)和Zc3hl2a 鼠的肺脏、脾脏和淋巴结(LN)的组织学照片。图4是来自野生型(WT)和&池123+小鼠的肝脏和胰腺切片的H&E染色的结果。组织学检查揭示出浆细胞在肺、胆管的保护上皮 (para印itheIium)和脾脏中的浸润(图3c和4)。浆细胞也在ZdhUa+淋巴结(LN)禾口脾脏中积累(图3c)。在LN中，观察到了肉芽肿形成和产生巨噬细胞融合的巨细胞。然而， 在小鼠的肠或关节中没有观察到炎性变化(数据未显示)。血细胞的检查结果显示在表1中。ZC3hUa+小鼠显示出白细胞和血小板数量增加，并患有严重贫血(表1)。表1中的数据是6个样品的平均值士标准偏差(S. D.)。表1
血小板(χ IO4 mm-3)
白细胞(μΓ1) 活细胞(χ IOmm"3) 血红蛋白(g/dl-1) 血细胞比容(％) MCV (μ3) MCH (pg) MCHC (%)
Zc3hl2a
+/+
Zc3hl2a
-I-
62.7 土 18.9 2083.3 士 652.4 841.7 ±30.0 14.7 土 0.4 49.9 土 1.5 59.3 士 1.2 17.5 ±0.5 29.3 士 0.5
134.1 ±27.9 6833.3 土 2309.7 450.7 ±89.5 6.1 士 1.5
26.1±3.8 58.5 ±3.9 13.5 土 1.5
23.2±3.0此外，小鼠发生所有被测试的免疫球蛋白同种型的高免疫球蛋白血症 (高Y-球蛋白血症)(图如)。图fe中显示了 12a+小鼠中的血清免疫球蛋白水平。图恥中显示了小鼠中抗核抗体(AN)和抗双链DNA抗体的产生。统计
15学显著性使用Student' s t-检验确定(* =P < 0. 05，** =P < 0. 01)。在Zc3hl2a^小鼠中观察到了抗核抗体和抗双链DNA抗体的产生(图恥)。图5c是用抗IgG和抗IgA抗体染色的肺切片的免疫组织化学结果(组织学照片)。 浸润在肺间质组织中的浆细胞容易用抗IgG或抗IgA抗体染色(图5c)。图6显示了小鼠中细胞畸变和细胞因子生产增加的检查结果。图6a至 6c显示了脾细胞的流式细胞分析。脾⑶19+B细胞中IgM和IgD的表达显示在图6a中，脾脏中浆细胞的比例显示在图6b中，脾T细胞中⑶62L和⑶44的表达显示在图6c中。关于上述结果，在三个独立实验中获得了类似结果。图7a是显示了野生型和小鼠的抗体染色脾细胞的流式细胞分析结果的图。图7b是显示了用抗R)xp3抗体和抗CD4抗体染色的脾细胞的流式细胞分析结果的图。图8是显示了在脾脏T细胞中对⑶刺激做出响应而生产的干扰素-Y、 IL-17和IL-4的图。误差线表示两份平行样的标准偏差(S.D.)。在三次独立实验中获得了类似结果。图9a是用抗⑶4抗体染色、通透化并对干扰素-Y和IL-17进行染色的脾细胞的流式细胞分析结果。脾细胞通过与50ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA) (Sigma)、5mM钙离子载体A23187(Sigma)和G0Igistop(BD)在完全培养基中37°C下温育4小时来进行刺激，并将刺激过的脾细胞用于上述分析。图中的数字表示象限中的细胞比例。图9b、10a和IOb是显示了野生型和小鼠的抗体染色脾细胞的流式细胞分析结果的图。图11是小鼠中造血细胞参与浆细胞和效应/免疫记忆T细胞的积累的检查结果。在图11所示的实验中，来自野生型和^池123+骨髓嵌合小鼠的脾细胞用抗体染色并通过流式细胞术分析。流式细胞分析显示，约70 %的⑶19+B细胞是IgM_IgD_而不是Ig+，表明大多数 Zc3hl2a-7-小鼠B细胞在脾脏中经历了类别转换(图6a)。此外，在小鼠脾脏中存在丰富的⑶138+CD19du11浆细胞(图6b)。还有，在脾脏⑶3+T细胞中⑶69的表达被上调，并且CD44highCD62LT细胞在外周积累(图6c和7a)。然而，在野生型与Zc3hl2a^小鼠之间⑶4+FoXp3+调节性T细胞的比例相当(图7b)。用抗⑶3抗体刺激脾脏T细胞导致 IFN- γ而不是IL-17生产的增加(图8和9a)。在Zc3hl2a^小鼠脾脏中Terl 19+成红细胞群体较高，可能反映出对贫血的响应(图9b)。然而，在&池123+脾脏中，B细胞与T细胞的比率和⑶4+细胞与⑶8+细胞的比率没有改变(图IOa和10b)。为了调查造血细胞是否足以导致疾病发展，发明人将来自
小鼠的骨髓细胞移植到受体C57BL/6小鼠中。k;3hl2a+BM嵌合体显示出延迟但是明显的淋巴腺病的发生以及浆细胞和⑶44highCD62L_T细胞的积累，表明造血细胞对免疫疾患的发展有贡献(图11)。这些结果证实，ZC3hUa对于阻止以Ig产生性浆细胞和肉芽肿形成为特征的严重免疫疾病的发展来说，是必需的。〈实施例4>发明人然后调查了从巨噬细胞产生的细胞因子。
将来自于野生型和小鼠的腹膜巨噬细胞用MALP-2 (1、10ng/ml)、 poly(I:C) (100μ g/ml)、LPS(10、100ng/ml)、R-848(10nM)或CpG_DNA(0. 1、1μΜ)刺激24小时。通过ELISA测量培养上清液中的IL-6、IL-12p40和TNF浓度。结果显示在图12a中。 在图12a中，“med”表示没有用上述物质刺激的巨噬细胞(对照)。误差线表示两个平行样的标准偏差(S.D.)。在三个独立实验中获得了相似结果。从用LPS(IOOngAil)刺激指定时间长度的巨噬细胞提取总RNA，并进行Northern 印迹以测量IL-6、KC、TNF、IκBa、RANTES、IP-10和β-肌动蛋白的表达。结果显示在图 12b 中。图13是在野生型(Zc;3hl2av+)和腹膜巨噬细胞的微阵列分析的基础上选择的LPS诱导基因的表达的热图表示。然后，发明人在野生型和巨噬细胞中执行了 LPS诱导基因的微阵列分析。如上所述，将野生型和&池12￡1+巨噬细胞用lOOng/ml LPS刺激0、1、2和4小时，并使用Affymetrix小鼠基因组430 2. 0微阵列芯片对总RNA进行微阵列分析。数据按照上述进行处理，在野生型和巨噬细胞中在刺激后1、2或4小时上调5倍以上的1045个基因被定义为LPS诱导基因。对基因进行分层聚类，得到的热图和树状图显示在图14中。 在图14中，在巨噬细胞中高表达的基因簇用红色矩形框突出。发明人调查了巨噬细胞中TLR信号传导途径的活化是否正常。将野生型和巨噬细胞用LPS(100ng/ml)刺激指定时间长度。制备核提取物，并使用针对NF-K B和AP-I的特异性探针通过电泳迁移率变动分析(EMSA)测量转录因子-DNA结合活性(描述在 Sato, S.等，Essential function for the kinase TAKl in innate and adaptive immune responses.(激酶TAKl在先天性和适应性免疫应答中的基本功能)Nat Immunol 6,1087-95(2005)中)。结果显示在图15中。图15中显示的结果是三次独立实验的典型结果。如图1 中所示，使用 TLR 配体、MALP-2(TLR2)、poly (I:C) (TLR3)、LPS(TLR4)、 R-848 (TLR7)和CpG-DNA (TLR9)进行刺激，在Zc3hl2a^巨噬细胞中诱导了 IL-6和 IL-12p40生产的增加，但是TNF没有增加。Northern印迹分析显示出在巨噬细胞中IL-6mRNA而不是TNF、KC或I κ Na mRNA对LPS做出响应而显著增加(图12b)。然后本发明人执行了微阵列分析以评估野生型与&池123+巨噬细胞之间LPS诱导基因表达的差异。巨噬细胞中LPS诱导基因的微阵列分析显示，大多数LPS诱导基因在野生型和 Zc3hl2a^细胞中表达相当(图14)。然而，一组特别的基因在巨噬细胞中高表达。它们包括IL-6、Ifng、Calcr和Sprr2d(图13)。在野生型与Zc3hl2a^巨噬细胞之间， 没有观察到由LPS引起的NF-K B或活化蛋白1 (AP-I)活化的差异，表明不参与初始TLR信号传导途径的调控(图15)。〈实施例5>一些CCCH型zf蛋白牵涉到mRNA代谢例如mRNA剪接、聚腺苷化和mRNA崩解的调控。因此，推测可能在mRNA的不稳定性中发挥作用，并使用IL-6对这种可能性进行了调查。如上所述，将野生型和巨噬细胞用LPS刺激2小时，然后用放线菌素D 进行处理。
图16显示了 Zc3hlh通过一组基因的mRNA的3，-UTR使它们不稳定。图16a显示了使用提取的总RNA(10 μ g)对IL-6、TNF、KC和β -肌动蛋白探针的表达进行RNA印迹分析的结果。在三次独立实验中获得了相似结果。图16b是显示了剩余mRNA水平的时间过程的图。在图16b中，对放射自显影图进行定量，并使用IL-6、TNF或Cxcll与Actb的比率来确定剩余mRNA水平。Zc3hl2a^巨噬细胞与野生型细胞相比，IL_6mRNA而不是TNF或KC mRNA的半衰期增加(图16a和16b)。这些结果表明，Zc3hl2a对IL_6mRNA进行转录后调控。〈实施例6>确定3，-UTR IL-6 中的 Zc3hl2a 响应区为了确定&池1加表达是否控制IL_6mRNA，发明人按照1Tet-On基因表达系统说明书(TAKARA)中描述的方法，用含有在四环素响应性启动子(TRE)控制下的具有3’-非翻译区(UTR)序列的IL-6编码序列(⑶幻的质粒(pTREtight-IL6-CDS+3，-UTR)，转染稳定表达与病毒转录因子VP-16的反式激活结构域融合的四环素阻遏蛋白的HEK293细胞(Tet_off 293细胞)。在用强力霉素(Dox)处理后，IL-6mRNA的转录被终止，然后mRNA以温育时间依赖性方式衰减(图17a)。Zc3hlh的过表达极大加速了 IL-6mRNA的降解(图17a和17b)。 相反，Zc3hUa不影响不带有3，-UTR序列的mRNA(pTREtight-IL6-CDS)的表达(图17a和 17b)。图 17 显示了使用从用 pTREtight-IL6-CDS 或 pTREtight_IL6_CDS+3，-UTR 与 Zc3hl2a表达质粒或对照(空)质粒一起转染的HEK293 Tet-off细胞提取的RNA的 Northern印迹分析(a)和通过放射自显影获得的剩余mRNA水平(b)的结果。在图17a中，将细胞在转染后3小时再分并温育过夜。在D0X(lyg/ml)处理后制备总RNA，并通过Northern印迹分析确定IL-6和β -肌动蛋RNA水平。在图17b中，对放射自显影图进行定量，并使用IL-6与Actb的比率来确定剩余mRNA水平。图19是萤光素酶活性测量结果。误差线表示两份平行样的标准偏差(S. D.)。在三次独立实验中获得了相似结果。在图19a和b中，将HEK293细胞用含有各种IL_6(图19a) 3，-UTR和/或β-珠蛋白(图19b) 3’ -UTR序列的pGL3质粒与表达质粒或对照(空)质粒一起进行转染，并在48小时后测量细胞裂解液的萤光素酶活性。在图19c中，将HEK293细胞用带有 IL-6、IL-12p40、CTR或干扰素1的3'-UTR的pGL3与Zc3hl2a表达质粒或对照(空)质粒一起进行转染，并在48小时后测量细胞裂解液的萤光素酶活性。 图18是IL-63，-UTR及其缺失构建物的示意图。小鼠IL_6mRNA在其3，-UTR 中含有5个富含腺嘌呤-尿苷的元件(ARE)(图18) (Zhao, W.等，p38alpha stabilizes interleukin-6 mRNA via multiple AU-rich elements. (p38 α 通过多个富含AU 的元件稳定化白介素 _6mRNA) J Biol Chem 沘3，1778-85 (2008))。 此外，据报道，物种之间包含约30个核苷酸的保守元件(CE)对于IL_6mRNA的去 1 急定化是重要白勺(Paschoud, S.等，Destabilization of interleukin-6 mRNA requires a putative RNA stem-loop structure, an AU-rich element, and the RNA—binding protein AUF1.(白介素_6mRNA的去稳定化需要推定的RNA茎环结构、富含AU的元件和 RNA 结合蛋白 AUFl)Mol Cell Biol 26,8228-41 (2006)) 为了调查 IL-6 3，-UTR 中对于产生k;3hl2a响应性来说关键的区域，本发明人使用了一系列含有几个IL-6 3’ -UTR区域的萤光素酶报告构建物(PGL3)(图18)。当将全长IL-6 3’ -UTR(1_403)插入到报告基因中时，与单独使用萤光素酶报告基因时相比，萤光素酶活性降低。Zc3hUa的共表达进一步降低了 PGL3-IL6 3’-UTR(1-403)的萤光素酶活性(图19a)。尽管Zc3hl2a的表达不改变 PGL3-IL6 3'-UTR(1-70)和 pGL3_IL6 3，-UTR(172-403)的萤光素酶活性，但在 k3hl2a 存在下PGL3-IL6 3，-UTR(56-173)的萤光素酶活性降低。IL-6 3，-UTR(56-173)包含两个ARE 以及 CE (图 19a)。IL-6 3，_UTR(122_197)不被 k3hl2a 去稳定化，表明 ARE 对于 IL_6mRNA 的ZC3hUa介导去稳定化不是关键的。相反，不含任何ARE的IL-6 3，-UTR(1-142)被表达去稳定化(图19a)。通过使用一组具有缩短的IL-6 3'-UTR的萤光素酶报告构建物，本发明人发现IL-6 (1-102)而不是IL-6(l-92)被去稳定化(图20)。图 20是IL-6 3’-UTR及其缺失构建物的示意图。尽管pGL3_β -珠蛋白3’-UTR的萤光素酶活性不受&汕1加表达的影响，但向β-珠蛋白3，-UTR添加IL-6 3，-UTR (77-108)赋予了对Zc3hl2a的响应性(图19b)。这些结果强烈提示，IL-6 3'-UTR的CE对于Zc3hl2a介导的mRNA去稳定化是重要的。ZC3hUa的表达降低了具有IL_12p40和降钙素受体(CTR) 的3’ -UTR的报告基因的萤光素酶活性，但是不降低具有干扰素-Y的3’ -UTR的报告基因的萤光素酶活性(图19c)，表明IL-6、IL-12p40和CTR mRNA受到ZC3hUa直接调控。干扰素-Y可能受到IL-12过表达的辅助性调控。<实施例7>接下来，本发明人调查了 ZC3hUa是否直接结合RNA。图21是与IL_6 3’ -UTR(1-403)mRNA结合的UV交联测定法的检查结果。合成的ZC3hUa蛋白而不是牛血清白蛋白(BSA)与体外转录的11^-63，-肌1 (1-403)1 離结合，表明^^111加具有1 離结合能力(图21)。<实施例8>CCCH Zf基序在IL_6mRNA去稳定化中的作用本发明人测试了 Zc3hlh的CCCH序列对其在IL_6mRNA崩解中的作用是否是关键的。图 2 是在用 pTREtight-IL6-CDS+3，-UTR 与各种不同量的编码 Flag-Zc3hUa 或其突变体(C306R或ACCCH)的表达质粒一起转染、并用Dox处理指定时间长度的HEK293 Tet-off细胞中IL-6表达的Northern印迹分析结果。图22b显示了通过免疫印迹测定的 Zc3hl2a突变体蛋白的表达水平。图22b中的箭头指示表达的k;3hl2a蛋白。图 23a 是在用 pTREtight_IL6_CDS+3，-UTR 与编码 Flag4c3hl2a 或其突变体 (C306R或ACCCH)的表达质粒一起转染、并用Dox处理指定时间长度的HEK293 Tet-off 细胞中IL-6表达的Northern印迹分析结果。对放射自显影图进行定量，并使用IL-6与Actb 的比率来确定剩余的mRNA水平(图23b)。图23c是^^hlh突变体蛋白的表达水平的免疫印迹结果。在CCCH zf结构域中含有C306R突变的^^hUa和不具有CCCH结构域(缺少 306-322位氨基酸)的k;3hl2a的表达，仍然能够使IL_6mRNA去稳定化(图23a至23c)， 即使这些突变体蛋白当蛋白表达量低时降解IL-6mRNA的能力降低(图22)。这些结果表明 CCCH基序在IL-6mRNA崩解的控制中发挥作用。
小鼠和人类k;3hl2a中N-端和CCCH结构域的序列比对显示在图24中。在图M 中，着色的部分是共有序列。黑点(·)表示在其他PIN结构域结构中保守的天冬酰胺残基，星号表示CCCH锌指。序列比对表明在&池1加中刚好位于zf结构域(300-324)之前的保守N-端结构域(139-297)与PIN结构域样SCOP超家族共有遥远的同源性(图。结构建模以及随后与其他PIN结构域结构的比对，揭示出由Asp 141、Asn 144、Asp 226、Asp 244和Asp 248形成的保守的、带负电的袋，对于镁结合和酶活性有潜在的重要性(图对和 25)。图25是通过结构建模产生的的N-端结构域的结构模型。图沈和27是k;3hl2a的内切核糖核酸酶活性的测量结果。在这些实验中，将合成的RNA与预定量(不同量)的蛋白温育。在图263至沈(、273和27b中，左边的道是RNA 尺寸标志物。合成的的表达水平显示在图^a中，在存在或不存在5mMMg2+的情况下k3hl2a降解IL-6 3’ -UTR mRNA (1-403)的核糖核酸酶活性显示在图洸b中，Zc3hl2a ^P Zc3hl2a(D141N)蛋白的核糖核酸酶活性显示在图26c中。图27a是5，-或3，-末端标记的IL-6 3，-UTR mRNA(1-403)用各种不同量的重组蛋白进行的体外切割测定的结果。图27b是的核糖核酸酶活性的动力学分析结果。在图27显示的实验中，将5’-或3’-末端标记的IL-6 3'-UTR mRNA(1-403) 与重组k;3hl2a蛋白温育指定时间长度。图^a是IL-6表达的Northern印迹分析结果。将HEK293 Tet-off细胞用 pTREtight-IL6 full与k3hl2a(D141N) —起进行转染。然后将细胞用Dox处理指定时间长度，并通过Northern印迹分析测量IL-6的表达。图28b是显示了剩余mRNA水平的时间过程的图。从这些结果，发明人推测Zc3hlh蛋白的N-端结构域可能是核糖核酸酶，并且合成的蛋白以Mg2+依赖性方式显示出对IL-63，-UTR(1-403)mRNA的核糖核酸酶活性 (图26a和^b)。Zc3hlh以相似的动力学降解5’ -标记的RNA和3’ -标记的RNA，表明
具有内切核酸酶活性(图27)。Zc3hl2a的活性在体外看来很大程度上是序列不依赖性的，因为具有各种不同序列的靶RNA几乎完全被降解(数据未显示)。此外，Zc3hl2a D141N突变体不降解RNA，表明保守的袋确实起到核糖核酸酶活性位点的作用(图26a和 26c)。k;3hl2aD141N突变体不能使含有IL-6 3'-UTR的RNA去稳定化，表明核糖核酸酶活性对于Zc3hl2a的功能是必需的(图23a和28)。〈结论〉这些实验结果清楚地证明了 ZC3hUa对于抑制导致小鼠死亡的严重自体免疫疾病的发生来说是必需的。在&池12￡1+巨噬细胞中，由于mRNA崩解失效，IL-6和IL_12p40 的生产增加，但是TNF的生产没有增加。已经显示，CCCH型锌指蛋白通过与3’-UTR结合而控制 mRNA 崩解。例如，tristetraprolin (TTP)及其同源物 Zfp3611、Zfp3612 和 Zfp3613 对于 TNF、GM-CSF、QCCLl 等的mRNA 的崩解来说是关键的(Anderson，P. Post-transcriptional control of cytokine production.(细胞因子生产的转录后控制)Nat Immunol 9， 353-9(2008)；禾口 Datta，S.等，Tristetraprolin regulates CXCLl(KC)mRNA stability. (Tristetraprolin 调控 CXCLl (KC)mRNA 的稳定性)J Immunol 180，2545-52 (2008))。老年TTP+小鼠由于TNF的产生发生自体免疫性关节炎(Taylor, G. Α.等，A pathogenetic role for TNF alpha in the syndrome of cachexia, arthritis, and autoimmunityresulting from tristetraprolin(TTP) deficiency. (TNF-α 在 tristetraprolin(TTP) 缺陷引起的恶病质、关节炎和自体免疫综合征中的病理作用)Immunity 4,445-54(1996)). 然而，没有报道证明TTP+细胞响应TLR刺激产生增加量的IL-6。有趣的是，失去k;3hl2a 不影响巨噬细胞中TNF mRNA的表达，表明TTP和Zc3hUa控制不同细胞因子的mRNA崩解。Zc3hlh靶向ARE之外的RNA序列，并且IL-6ARE看来受到未知的不依赖于的机制的调控。考虑到在&池123+小鼠中观察到的意义深远的病理发现，IL-6和IL12p40 之外的基因也可能关键性地参与病理发生。鉴定对其他刺激做出响应或其他细胞类型中的靶基因，将增进我们对在小鼠中观察到的异常现象的完整机制的了解。最近报道，ZC3hUa是单核细胞趋化蛋白I(MCP-I)诱导的蛋白(Zhou，L.等，Monocyte chemoattractant protein-linduces a novel transcription factor that causes cardiac myocyte apoptosis and ventricular dysfunction. (It亥细IfililU蛋白 1 i秀导引起心肌细胞凋亡和心室机能障碍的新的转录因子)Circ Res 98，1177-85 (2006))，并且已显示蛋白的过表达在巨噬细胞中通过抑制NF- κ B的活化来阻遏细胞因子产生 (Liang,J.等，A novel CCCH-zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages.(新的CCCH-锌指蛋白家族调节巨噬细胞的促炎性激活)J Biol Chem 283,6337-46 (2008)) 然而，本发明的实验与该报道不一致，显示出Zc3hUa参与mRNA崩解而不参与TNF调控。ZC3hUa蛋白具有负责IL_6mRNA崩解的内在核糖核酸酶活性。其机制与其他ARE 介导的mRNA崩解途径的调控相比是独特的。例如，已经显示TTP召集脱腺苷酶以移除polyA 尾并促进靶mRNA随后被外切核酸酶的降解(Anderson, P.，Post-transcriptional control of cytokine production.(细胞因子生产的转录后控制)Nat Immunol 9，353-9 (2008))。 因此，有趣的是^池1加具有至少在体外不显示出序列特异性的内切核酸酶活性。靶特异性可以通过k;3hl2a的结合配偶体确定，或者可能在某些条件下具有用于降解的优先序列。Zc3hl^i如何诱导mRNA崩解的机制是进一步研究的关心课题。核糖核酸酶结构域在四个^池12家族成员中是保守的，并且该蛋白家族的同源物已在后生动物例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(基因 ID :CG10889)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(基因ID :C30F12. 1)中发现。因此，mRNA被核糖核酸酶结构域和CCCH zf结构域的调控看来在进化中是保守的。另一个含有CCCH zf基序的RING型遍在蛋白连接酶蛋白被称为roquin，对于通过控制ICOS共刺激分子的表达来抑制自体免疫来说是必需的(Vinuesa，C. G.等，A RING-type ubiquitin ligase family member required to repress follicular helper T cells and autoimmunity.(抑制滤泡辅助性T细胞和自体免疫所需的RING型遍在蛋白连接酶家族成员)Nature 435,452-8 (2005)) 0 Roquin和几种微小RNA看来共有抑制其降 M^i ICOS 3' -UTR RNA gg (Yu, D.等，Roquin represses autoimmunity by limiting inducible T-cell co-stimulator messenger RNA. (Roquin 通过限制诱导性 T 细胞辅刺激分子信使RNA来抑制自体免疫)Nature 450, 299-303 (2007)) 由于每种CCCH zf蛋白看来具有靶mRNA特异性，并且在哺乳动物基因组中已经鉴定到60种CCCH类型的zf蛋白 (Liang， J.等，Genome-wide survey and expression profiling of CCCH-zinc finger family reveals a functional module in macrophage activation. (CCCH-锋指家方矣
21的基因组广度调查和表达；谱分析揭示出巨噬细胞活化中的功能性模块)PLoS ONE 3， U88(K2008))，因此对于先天性免疫应答的调控来说，控制mRNA崩解可能与控制转录同样重要。
权利要求
1.免疫佐剂组合物，所述组合物包含选自ZC3hUa基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种作为活性成分。
2.权利要求1的免疫佐剂组合物，其还包含另一种免疫佐剂。
3.疫苗组合物，所述组合物包含疫苗抗原以及选自ZC3hUa基因抑制剂和^^hlh蛋白抑制剂的至少一种。
4.权利要求3的疫苗组合物，其还包含另一种免疫佐剂。
5.对动物进行免疫的方法，所述方法包含向动物给药权利要求3的疫苗组合物。
6.活化的免疫细胞的生产方法，所述方法包含将从对象收获的免疫细胞与选自 Zc3hl2a基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种进行接触、从而活化免疫细胞的步马聚ο
7.通过权利要求6的方法生产的活化的免疫细胞。
8.用于增强疫苗抗原的免疫原性的化合物，所述化合物是选自Zc3hl^i基因抑制剂和 Zc3hl2a蛋白抑制剂的至少一种。
9.化合物在生产免疫佐剂中的应用，所述化合物是选自Zc3hl^i基因抑制剂和 Zc3hl2a蛋白抑制剂的至少一种。
10.用于增强疫苗抗原的免疫原性的方法，所述方法包含将疫苗抗原与选自Zc3hl^i 基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种进行混合的步骤。
11.用于活化免疫力的组合物，所述组合物包含疫苗抗原以及选自Zc3hl^i基因抑制剂和ZC3hUa蛋白抑制剂的至少一种。
12.包含疫苗抗原以及选自ZC3hUa基因抑制剂和蛋白抑制剂的至少一种的组合物在生产疫苗组合物中的应用。
全文摘要
本发明公开了包含选自Zc3h12a基因抑制剂和Zc3h12a蛋白抑制剂的至少一种组分作为活性成分的组合物。该组合物可以用作免疫佐剂。
文档编号C12N5/10GK102378633SQ201080009788
公开日2012年3月14日 申请日期2010年2月26日 优先权日2009年2月27日
发明者审良静男, 松下一史, 石井健, 竹内理 申请人:国立大学法人大阪大学