使用编码的微载体进行的基因组选择和测序的制作方法

专利名称：使用编码的微载体进行的基因组选择和测序的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸杂交和测序方法。本发明进一步涉及使用编码的微载体进行的核酸片段的选择、测序和鉴定。
背景技术：
最近的测序技术使得同时测定大量核苷酸序列。这取消了对在不同的毛细管或分离的反应孔中进行分离的测序反应的需要。通常地，DNA样品通过机械或酶促技术被片段化，其后单个的DNA片段经由连接到片段的一种类型的核苷酸接头分子被结合到基质、例貪反应室的壁或微载体/珠)，所述核苷酸接头分子也发挥通用引物的功能。对于多于单个分子测序的技术，基于PCR的扩增步骤如下。例如，测序技术例如“4M”焦磷酸测序 (Roche)利用单个的微珠作为基质，其在反应室微孔中设置。随后，在所有技术中，核苷酸逐步参入并对于结合基质的各个DNA分子进行鉴定。该过程重复多次并将所有单个的片段的测序读码进行比对以得到所研究的靶DNA样品的完整序列。这些技术在本领域已知为 “下一代测序”并被例如Helicos，Illumina和Applied Bio系统和Roche等公司商业化。 下一代测序方法要求同时进行的不同反应可在物理上各自分离。DNA样品的富集可以在测序前进行以降低样品的复杂性和选择基因组的特定区域用于测序。方法描述在Hodges等人Q007) Nature Genetics 39，1522-1527中以选择或富集基因组DNA片段用于随后测序，其通过选择杂交探针来进行。已发展了更多种多样的方法用于DNA杂交，其中多路方法部分或完全在溶液中进行和其中使用具有不同颜色的微载体或使用编码的标志物索引单个反应(所综述的Braeckmans等人Q002) Nature Rev. Drug Discovery 1,447-448)。在该内容中，Braeckmans 等人(2003) Nature Mat. 2，169-173表明光漂白的编码的颗粒用于DNA杂交测定的用途。目前测序方法的缺点是可被测序的DNA的相对短的单个阅读长度，导致具有有限信息含量的序列。这使得在参考基因组序列中定位测定的序列通常困难(序列注解)。特别困难的是硫酸氢盐测序的情况下，其中在测序反应之前，在片段的CpG序列中的未甲基化的C核苷酸转换成T核苷酸，导致用于与参考基因组进行测序读码比对的减少的信息和因此在最终核酸序列的正确组装中增加的难度。特别对于未来临床诊断应用，例如癌症测序，微生物学和临床遗传学，加快测定患者基因组样品的序列的时间和获得最高的可能准确度应是有利的。发明概述
本发明的具体和优选方面在所附独立和从属权利要求中阐述。从属权利要求的特征可与合适的且不只是权利要求中明确阐述的独立权利要求的特征和其他从属权利要求的特征组合。本发明涉及用于测定靶核酸分子的序列的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供与编码的微载体连接的俘获寡核苷酸探针，其中所述微载体的代码(代码)鉴定所述寡核苷酸探针的序列和/或其在参考基因组上的位置，
b)将所述俘获寡核苷酸探针与包含核酸分子的样品杂交，其中所述核酸分子包含至少部分与俘获寡核苷酸探针的序列互补的序列，
c)通过产生至少2个核苷酸的序列阅读，测定步骤b)的杂交的核酸分子的序列，
d)测定微载体上的代码，
e)如步骤d)中所测定的，鉴定与微载体上的代码相对应的俘获寡核苷酸探针的核苷酸序列以及其在参考基因组上的位置，
f)将步骤c)中测定的序列信息与步骤e)中鉴定的信息组合以测定靶核酸分子的序列。步骤c和d可以任何顺序进行。目前本领域已知的方法包括将DNA样品的选择的部分与一组探针结合的步骤。单个的DNA片段与在阵列上的各个探针杂交的信息有丢失，因为所有杂交的DNA片段从阵列中释放并在进一步测序步骤中批量处理。以上确定的问题通过根据本发明的方法解决。本发明引起测定的序列的信息量增加，而同时利用了最近开发的DNA测序技术的优势，例如大通量和速度和灵敏度。本发明精良地显示基因组富集/选择和测序步骤的整合，提供了最小化的测定时间和样品损失以及因而诊断测序测试的改进的特异性。方法促进了测定与参考序列比较的靶核酸分子的序列改变。在优选实施方案中，靶核酸分子包含至少2个核苷酸探针序列。本发明另一个实施方案是用于测定核酸样品的序列的设备，所述设备包含用于将俘获探针与核酸退火的部件，用于测定DNA分子的序列的部件，用于操作微载体的部件和用于测定微载体的代码的部件。在本发明的方法的具体实施方案中，使用多个不同编码的微载体，其中每个代码对应于俘获寡核苷酸探针的唯一序列。优选地，编码的微载体在所述方法的一个或多个步骤中处于悬浮液中。在本发明的方法的其他具体实施方案中，微载体是磁性颗粒或带电颗粒。任选地，在步骤d)中，载体位于磁场中。
在本发明的方法的具体实施方案中，在步骤d)中，编码的载体的代码用光学方法测定。微载体可以是荧光颗粒，其中通过光漂白应用代码。序列测定可以例如通过测定参入的荧光核苷酸的荧光共振能量转移(FRET)进行，但是多种其他已知的测序化学方法是可用的。在本发明的方法的具体实施方案中，步骤c)中测定的序列的长度可具有20-40个核苷酸的长度。如本发明所用的DNA样品可以通过片段化基因组DNA (例如用限制酶)产生。使用这类片段化方法，通过选择特定的限制酶可以选择足够长度的片段化DNA。优选长度为 200-1000个碱基对。本发明另一方面涉及设备用于测定核酸样品的序列，所述设备包含用于将俘获探针与核酸退火的部件，用于测定DNA分子的序列的部件，用于操作微载体的部件和用于测定微载体的代码的部件。这类设备可以是微流设备。在具体实施方案中，用于操作微载体的部件包含用于施加至少一个磁场的装置。根据本发明的方法和设备显著地增加测序的DNA片段的信息含量。在现有技术中，接头DNA序列用于将DNA片段随机固定至基质。在本发明中，DNA片段经由与互补DNA 寡核苷酸探针(俘获探针)杂交被固定至微载体。使用的微载体被编码为识别俘获探针的序列。在本发明的方法中，俘获探针发挥特定地从全基因组DNA中提取DNA片段的功能，类似基于微阵列的基因组选择(MGS)技术。俘获探针任选地进一步发挥作为引物的功能用于基于DNA聚合酶的DNA扩增(PCR-克隆步骤)或单个分子测序方法。本文优选地仅一个 DNA片段结合一个微载体。杂交的(俘获的)DNA片段的信息，或在测序步骤后，测序的片段的信息与俘获探针的信息组合(通过测定微载体上相应代码进行)。编码的微载体的使用使得在溶液中进行反应步骤和操作的全部或部分。通过从来自俘获探针的序列和测定的序列获得的序列信息的增加将显著降低序列组装的时间并将需要复杂度较低的软件和硬件。本发明的以上和其他特征、特点和优势将从以下详述结合附图中变得显而易见， 所述附图通过举例说明本发明的原理。给出的该说明仅用于示例目的，而不限制本发明的范围。以下引用的参考图是指附图。附图简述


图1示意性比较现有技术杂交方法(A)与根据本发明的一个实施方案的杂交方法⑶。A: DNA片段(实线)与连接到不具有代码的微载体的接头(虚线)连接。B: DNA片段(实线)与连接到编码的微载体的俘获探针(点线)杂交。发明详述
本发明应参考具体实施方案和参考特定附图描述，但是本发明不限于此，本发明仅被权利要求限定。权利要求中的任何参考标识不应解释为限制范围。所述附图仅是示意性和非限制性的。在附图中，一些元件的大小可被放大，并且按比例绘制以用于说明性目的。当本说明书和权利要求使用术语“包括”时，其不排除其他要素和步骤。当提及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“一”或“其”(“a”或“an”，“the”)时，这包括该名词的复数，除非另有特别说明。另外，在说明书和权利要求中术语第一、第二、第三和类似术语用于区别相似的要素而对描述连续的或时间顺序是非必要的。应理解的是如此使用的术语在适当的环境中是可互换的，本文中所描述的本发明的实施方案能够以其它而非本文中描述或举例的顺序进行。以下术语或定义单独提供以帮助理解本发明。这些定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。如本发明所用的“(微)载体”涉及颗粒，优选固体颗粒，具有直径0. 1-1000微米。 同义词是“(微)珠”、“(微)颗粒”或“(微)球”或“纳米线”。微珠的形状被认为是本发明的限制。如本发明所用的“俘获探针”涉及寡核苷酸分子(或其部分)，其特定地结合互补核苷酸序列。如本发明所用的“编码的”涉及微载体的可检测性质、例如跳，图案，字母数字信息)，其允许将一种微载体与另一种微载体区别。在其最简单的意思中，其指两种微载体的区别。如本发明所用的“代码”(“代码”)指微载体上的设备可读代码，确保至少100、250、 500,1, 000,2500,5000或10，000的复杂度。由聚合酶依赖的核苷酸参入或连接酶依赖的寡聚体添加测定的DNA序列还称为“序列阅读”。核酸通常为DNA，但是方法也可应用于RNA (例如信使RNA (mRNA)或微RNA)，其也可与寡核苷酸俘获探针杂交并可使用基于逆转录酶的方法被转换成DNA。在这些方法中，俘获寡核苷酸探针可用于步骤c)作为DNA聚合酶的测序引物。本发明涉及杂交和DNA测序方法。根据本发明的方法可应用于任何测序方法， 包括基因组的构象测序以测定物种的株(具体)和世系(race)之间的基因多样性，或基因组的肩关测序。具体实施方案指单个的哺乳动物(特别是人)基因组的测序以鉴定个体的 SNP。样品和核酸片段化
通过使用本发明的方法可以对全基因组DNA选择的部分进行测序。可选地，碰例如分离个别染色体或经由资/貪脉冲场电泳分离片段来部分纯化样品。在与微载体孵育之前，基因组DNA被片段化至选择的长度。通常使用标准技术将样品基因组DNA片段化，递送在80—1000个核苷酸的选择的范围中的片段，但是优选长度取决于俘获探针的选择的长度，并通常长于俘获探针的长度。片段可以使用物理方法获得(例如超声处理，物理剪切)。DNA片段也可使用限制酶(或不同的限制酶的组合)获得，其提供具有确定长度的可预测的和可重复的片段混合物。片段的平均长度可以通过选择短识别位点(导致大量的短片段)或长识别位点(导致少量的短片段)或组合被调整。当使用具有已知的参考基因组序列的全基因组DNA样品时，使用限制酶使得对片段长度和片段末端序列的精确预测。这使得可预测在杂交的探针的3’和5’端未杂交的序列的长度，其在探针3’端的部分可被测序以产生序列阅读。可选地，RNA可用作样品。RNA可以使用基于逆转录酶的方法被转换成DNA。转换后，样品可以如任何其他DNA序列被处理。微载体
本发明所用的微载体由使得寡核苷酸“俘获探针”结合到微载体上的材料制成或用这种材料官能化。寡核苷酸与微载体的偶联是本领域熟知的。该偶联可以是不可逆或可逆的(例如通过硫醇基、酸性基团或不稳定的碱性基团)。在根据本发明的方法中，(并且这与微阵列技术相反)，俘获探针不被基质上的它的坐标(co-ordinate)鉴定但是被微载体的代码或性质鉴定。结果，具有俘获探针的编码的微载体可以在所述方法的至少一个步骤或甚至全部步骤中存在。如本发明所用的微载体可在形状、大小、多孔性、材料和其他特征上变化，取决于对在其中进行根据本方法的测序方法的测定或设备的要求。如本发明所述的方法可以在存在不具有或具有改装的测序装置的情况下进行。因此，直径约1 Mm或约40Mm的微载体分别适于ABI固体测序和‘妨4’ 测序。在某些实施方案中，颗粒具有允许在微流设备中操作颗粒的大小和形状。微载体可具有电荷以允许在电场中操作。
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在其他实施方案中，载体是磁性的或可磁化的颗粒，其允许在磁场中操作、旋转或定位。在其他实施方案中，颗粒使用光钳定位和/或操作。如本发明所用的微载体进一步包括代码，其允许多个载体中鉴定单个的载体。载体的编码在多路方法中是长期已知的，其中载体用具有不同的吸收或发射最大值的发色 、例如标记官能化。例如Luminex (Austin，Texas)提供微载体，包含不同浓度的两种染料，导致100种不同的混合。编码的较高复杂度可通过使用资/貪量子点获得，使用10强度水平和6种颜色允许直至一百万的复杂度。在具体实施方案中，高复杂度可通过使用通过使用非发色条码方法获得，允许大于100000，大于一百万或甚至直至一千万或一亿的的复杂度。不同类型的条码是本领域已知的和包括使用无线射频标签的电子条码、激光蚀刻条码、金属纳米棒(Jain K. (2003) Expert Rev Mol Diagn. 3，153-161; Lehmann (2002) Nature Materials b 12~13； Braeckmans 等人(2002) Nature review, drug discovery 1,447-448所综述的)。在金属纳米棒中，条码提供不同的材料获得，其用于制造载体。在具体实施方案中，条码是具有任何几何学、设计或符号的小型化可读代码，其可在表面上写入或甚至在微载体中或在其上读出的。例如，代码可以被写为数字或字母，或写为以代码符号、图片、条码、环码或三维代码的形式的代码。环代码类似条码，除了使用同心圆而不是直线。可选地，二维模式用于代表代码。在具体实施方案中，使用经由荧光颗粒的部分光漂白在微载体上或其内写入的条码获得高复杂度。该过程允许在颗粒上写入符号、线、数字等。线模式可以在微载体上写入，以使获得可以通过光学设备阅读的条码模式。微载体的空间选择光漂白在 Braeckmans 等人(2003) Nature Materials 2，169—173 和 Serveaux (2007) Langmuir0 25 10272-10279中详述。条码可以在微载体上几次写入，允许阅读条码而与微载体的方向无关。在另一个具体实施方案中，微载体还包含磁性材料，其允许颗粒的磁性操作。这类颗粒的制备在专利申请W02007115815.EP1346224和W00063695中详述。富集和杂交
基于参考基因组(在人样品的情况下，人基因组)选择寡核苷酸的序列，目的是能够从片段化全基因组DNA样品俘获DNA片段。俘获片段来自与俘获探针相同的基因组位置，以使3’来自俘获探针的序列可以使用俘获DNA片段作为模板测序。随后，鉴定微载体上的代码使得鉴定俘获探和结合俘获探针的DNA片段的相关基因组位置，而不需测定该寡核苷酸自身的序列。这允许俘获DNA片段的测序的部分与来自人基因组(或任何其他参考基因组，如果样品是非人来源的)的参考基因组序列的直接比对。本发明的方法包括将包含片段化基因组的DNA样品与多个不同的寡核苷酸俘获探针杂交的步骤，其中多个相同俘获探针连接到单个编码的微载体。根据一个实施方案，基于已知的参考序列设计寡核苷酸，以覆盖染色体的区域、整个染色体或甚至生物的整个基因组。在具体应用中，寡核苷酸被设计成在距用于片段化样品的限制酶的切割位点的确定距离杂交。在该实施方案中，不仅可预测因此俘获的DNA片段的测定的序列，而且可预测测定的序列的长度直到到达片段末端，因此提供测定的序列在参考基因组序列中的位置的 fn息ο可选地，使用寡核苷酸的文库，其与研究的DNA样品的DNA序列无关。与方法无关， 在设计一组探针的过程中要注意的是这组不包括彼此互补的探针对。例如，在变性和随后与DNA片段退火的过程中微载体被暂时操作和定位在表面上以使两个互补探针之间不可能杂交。可选地，产生不同的探针限定组，其不成对杂交。进行用在编码的微载体上的第一组探针进行与片段化DNA的杂交(选择的DNA片段的富集)。在分离结合和未结合的DNA 后，未结合的DNA再次与在类似的编码的微载体上的第二组探针杂交。可以重复该过程直到所有探针与样品中相应DNA片段杂交。杂交后，所有杂交的样品DNA片段可以结合在一起并进一步平行处理。在本发明的方法中，存在这种可能性当大量收集的不同的探针与DNA样品杂交时，两种(或多种)不同的探针在单个DNA片段的不同位置杂交。在这种情况下，DNA片段将携带两种(或多种)不同的代码和随后这类颗粒的测序将产生多个信号。不同的探针结合同一 DNA片段的机会可以通过使用不同的限制酶或剪切条件增加探针的长度和/或降低DNA片段的平均长度来最小化。俘获探针可以是具有不同长度，通常长于用于所谓基于阵列的测序的长度，其中测序基于DNA片段的差异杂交，其优选结合完全一致的杂交探针。较长的俘获探针借助于部分杂交促进俘获DNA片段，其中允许俘获探针和DNA片段之间的错配，但是与测序阅读不相关。俘获寡核苷酸与DNA杂交的长度可从约15直至30，40，60，75，90或150或200 个核苷酸变化。俘获探针优选地超过40个核苷酸长。除了寡核苷酸的杂交部分，俘获探针可包括另外的寡核苷酸或其他分子，其发挥微载体和杂交部分之间的间隔区的功能。探针的杂交部分越长，样品中发生的互补序列频率越低，但是DNA片段的俘获更具选择性，而同时允许错配，原因在于存在的不干扰俘获的未知的突变(特别是在癌症基因组样品中)。俘获探针可以是在5’和3’结合微载体表面，但是如果选择是用于随后聚合酶扩增反应或使用俘获探针作为引物和使用聚合酶通过合成测序反应，俘获探针用其5’末端偶联到微载体表面。具有偶联的俘获寡核苷酸的微载体根据用于基因组富集的标准方法与片段化的 DNA样品孵育，如所述的，经历足够时间(例如3天，优选地M小时，甚至更优选地在180 分钟下)以通过与俘获探针特异性杂交特定地俘获足够量的DNA片段。在一个实施方案中，该杂交阶段发生在微流体设备中，其中杂交动力学被最优化， 并且用于最佳俘获所需的时间减少。不同的探针结合同一 DNA片段的机会可以通过使用不同的限制酶或剪切条件增加探针的长度和/或降低DNA片段的平均长度来最小化。片段和探针之间的比值是灵活的，取决于测序俘获片段的方式。在用在一个载体上的同种类型的俘获片段作为引物直接测序多个俘获片段的情况下，俘获探针的占有率要求较高，接近1:1或1:2。这对在测序反应过程中增加信号是必要的。这与当在之间进行涉及扩增俘获片段的PCR步骤相反。在直接单个分子测序的情况下，俘获片段应充分分离的，以能够检测单个的分子测序反应，例如在单个微载体上的一个俘获片段。杂交后，选择反应条件、DNA样品的浓度和寡核苷酸俘获探针以获得所期望的对于微载体的探针占有率，例如高占有率或低占有率。在一个实施方案中，选择反应条件、DNA样品的浓度和寡核苷酸俘获探针以使统计学上仅一个DNA片段结合具有探针的微载体，因为微载体应通常地在其表面携带多个相同探针。可选地，修改微载体的制备以在每个微载体上具有一个探针的最大值。杂交后，去除未结合DNA可以如下进行通过操作杂交反应室外的编码的微珠，或通过将微载体固定到反应室中的位置，然后进行一个或多个洗涤步骤以去除未结合DNA。在某些实施方案中，可以分选微载体群并可集合具有相同代码的同种载体。在该阶段，杂交的DNA可保持连接到探针和微载体并且在方法的剩余过程中被一起处理。在可选的方法中，杂交的DNA可保持连接到探针，而探针从微载体上释放，例如通过减少连接探针与载体的二硫桥。在从一组具有相同代码的同种载体释放俘获DNA片段后，保持它们基因组位置上的信息。测序该选择的片段集合(pool)显示DNA阅读，其在基因组上的位置是已知的。 相同的分选和集合步骤可以用于具有特定代码的微载体的所有其他组。测序反应
所述方法的以下步骤包含测定已与俘获探针杂交的单个DNA片段的序列。本文中，已在杂交方法中用于俘获探针的相同寡核苷酸任选地发挥作为测序引物的功能。在测序方法的过程中，在参入一个或多个核苷酸后，测定参入的序列并测定微载体上的代码。单个分子测序
在一个实施方案中，在俘获后，俘获的片段被直接和单独地测序。用于单个分子测序方法的特别适当的化学法使用荧光标记的核苷酸，使用FRET进行(例如资/貪由Visigen商业化的)。本文工程化的DNA聚合酶含有供体荧光团，四种不同颜色受体荧光团之一连接各个的核苷酸的Y磷酸。当核苷酸被参入时，邻近性引起FRET信号。DNA分子激发(lights up)且颜色显示碱基同一性，因为核苷酸上的荧光团是具有颜色代码的。每一次核苷酸参入，含有荧光团的焦磷酸被释放以使合成的新生链是天然DNA，并且在下一个核苷酸可被参入之前，不需要另外的处理。此处，光学检测检测每个俘获的DNA片段上核苷酸的参入。在可选的具体实施方案中，使用可逆染料终止剂方法，如Ju等人Q006) Proc Natl. Acad. Sci. 103，19635-19640所述。与常规测序方法相反，仅使用终止剂核苷酸， 其各个具有不同的荧光标记，以使仅一个核苷酸可以通过DNA聚合酶参入。测定参入核苷酸的性质并去除终止剂基团和荧光基团。之后，可以进行另外的测序步骤。肓接测序
在一个实施方案中，在俘获后对俘获的片段直接测序，并且对组合的信号光学检测。此处，存在足够的俘获片段以能够在测序反应过程中检测各个核苷酸的参入，其中信号由一个微载体上多个俘获探针同时发生的测序反应构成。这是最适于非癌症基因组DNA样品的测序，如用于临床遗传学诊断，其中期望在DNA片段混合物中的两个等温基因的最大量。基于乳液
在具体实施方案中，在乳液中的一个或多个步骤过程中存在编码的微载体，所述乳液发挥作为反应室(小反应器(picoreactor))反应的功能，资/貪用于进行基于PCR的扩增反应。在这些乳滴扩增方法中，微载体保持存在以保留俘获探针的序列信息。相同地，在从微载体去除DNA的应用中，微载体保持在同一乳滴/微孔中以避免微载体上的编码的信息丢失。具有俘获探针的编码的微载体与油中的基因组DNA片段混合以产生乳液。选择不同成分的浓度以使具有俘获探针的单个编码的微载体和单个DNA片段和扩增试剂最后一起存在于乳液中的每个乳滴小反应器中。当使用磁性颗粒时，它的磁性性质可以用于运输和操作乳液滴和排列颗粒。珠可以单独操作，其使用它们磁性能力和微流性质以运输它们。 在这种情况下，在随后步骤中，可以添加扩增和测序成分。本文中，珠是彼此分离且固定的以达到可以检测单个的微载体测序反应的程度。通常地，保持较低温度以防止测序作用开始直到准备检测。乳滴以行或格子排列，然后通过增加温度以启动聚合酶，在一滴中开始测序反应，接着在下一滴中进行。多个检测器可以高通量方法以这种方式使用。通常地，在测序反应中，具有俘获探针的编码的微载体与油中的基因组DNA片段混合以产生乳液。选择不同成分的浓度以使具有俘获探针的单个编码的微载体和单个DNA 片段和扩增试剂最后一起存在于乳液中的每个乳滴小反应器中。当使用磁性颗粒时，它的磁性性质可以用于运输和操作乳液滴和排列颗粒。珠可以单独操作，其使用它们磁性能力和微流性质以运输它们。在这种情况下，在随后步骤中，根据特定测序化学法(资/貪焦磷酸测序)的要求，可以添加测序成分并洗掉。本文中，珠是彼此分离以达到可以检测单个的测序反应的程度。在另一可选的具体实施方案中，使用所谓“焦磷酸测序”或“454”测序方法的修改形式(US7211390和US 6956114)。在现有技术方法中，DNA片段经由一种类型的接头分子连接到一种类型的微载体(参见图1A)。这些载体是单个地分配到乳滴中并设置在基质上的孔中。孔含有用于测序反应的必需的试剂和酶(聚合酶、硫酸化酶和萤光素酶)并作为分离的反应室。在测序反应过程中，DNA核苷酸以试剂流顺序添加到样品中。每次参入一个核苷酸，硫酸化酶和萤光素酶通过发出光信号报告这次参入。因此从通过在珠上合成的测序专门地获得测序信息。在本发明的一个实施方案中，DNA片段经由杂交编码的微载体上的俘获探针而连接(图1B)。在该变体中，通过焦磷酸测序技术获得的序列信息可以与通过测定微珠的代码的探针的序列信息组合。这些代码可以是在测序反应之前测定的，或对于那些反应仅提供足够测序信号的反应可以在测序反应后阅读。除了聚合酶依赖的测序，本发明的方法也可用其他测序方法例如DNA连接酶依赖的寡核苷酸的退火进行，如^iendure等人Q005) Science 309，1728-1732所述的。微载体的处理
取决于测序方法，微载体定位在基质(检测区域)上用于检测参入序列和鉴定编码的微载体，例如在微型孔中。定位可以不同的方式发生例如重力或离心，经由电势原因在于载体中的电荷或利用连接到微载体的DNA的电荷。在具体实施方案中，使用磁场将微载体操作至检测区域。根据另一实施方案，使用泵、电渗法、经由电钳的操作或经由磁场的操作，将微载体操作在微流系统中。一旦微载体在检测室中通过，发生检测。任选地，微载体在磁场和/ 或电场中定位和/或旋转以使颗粒束缚(caged)足够长得时间进行检测。在具体实施方案中，其中使用部分光漂白得磁性颗粒，这些微载体被定位和旋转以允许在微载体的代码的光学检测(资/貪条码或发色标记)。检测步骤
在如本发明所述的方法中，发生两个不同的检测步骤
第一检测步骤包含鉴定微载体的代码(资/貪条码的光学检测)，其提供俘获探针的序列，所述俘获探针已用于杂交来自样品的核酸例如DNA和任选地已用作序列引物。第二检测步骤包含检测杂交微载体的核苷酸片段的序列。这些检测步骤的顺序也可颠倒。如上所述的可逆染料终止剂测序方法通常允许测定DNA分子的约30个核苷酸。 当多态性发生在这类短片段中时，这可能容易被忽视，并且当具有多态性的序列序列在基因组的另一部分中作为野生型存在时，其变得未被注意到。从俘获探针获得的另外序列的存在允许测定在基因组上的测序的阅读的位置，从而避免这类问题。在这类情况下，其中测定的序列与基因组不同位置存在的序列高度相似或相同， 邻近测定的序列的引物序列显著增加样品中DNA片段的信息量并且增加解释实验测序数据的准确度。相同地，具有测序错误的短片段可具有与位于基因组的另一部分处的序列精确的匹配，导致例如不正确序列组装等问题。任选地，序列信息的第三部分获自测定的序列的长度。基于俘获探针在序列和用于制备的限制酶中的位置，可能的是确定由用于进行测序的DNA聚合酶产生的DNA的长度。通过测序获得的序列长度的测定表明限制位点是否在预测的位置。当使用限制酶切割 DNA时应用其，且继续测序反应直到DNA片段的末端。如本发明所述的方法具有多种优势性质。探针的设计允许仅测定序列的目的部分。如本发明所述的方法允许快速和r可信的SNP/突变检测和结构DNA变化，例如拷贝数变化和重排，并避免由重复序列或假基因引起的错误和由随后测序过程引入的错误。分析 DNA测序阅读结果所需的时间将显著减少，因为至少一部分的序列，或甚至测序阅读在基因组上的的位置是已知的。另外，进行数据分析的硬件要求因此显著降低，以使分析可再标准个人计算机上进行。本发明的方法的进一步优势是例如提高的速度，称为经由阅读代码对俘获探针的序列的鉴定比测序探针本身快得多。根据本发明的设备
本发明另一方面涉及用于进行上述DNA测序方法的设备。这类设备包含微载体操作部件，用于将俘获探针与核酸杂交的部件，用于鉴定退火至俘获探针的DNA片段(之前)的序列的序列测定部件和用于测定微载体上代码(其鉴定连接的俘获寡核苷酸探针)的部件。杂交部件通常是反应室，其中核酸样品(通常为DNA)与编码的微载体上的寡核苷酸俘获探针接触。该反应室含有元件以可控方式改变温度用于变性和退火样品。杂交部件任选地包含进口用于施加或去除核酸样品、缓冲剂、试剂、寡核苷酸俘获探针。缓冲剂等的替换可以通过液体洗涤步骤进行或可以通过将寡核苷酸载体操作至设备的另一部件来进行，例如通过磁性操作磁性微载体。根据一个实施方案，杂交部件还在杂交前使用，用于用一种或多种限制酶片段化
11DNA样品。序列测定部件包含反应室，其中进行由DNA聚合酶参入核苷酸，和检测室，其中进行鉴定参入的核苷酸。在测序部件的特别配置中，反应和检测发生在同一室，例如具有透明部分的反应室。本文中，微载体被设置在表面上或孔中用于检测参入的核苷酸，所述微载体在单分子测序的情况下含有一个DNA片段或可选地携带多个相同片段(作为基于载体PCR 克隆步骤的结果)，其中载体上的片段是相同的。然后释放微载体用于进一步测序反应。在另一特别配置中，测序部件包含反应室，其与检测部件分离(洶义/^|存检测器的微流通道)。在反应后，微载体经由微流操作或电操作被操作至检测部件。在具体实施方案中，其中磁性颗粒使用，微载体的操作通过施加磁场进行。设备进一步包含代码测定部件。取决于微载体上的代码和参入核苷酸的性质，检测部件(其用于测定序列)也可用于鉴定微载体上的代码。例如，四种不同的荧光标志物用于标记测序核苷酸和以不同强度的第五种荧光标记物用于标记微载体。在另一实施方案中，两种不同的检测器在同一检测区域使用，其中第一检测器测定DNA序列，之后第二检测器测定微载体上的代码(事件的这种顺序可以是等同颠倒的)。在另一实施方案中，微载体在微流设备中操作，其中通过第一检测器在流体设备的第一位置测定序列和通过第二检测器在流体设备的第二位置测定微载体上的代码。设备的不同室和检测器是本领域已知的。磁性颗粒的操作已在例如美国申请 US20080314749中详述。测序方法和设备由资/貪Ilumina，Applied Biosystems和Roche公开。用于操作载体的方法和设备已描述在例如PCT申请W00470362中。本发明涉及杂交和DNA测序的方法和设备。利用参考基因组包括人基因组的序列的公众可获得的信息。根据本发明的方法可应用于任何测序方法，但是在肿瘤学诊断领域还在临床遗传学和微生物学中是特别有用的。高度相关的临床应用是癌症基因组选定部分的测序，其含有大量还未知的DNA异常，对于各个测序的肿瘤是不同的，象例如单个或多个核苷酸突变、缺失和扩增、倒位和染色体重排。“&不通过阵列上杂交的测序资衍，板具有每种单个俘获探针的情况下，一个序列阅读的一个核苷酸可被测定，并且俘获探针和被俘获的DNA片段之间的精确互补性是至关重要的(不允许错配)以使得一个测序阅读的组装；在上述癌症测序的情况下，在俘获探针中太多的突变要求能够测序癌症基因组的足够的部分。在此处所述的本发明中，俘获探针足够长以允许结合结合含有一个或多个错配的 DNA片段，而随后，测序包含至少2个核苷酸的俘获片段序列的未知部分，在俘获片段的杂交的部分的5’第一个核苷酸起始。这能够测序多个未知的突变。但是除了该应用，本发明也可用于其他诊断应用，例如用于测序基因组的(大)部分，用于临床遗传学或用于病原体测序。本发明特别适于测序从生物样品(象例如癌症活检)分离的细胞的全基因组中选择的片段。相反，ifiiA^Ti^^·游适于测序一种或至多有限数量的确定PCR产物，并且不能测序获自片段化全基因组的DNA片段。具体化本发明的系统和方法的其他排列对于本领域技术人员是显而易见的。应理解的是虽然优选实施方案、具体构造和配置以及材料已在本文中讨论用于根据本发明的设备，但是可以进行在形式和细节上的各种变化或修改而不偏离本发明的范围和精神。
权利要求
1.一种用于测定靶核酸分子的序列的方法，所述方法包括以下步骤a)提供与编码的微载体连接的俘获寡核苷酸探针，其中所述微载体的代码鉴定所述寡核苷酸探针的序列和/或其在参考基因组上的位置，b)将所述俘获寡核苷酸探针与包含核酸分子的样品杂交，其中所述核酸分子包含至少部分与俘获寡核苷酸探针的序列互补的序列，c)通过产生至少2个核苷酸的序列阅读，测定步骤b)的杂交的核酸分子的序列，d)测定微载体上的代码，e)鉴定与如步骤d)中所测定的微载体上的代码相对应的俘获寡核苷酸探针的核苷酸序列以及其在参考基因组上的位置，f)将步骤c)中测定的序列信息与步骤e)中鉴定的信息组合以测定靶核酸分子的序列。
2.根据权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子包含至少2个核苷酸探针序列。
3.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中所述编码的微载体在所述方法的一个或多个步骤中处于悬浮液中。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中使用多个不同编码的微载体，以及其中每个代码对应于俘获寡核苷酸探针的唯一序列。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述微载体是磁性颗粒或带电颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中利用俘获探针作为测序引物进行测序反应。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中在微载体紧密接近处之上或之中克隆扩增后进行测序反应。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中在步骤d)中编码的载体的代码用光学方法测定。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述核酸样品是用限制酶片段化的基因组 DNA。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中俘获寡核苷酸探针的长度是40-200个核苷酸。
11.一种用于测定核酸样品的序列的设备，所述设备包含用于将俘获探针与核酸退火的部件，用于测定DNA分子的序列的部件，用于操作微载体的部件和用于测定微载体的代码的部件。
12.根据权利要求10的设备，其是微流设备。
13.根据权利要求11或12的设备，其中所述用于操作微载体的部件包含用于施加至少一个磁场的装置。
全文摘要
本发明涉及用于测定靶核酸分子的序列的方法。本文中俘获寡核苷酸探针与编码的微载体连接，其中所述微载体的代码鉴定所述寡核苷酸探针的序列。将俘获寡核苷酸探针与包含核酸分子的样品杂交，其中所述DNA片段包含与俘获寡核苷酸探针的序列互补的序列。测定DNA分子的序列，其中俘获寡核苷酸探针用作DNA聚合酶的引物，在单一分子测序的情况下，其是测序引物。序列测定后，俘获寡核苷酸探针的核苷酸序列通过测定对应于俘获寡核苷酸探针的微载体上的代码来鉴定。该序列信息直接鉴定测序的DNA片段在基因组上的位置，允许直接比对。
文档编号C12Q1/68GK102333890SQ201080009514
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月26日 优先权日2009年2月27日
发明者范 德 斯托尔普 A., M. J. 邓 图恩德 J., J. 范 德 扎格 P. 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司