专利名称：含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法
技术领域：
本发明涉及一种含CpG DNA片段的制备方法，尤其涉及含CpG DNA(CpG DNA是指含胞嘧啶和鸟嘧啶二核苷酸基序的脱氧核糖核酸，CpG DNA是本领域技术人员熟知且惯用的技术术语)畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法。
背景技术：
新型免疫佐剂CpG DNA的发现源于细菌DNA和特定序列反义寡核苷酸(ODN)的免疫刺激作用。最初科学家认为是细菌DNA中某些回文结构具有免疫刺激作用，后来其他科学家发现特定序列反义寡核苷酸也具有免疫刺激作用，并比较了多种序列寡核苷酸的免疫刺激作用，最后发现无论细菌DNA还是特定序列反义寡核苷酸，它们的免疫刺激作用都由于其中含有特定非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序。CpG DNA引起B细胞分化，刺激B细胞分泌IL-6、IL-10等细胞因子和表达MHC II、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B细胞的凋亡。CpG能直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，引起这些细胞分泌IL-12、TNF-α等Th1样为主的细胞因子，并刺激细胞表面分子MHC II、B7-1、B7-2的表达。CpG在IL-12协同下直接激活NK细胞，激活的NK细胞杀伤活性增强，并分泌IFN-γ，IFN-γ反过来又能进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的激活。CpG不仅能有效地激活天然免疫，而且能有效地激活获得性免疫，CpG能协同刺激抗原特异性B细胞和T细胞分化，在Th1细胞因子的作用下，显著增强获得性细胞免疫，这些特性使CpG DNA成为优良的T细胞免疫佐剂。虽然CpG是一种极有前途的新型高效免疫佐剂，能有效提高疫苗的效价。但要大规模地走向实际生产，就必需解决生产成本过高的问题，目前生产CpG ODN主要采用人工合成的方法，需高价格的dNTP和DNA合成仪，且生产量有限，不适应大规模工业化生产及实际应用的要求。
技术内容本发明提供一种生产成本低且其所得产物能够提高疫苗效价的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法。
本发明采用如下技术方案来解决其技术问题一种能促进畜禽疫苗效价的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，第一步基因工程重组质粒的制备根据由序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGG---3’、5’----GGTGCGTCGATGCAGGGGGG---3’及5’---TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT---3’串联而成的D19D282006目的片段DNA的序列，合成其寡核苷酸正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线性载体末端相匹配的碱基序列，然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，形成含CpG基序的目的片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组质粒；第二步根据目的片段两端的重组质粒DNA序列，设计特异引物；第三步以重组质粒为模板，加入特异引物，并进行三温循环的PCR扩增，具体参数为92℃～98℃预变性5～10分钟；92℃～98℃，45～60秒，50～58℃，45～60秒，72℃，45～60秒，进行30～35个循环；最后在72℃延伸10分钟。
考虑到进一步提高由本发明所得疫苗佐剂的作用，且进一步降低生产成本，上述重组质粒包括第一重组质粒，该第一重组质粒含第一DNA片段，采用人工合成的方法合成第一DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGA----3’，人工合成第一DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGC ACCA----3’，退火后形成第一DNA片段，第一DNA片段的3’端有突出的腺嘌呤(A)，以便与T载体中5’端突出的胸腺嘌呤(T)互补，连接后形成第一重组质粒PCPG1/T。重组质粒还包括第二重组质粒，该第二重组质粒含第二DNA片段，采用人工合成的方法合成第二DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----CGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCG ATGCAGGGGGGC----3’
人工合成第二DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3退火后形成第二DNA片段，第二DNA片段的的两端为粘性末端，与经SphI、NcoI双酶切的第一重组质粒的两端相匹配，连接后形成第二重组质粒PCPG12/T。重组质粒还包括第三重组质粒，该第三重组质粒含第三DNA片段，采用人工合成的方法合成第三DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----CTAGTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGCTGCA----3’人工合成第三DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’退火后形成第三DNA片段，第三DNA片段的的两端为粘性末端，与经SpeI、pstI双酶切的第二重组质粒的两端相匹配，连接后形成第三重组质粒PCPG123/T。
实验结果表明，PCR法生产CpG DNA片段，扩增出的目的条带与理论大小一致，且优化条件后，非目的条带的含量很少。为能更方便地进行PCR反应，本发明用未经纯化的PCR产物做模板，采用与质粒模板相同的反应条件和循环参数进行PCR扩增，获得了与质粒模板相当的产量和纯度的PCR产物。这样就不需要生产重组质粒，进一步降低了生产成本。本发明选择了不同的循环数，最大限度地提高PCR产量。本发明以基因工程法制备的特有的重组质粒为模板，并设计特异的通用引物，以PCR法生产含CpG DNA片段，使大规模工业化、低成本生产CpG DNA片段成为现实。以第二重组质粒为模板，加入通用的上、下游特异引物，能扩增出大小约240bp的CpG DNA片段；以第三重组质粒PCPG123/T为模板，加入通用的上、下游特异引物，能扩增出大小约300bp的CpG DNA片段，扩增出的CpG DNA片段与理论值一致。应用外周血单个核细胞培养、[3H]-脱氧胸苷掺入检测法、以刺激指数(SI值)为检测指标，比较了CpG DNA片段刺激猪外周血单个核细胞增殖的作用。结果表明含CpG DNA片段对猪外周血单个核细胞均具有良好的免疫刺激活性，SI＞4-5。配合疫苗使用，提高疫苗的免疫效果，并能有效避免现常用佐剂中造成的炎症反应等不良副作用。本佐剂生产成本低廉，适于工厂化生产。与现有技术相比，具有以下优点和积极效果①本发明所提供PCR法生产CpG DNA片段，将对猪具有良好免疫刺激活性的CpG ODN D19、D28和2006串联在一起，其中D型CpG ODN D19、D28能中等程度的刺激猪外周血单个核细胞的增殖，且能分泌高水平的IFN-γ；K型ODN 2006能最高水平的刺激猪PBMC的增殖，K型和D型的串联，能取长补短，提高CpG佐剂的效能。②本发明所提供的PCR法生产CpG DNA片段，仅含有CpG DNA核心序列，无其它无关序列，避免了非特异性序列对CpG DNA免疫刺激活性的干扰。③本发明所提供的PCR法生产CpG DNA片段，所采用PCR方法为成熟的DNA体外合成法，仅需加入模板、dNTP、缓冲液和聚合酶，即可在PCR仪上生产，工艺简单，成本低廉，符合于大规模工业化生产的需要。极大地降低了CpG ODN的生产成本。④对牛、鸡、马的研究清楚地显示CpG ODN能增强并能调节对抗原的Th1型或Th2型的免疫反应。因此，CpG ODN作为动物疫苗的新型、高效免疫佐剂是有充实证据的。和大多数用于动物疫苗的佐剂不同，CpG ODN没有引起家畜注射部位的局部炎症反应，按10毫克/公斤体重剂量注射CpG ODN，猴子没有产生明显的局部病变。
图1是CpG片段重组克隆战略图。
图2是重组质粒琼脂糖凝胶电泳图。
图3是第一重组质粒PCPG1/T负链序列分析图及其序列。
图4是第二重组质粒PCPG12/T正链序列分析图及其序列。
图5是第三重组质粒PCPG123/T正链序列分析图及其序列。
图6质粒PCPG12/T的PCR产物。
图7质粒PCPG123/T的PCR产物。
实施例实施例1一种能促进畜禽疫苗效价的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，第一步基因重组质粒的制备根据由序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGG---3’、5’----GGTGCGTCGATGCAGGGGGG---3’及5’---TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTt---3’
串联而成的D19D282006目的片段DNA的序列，合成其寡核苷酸的正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线形载体末端相匹配的碱基序列，然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，形成含D19D282006序列的DNA片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体；第二步根据目的片段两端的重组质粒DNA序列，设计特异引物；第三步以重组质粒为模板，加入特异引物，并进行三温循环的PCR扩增，具体参数为92℃～98℃预变性5～10分钟；92℃～98℃，45～60秒，50～58℃，45～60秒，72℃，45～60秒，进行30～35个循环；最后在72℃延伸10分钟，本实施例中，重组质粒包括第一重组质粒，该第一重组质粒含第一DNA片段，采用人工合成的方法合成第一DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGA----3’，人工合成第一DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGC ACCA----3’，退火后形成第一DNA片段，第一DNA片段的3’端有突出的腺嘌呤(A)，以便与T载体中5’端突出的胸腺嘌呤(T)互补，连接后形成第一重组质粒PCPG1/T；本实施例的重组质粒还包括第二重组质粒，该第二重组质粒含第二DNA片段，采用人工合成的方法合成第二DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----CGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGTGCGTCGATGCAGGGGGGC----3’人工合成第二DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3’退火后形成第二DNA片段，第二DNA片段的两端为粘性末端，与经SphI、NcoI双酶切的第一重组质粒的两端相匹配，连接后形成第二重组质粒PCPG12/T；本实施例的重组质粒包括第三重组质粒，该第三重组质粒含第三DNA片段，采用人工合成的方法合成第三DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----CTAGTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGCTGCA----3’人工合成第三DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’退火后形成第三DNA片段，第三DNA片段的两端为粘性末端，与经SpeI、pstI双酶切的第二重组质粒的两端相匹配，连接后形成第三重组质粒PCPG123/T。本实施例在PCR扩增前，先于通气良好的试管中加入含氨苄青霉素的LB培养基，然后接入含重组质粒的大肠杆菌，于37℃剧烈振摇下培养12～16h，然后将上述培养菌加入到2000ml含氨苄青霉素的LB中，于37℃剧烈振摇下培养12～16h，最后于4℃以6000转/分离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全部流尽，用碱裂解法制备重组质粒PCPG12/T和PCPG123/T。
实施例2第一步基因工程重组质粒的制备1基因工程重组质粒的构建1.1第一DNA片段正链和负链寡核苷酸的人工合成人工合成第一片段寡核苷酸正链序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGA----3’寡核苷酸负链序列为5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGC ACCA----3’，1.2第一片段的合成将人工合成并纯化的上述寡核苷酸正负链、退火缓冲液、无菌重蒸水按下列配方混合后，以1000转/分离心30秒，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，该退火反应体系如下正链1μl负链1μl5倍退火缓冲液 16μl无菌重蒸水 2μl总体积 80μl1.3DNA片段与T载体连接反应将上述DNA片段10倍稀释后，与T载体在大肠杆菌DNA连接酶的作用下，4℃连接反应约16h，获得重组质粒PCPG1/T。用市场购买的promega T载体试剂盒中的对照片段与T载体连接做阳参，T载体自身连接做阴参，连接反应体系如下DNA片段 T载体ControlT载体 0.5μl 0.5μl 0.5μlDNA片段 1.25μl 0.0μl 0.0μlControl DNA(4ng/μl)0.0μl 0.0μl 1.5μl10×buffer 1.0μl 1.0μl 1.0μlT4 DNA ligase(3unit/μl)0.5μl 0.5μl 0.5μlddH2O 6.75μl 8.0μl 6.5μlTotal volume10.0μl 10.0μl 10.0μl1.4重组质粒转化大肠杆菌DH5α1.4.1LB琼脂板和氨苄青霉素抗性LB琼脂板的制备先按下列配方配制LB液体培养基、LB琼脂液，15磅，20min，高压灭菌，铺于直径为90mm的培养皿中，制备成LB琼脂板；按上述同样的方法；配制LB琼脂液，冷却到50℃，加入终浓度为75μg/ml的氨苄青霉素，混匀后，铺于直径为90mm的培养皿中，制备成含氨苄青霉素抗性LB琼脂板，冷却后置4℃放置备用。
LB液体培养基蛋白胨(Bacto-Tryptone) 8g酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)5gNaCl 5g加ddH2O溶解，用10N NaOH调pH至7.4，定容至1000ml，即为LB液体培养基。
LB琼脂液称取15g的琼脂粉，加入1000ml的LB液体培养基，即为LB琼脂液。
1.4.2感受态大肠杆菌DH5α的制备用白金耳从-70℃冻存的用预冷的大肠杆菌DH5α中沾取少许，在该LB琼脂板培养板上划线，37℃培养过夜。挑取一单菌落接种于含75μg/ml的Amp的LB液体培养基(配方见下)，37℃培养过夜，以2％的比例转种入LB液体培养基，240rpm，37℃振荡培养至OD600约0.5，置冰水中10min；4℃，6000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀用0.5倍菌体体积、冰水预冷的100mmol/L CaCl2悬浮；冰水中孵浴30min，4℃，6000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀用0.1倍菌体体积、冰水100mmol/L CaCl2悬浮，置冰水中备用。
1.4.3重组子转化大肠杆菌DH5α将10μl连接产物与100μl感受态菌混合后，置冰水中孵浴30min，再于42℃水浴90sec，立即置冰水中放置2min，加入0.8ml的LB培养基，150rpm，37℃振荡培养1h。
1.4.4铺板取备用的氨苄青霉素抗性LB琼脂板，37℃孵箱中放置1h，取200μl重组子转化大肠杆菌DH5α的菌液均匀涂于氨苄青霉素抗性LB琼脂板，置37℃孵箱中过夜。
本发明采用以下方法来验证1.5重组质粒的制备1.5.1细菌的收获1)将2ml含75μg/ml氨苄青霉素的LB加入到容量为15ml并通气良好的试管中，从上述氨苄青霉素抗性LB琼脂板挑取一单菌落接入，于37℃剧烈震荡培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30sec，将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸取培养液，使菌体沉淀尽可能干燥。
1.5.2碱裂解法1)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡。
溶液I50mmol/L50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)在10bf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于4℃。
2)加入200μl新配制的溶液II。
溶液II0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现配现用)1％SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，以确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要震荡，将离心管置于冰上。
3)加150μl冰冷的溶液III。
溶液III5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配制的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10sec，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。
4)用微量离心机于4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
5)加等量的酚氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心2min，将上清转移到另一离心管中。
6)加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，于室温放置2min。
7)用微量离心机于4℃以12000g离心5min。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
9)用1ml 4℃ 70％乙醇洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10min。
10)用40μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃备用。
1.6质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳1)用胶布将洗净、干燥的水平制胶板开口封住，形成一个胶模，放在水平工作台上。
2)配制足够量的1×TAE电泳缓冲液。取100ml的1×TAE电泳缓冲液放入三角烧瓶中，加入准确称量的1g的琼脂糖。
1×TAE0.04mol/L Tris-乙酸0.001mol/LEDTA
3)在微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解。
4)使溶液冷却至60℃。加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，充分混匀。
5)将温热的琼脂糖倒入胶模中，凝胶的厚度在3~5min，并插入梳子。
6)在凝胶完全凝固后，小心移去梳子和胶布，将凝胶放入电泳槽中。
7)加入恰好没过胶面约1mm深的足量的电泳缓冲液玻璃板感受态的DH5α和BL21(DE3)，分别用作克隆菌和表达菌，将重组质粒分别转入，用于进行鉴定和表达。
8)取5μl质粒DNA样品，加适量的加样缓冲液混合后，用微量加样器慢慢将混合物加至样品槽中。
9)盖上电泳槽并通电，适量电压下电泳40～60min。
10)断电流，在紫外灯下检查凝胶，并用凝胶成像仪进行摄影(见图2)。
1.7重组质粒的核苷酸序列测定与分析本发明将筛选出的重组阳性克隆菌株，用上海申能博彩的质粒提取试剂盒提取质粒，核酸定量分析后作为模板，分别用通用的T7启动子引物、SP6引物，在ABI377全自动序列分析仪进行序列测定(见图3)。
第二步引物设计PCR引物的设计因该重组质粒中，胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)含量很高，故根据目的片段两端的重组质粒DNA序列，用GeneTool软件进行Primer分析，从中筛选出符合最佳的引物。并由上海申能博彩公司进行合成，PCR试剂盒为上海生工生物工程公司产品。
上游引物5’---CCCAAGCTTGGGCCCGACGTCGCATGC---3’下游引物5’---GCGGATCCCCCATATGGTCGACCTGCAGCC---3’第三步PCR扩增第一重组质粒PCPG1/T的大量制备(1)将8ml含Amp的LB加入到容量为15ml并通气良好的试管中，然后接入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养12～16h。
(2)将上述培养菌加入到2000ml含Amp的LB中，于37℃剧烈振摇下培养12～16h。
(3)于4℃以6000转/分离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全部流尽。
(4)用真空将残留的上清吸尽。
(5)用50ml缓冲液P1悬浮细菌团块。
(6)加50ml缓冲液P2，盖紧管口，缓缓地颠倒4～6次，混匀内容物，于室温放置5min。
(7)加50ml用冰预冷的缓冲液P3，封住瓶口，摇动离心管，颠倒4～6次，混匀内容物，形成一白色絮状沉淀，裂解物不再粘稠。
(8)将裂解产物倒入滤器，室温放置10min。
(9)打开真空泵开关，将上清抽滤至收集容器中。
(10)加入50ml缓冲液FWB2，轻轻悬浮沉淀，打开真空泵开关，将上清抽滤至收集容器。
(11)加入12.5ml缓冲液ER至滤过的裂解上清，颠倒10次混匀，置冰上放置30min。
(12)用35ml缓冲液QBT平衡QIAGEN-tip 25000柱。
(13)将步骤(11)的裂解上清加入平衡柱。
(14)加入200ml缓冲液QC洗柱。
(15)加入35ml缓冲液QN洗脱结合的DNA。
(16)于洗脱液中加入24.5ml异丙醇，混合，于4℃以16,000转/分离心30min，小心倾去上清。
(17)加入7ml无内毒素的70％乙醇，于4℃以16,000转/分离心10min，小心倾去上清。
(18)敞开管口，室温放置10～20min，用无内毒素的缓冲液TE重新溶解，此步骤中，(4)-(18)操作可采用QIAgen公司的无内毒素质粒制备试剂盒PCR生产含第二重组质粒PCPG1/T的的CpG DNA片段产物本实施例以第三重组质粒PCPG1/T为模板，PCR反应体系PCR反应总体积为100μl，组成成分如下10×PCR buffer 10μl上游引物P1 2.5μl下游引物P2 2.5μl模板 8μl，10mM dNTP 2μl，10mM MgCl26μl5unit/μl Taq酶0.5μl，用无菌重蒸水补足体积至100μl；循环参数如下94℃变性7min；94C，45s；52℃，45s；72℃，1min；共循环30次；72℃延伸7min
1.4PCR产物的纯化(1)PCR结束后，从PCR反应管中将反应液至干净的1.5ml Eppendorf离心管中，加入4倍体积的Solution BS混匀。无论样品量多少，最少需要使用400ul Solution BS。
(2)将3S柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，不要盖上离心管盖，室温放置2分钟；盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上离心管盖子)，用台式离心机高速离心(10000rpm)1分钟。
(3)倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入600ul WashSolution，高速离心(10000rpm)1分钟。
(4)重复步骤3一次。
(5)倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，高速离心(10000rpm)2分钟。
(6)将3S柱放入一根新的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加30ul TE或水，不要盖上离心管盖，室温或37℃放置2分钟。
盖上离心管盖，10000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
1.5DAN定量分析用适量体积的TE缓冲液稀释DNA溶液，用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值，计算DAN含量。
10D260＝50μg/ml的双链DNA实施例3第一步基因工程重组质粒的制备2.1基因工程重组质粒构建2.1.1第二片段正链和负链寡核苷酸的人工合成人工合成第二片段寡核苷酸正链序列为5’----CGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGC----3’寡核苷酸负链序列为5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3
2.2第二片段的合成将人工合成并纯化的上述寡核苷酸正负链、退火缓冲液、无菌重蒸水按下列配方混合后，在1000转/分下离心30秒，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，该退火反应体系如下正链1μl反链1μl5×退火缓冲液 16μl无菌重蒸水 72μl总体积 80μl2.3连接反应用实施例2获得的阳性重组质粒PCPG1/T作为载体，经酶切与第二片段连接反应在K缓冲液中，将获得的阳性重组质粒PCPG1/T用限制性内切酶SphI、NcoI分别酶解，琼脂糖凝胶电泳显示酶切完全；再用限制性内切酶SphI、NcoI双酶切，用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收，与第二片段在大肠杆菌DNA连接酶的作用下，4℃连接反应约16h。转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，经序列分析测定获得阳性重组质粒PCPG12/T。重组质粒的限制性内切酶反应体系和连接反应体系如下双酶切反应质粒PCPG1/T 8μl10×buffer K 5μl0.1％BSA 5μlSphI 2μlNcoI 2μlddH2O28μlTotal 50μl混合均匀后，短暂离心，于37℃水浴2h。1％琼脂糖凝胶电泳，切胶用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收。
连接反应体系如下PCPG2 1.5μlPCPG1/T 10.0μl
10×buffer 1.5μlT4 DNA ligase(3unit/μl) 1.0μlddH2O 1.0μlTotal volume 15.0μl2.4重组质粒转化大肠杆菌DH5α方法同实施例2中的1.4。
本发明采用以下方法来验证2.5重组质粒的制备方法同实施例2中的1.5；2.6质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳方法同实施例2中的1.6，其检测结果(见图2)2.7重组质粒的核苷酸序列测定与分析方法同实施例2中的1.7，其检测结果(见图4)第二步引物设计PCR引物的设计因该重组质粒中，胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)含量很高，故根据目的片段两端的重组质粒DNA序列，用Gene Tool软件进行Primer分析，从中筛选出符合最佳的引物。并由上海申能博彩公司进行合成，PCR试剂盒为上海生工生物工程公司产品。
上游引物5’---CCCAAGCTTGGGCCCGACGTCGCATGC---3’下游引物5’---GCGGATCCCCCATATGGTCGACCTGCAGCC---3’第三步PCR扩增第二重组质粒PCPG12/T的大量制备(1)将8ml含Amp的LB加入到容量为15ml并通气良好的试管中，然后接入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养12～16h。
(3)将上述培养菌加入到2000ml含Amp的LB中，于37℃剧烈振摇下培养12～16h。
(3)于4℃以6000转/分离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全部流尽。
(4)用真空将残留的上清吸尽。
(5)用50ml缓冲液P1悬浮细菌团块。
(6)加50ml缓冲液P2，盖紧管口，缓缓地颠倒4～6次，混匀内容物，于室温放置5min。
(7)加50ml用冰预冷的缓冲液P3，封住瓶口，摇动离心管，颠倒4～6次，混匀内容物，形成一白色絮状沉淀，裂解物不再粘稠。
(8)将裂解产物倒入滤器，室温放置10min。
(9)打开真空泵开关，将上清抽滤至收集容器中。
(10)加入50ml缓冲液FWB2，轻轻悬浮沉淀，打开真空泵开关，将上清抽滤至收集容器。
(11)加入12.5ml缓冲液ER至滤过的裂解上清，颠倒10次混匀，置冰上放置30min。
(12)用35ml缓冲液QBT平衡QIAGEN-tip 25000柱。
(13)将步骤(11)的裂解上清加入平衡柱。
(14)加入200ml缓冲液QC洗柱。
(15)加入35ml缓冲液QN洗脱结合的DNA。
(16)于洗脱液中加入24.5ml异丙醇，混合，于4℃以16,000转/分离心30min，小心倾去上清。
(17)加入7ml无内毒素的70％乙醇，于4℃以16,000转/分离心10min，小心倾去上清。
(18)敞开管口，室温放置10～20min，用无内毒素的缓冲液TE重新溶解，此步骤中，(4)-(18)操作可采用QIAgen公司的无内毒素质粒制备试剂盒；1.3PCR生产含第二重组质粒PCPG12/T的的CpG DNA片段产物本实施例以第三重组质粒PCPG123/T为模板，PCR反应体系PCR反应总体积为100μl，组成成分如下10×PCR buffer 10μl上游引物P1 2.5μl下游引物P2 2.5μl模板8μl，10mM dNTP 2μl，10mM MgCl26μl5unit/μl Taq酶 0.5μl，用无菌重蒸水补足体积至100μl；循环参数如下94℃变性7min；94℃，45s；52℃，45s；72℃，1min；共循环30次；72℃延伸7min1.4PCR产物的纯化
(7)PCR结束后，从PCR反应管中将反应液至干净的1.5ml Eppendorf离心管中，加入4倍体积的Solution BS混匀。无论样品量多少，最少需要使用400ul Solution BS。
(8)将3S柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，不要盖上离心管盖，室温放置2分钟；盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上离心管盖子)，用台式离心机高速离心(10000rpm)1分钟。
(9)倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入600ul WashSolution，高速离心(10000rpm)1分钟。
(10)重复步骤3一次。
(11)倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，高速离心(10000rpm)2分钟。
(12)将3S柱放入一根新的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加30ul TE或水，不要盖上离心管盖，室温或37℃放置2分钟。
盖上离心管盖，10000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
1.5DAN定量分析用适量体积的TE缓冲液稀释DNA溶液，用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值，计算DAN含量。
10D260＝50μg/ml的双链DNA实施例4第一步基因工程重组质粒的制备3基因工程重组质粒的构建3.1第三片段正链和负链寡核苷酸的人工合成人工合成第三片段寡核苷酸正链序列为5’----CTAGTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGCTGCA----3’寡核苷酸负链序列为5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’3.2第三片段的合成将人工合成并纯化的上述寡核苷酸正负链、退火缓冲液、无菌重蒸水按下列配方混合后，在1000转/分下离心30秒，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，该退火反应体系如下正链 1μl反链 1μl5×退火缓冲液16μl无菌重蒸水 72μl总体积 80μl3.3连接反应用实施例3获得的阳性重组质粒PCPG12/T作为载体，经酶切与第三片段连接反应在K缓冲液中，将获得的阳性重组质粒PCPG12/T用限制性内切酶SphI、NcoI分别酶解，琼脂糖凝胶电泳显示酶切完全；再用限制性内切酶SphI、NcoI双酶切，用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收，与第三片段在大肠杆菌DNA连接酶的作用下，4℃连接反应约16h。转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，经序列分析测定获得阳性重组质粒PCPG123/T。重组质粒的限制性内切酶反应体系和连接反应体系如下双酶切反应质粒PCPG1/T 8μl10×buffer K 5μlpstI 2μlSpeI 2μlddH2O 33μlTotal50μl混合均匀后，短暂离心，于37℃水浴2h。1％琼脂糖凝胶电泳，用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收。
连接反应体系如下
PCPG2 1.5μlPCPG1/T10.0μl10×buffer 1.5μlT4 DNA ligase(3unit/μl) 1.0μlddH2O 1.0μlTotal volume 15.0μl3.4重组质粒转化大肠杆菌DH5α方法同实施例2中的1.43.5重组质粒的制备方法同实施例2中的1.5。
本发明采用以下方法来验证3.6质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳方法同实施例2中的1.6，其检测结果(见图2)3.6重组质粒的核苷酸序列测定与分析方法同实施例2中的1.6，其检测结果(见图5)。
第二步引物设计PCR引物的设计因该重组质粒中，胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)含量很高，故根据目的片段两端的重组质粒DNA序列，用GeneTool软件进行Primer分析，从中筛选出符合最佳的引物。并由上海申能博彩公司进行合成，PCR试剂盒为上海生工生物工程公司产品。
上游引物5’---CCCAAGCTTGGGCCCGACGTCGCATGC---3’下游引物5’---GCGGATCCCCCATATGGTCGACCTGCAGCC---3’第三步PCR扩增第三重组质粒PCPG123/T的大量制备(1)将8ml含Amp的LB加入到容量为15ml并通气良好的试管中，然后接入一单菌落，于37C剧烈振摇下培养12～16h。
(4)将上述培养菌加入到2000ml含Amp的LB中，于37℃剧烈振摇下培养12～16h。
(3)于4℃以6000转/分离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全部流尽。
(4)用真空将残留的上清吸尽。
(5)用50ml缓冲液P1悬浮细菌团块。
(6)加50ml缓冲液P2，盖紧管口，缓缓地颠倒4～6次，混匀内容物，于室温放置5min。
(7)加50ml用冰预冷的缓冲液P3，封住瓶口，摇动离心管，颠倒4～6次，混匀内容物，形成一白色絮状沉淀，裂解物不再粘稠。
(8)将裂解产物倒入滤器，室温放置10min。
(9)打开真空泵开关，将上清抽滤至收集容器中。
(10)加入50ml缓冲液FWB2，轻轻悬浮沉淀，打开真空泵开关，将上清抽滤至收集容器。
(11)加入12.5ml缓冲液ER至滤过的裂解上清，颠倒10次混匀，置冰上放置30min。
(12)用35ml缓冲液QBT平衡QIAGEN-tip 25000柱。
(13)将步骤(11)的裂解上清加入平衡柱。
(14)加入200ml缓冲液QC洗柱。
(15)加入35ml缓冲液QN洗脱结合的DNA。
(16)于洗脱液中加入24.5ml异丙醇，混合，于4℃以16,000转/分离心30min，小心倾去上清。
(17)加入7ml无内毒素的70％乙醇，于4℃以16,000转/分离心10min，小心倾去上清。
(18)敞开管口，室温放置10～20min，用无内毒素的缓冲液TE重新溶解，此步骤中，(4)-(18)操作可采用QIAgen公司的无内毒素质粒制备试剂盒；1.3PCR生产含第三重组质粒PCPG123/T的的CpG DNA片段产物本实施例以第三重组质粒PCPG123/T为模板，PCR反应体系PCR反应总体积为100μl，组成成分如下10×PCR buffer 10μl上游引物P1 2.5μl下游引物P2 2.5μl模板 8μl，10mM dNTP2μl，10mM MgCl26μl5unit/μl Taq酶 0.5μl，用无菌重蒸水补足体积至100μl；循环参数如下94℃变性7min；94℃，45s；52℃，45s；72℃，1min共循环30次；72℃延伸7min1.4PCR产物的纯化(13)PCR结束后，从PCR反应管中将反应液至干净的1.5ml Eppendorf离心管中，加入4倍体积的Solution BS混匀。无论样品量多少，最少需要使用400ul Solution BS。
(14)将3S柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，不要盖上离心管盖，室温放置2分钟；盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上离心管盖子)，用台式离心机高速离心(10000rpm)1分钟。
(15)倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入600ul WashSolution，高速离心(10000rpm)1分钟。
(16)重复步骤3一次。
(17)倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，高速离心(10000rpm)2分钟。
(18)将3S柱放入一根新的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加30ul TE或水，不要盖上离心管盖，室温或37℃放置2分钟。
盖上离心管盖，10000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
1.5DAN定量分析用适量体积的TE缓冲液稀释DNA溶液，用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值，计算DAN含量。
lOD260＝50μg/ml的双链DNA1.6CpG DNA增强口蹄疫疫苗的免疫效果1.猪口蹄疫疫苗的免疫猪口蹄疫O型灭活购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂，按产品说明书进行免疫。将20头，体重为15公斤左右的断奶仔猪，随机分成对照组和试验组，分别用口蹄疫疫苗和口蹄疫疫苗+PCPG片段(200μg/每头)于耳根后肌肉免疫。
2.口蹄疫血清中抗体效价检测免疫后第三周采血，分离血清，采用正向间接血凝试验检测抗体效价。口蹄疫正向间接血凝抗原、阳性血清、阴性血清，均购自兰州兽医研究所。按操作方法按说明书操作。在血凝板上将待检血清用稀释液依次稀释为1∶0、1∶2、1∶4、......、1∶512，设1∶16稀释的阴性血清、1∶512稀释的阳性血清、稀释液对照，每孔各加25μl口蹄疫正向间接血凝抗原，充分振荡混匀。室温静置2小时后判定结果。以50％红细胞出现凝集的最大稀释倍数为该血清的效价。
3.结果对照组10份血请中仅有2份抗体效价达到1∶128，其余8份血清的抗体均小于1∶128，试验组10份血请中有8份抗体效价达到1∶128，其余2份血清的抗体达到1∶64。
权利要求
1.一种能促进畜禽疫苗效价的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，其特征在于第一步基因工程重组质粒的制备根据由序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGG---3’、5’----GGTGCGTCGATGCAGGGGGG---3’及5’---TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT---3’串联而成的D19D282006目的片段DNA的序列，合成其寡核苷酸正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线性载体末端相匹配的碱基序列，然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，形成含CpG基序的目的片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组质粒；第二步根据目的片段两端的重组质粒DNA序列，设计特异引物；第三步以重组质粒为模板，加入特异引物，并进行三温循环的PCR扩增，具体参数为92℃～98℃预变性5～10分钟；92℃～98℃，45～60秒，50～58℃，45～60秒，72℃，45～60秒，进行30～35个循环；最后在72℃延伸10分钟。
2.根据权利要求1所述的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，其特征在于重组质粒包括第一重组质粒，该第一重组质粒含第一DNA片段，采用人工合成的方法合成第一DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----GGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGA----3’，人工合成第一DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGC ACCA----3’，退火后形成第一DNA片段，第一DNA片段的3’端有突出的腺嘌呤(A)，以便与T载体中5’端突出的胸腺嘌呤(T)互补，连接后形成第一重组质粒PCPG1/T。
3.根据权利要求2所述的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，其特征在于重组质粒包括第二重组质粒，该第二重组质粒含第二DNA片段，采用人工合成的方法合成第二DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----CGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGC----3’人工合成第二DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3退火后形成第二DNA片段，第二DNA片段的的两端为粘性末端，与经SphI、NcoI双酶切的第一重组质粒的两端相匹配，连接后形成第二重组质粒PCPG12/T。
4.根据权利要求3所述的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，其特征在于重组质粒包括第三重组质粒，该第三重组质粒含第三DNA片段，采用人工合成的方法合成第三DNA片段的正链，该正链的碱基序列为5’----CTAGTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGTGCGTCGATGCAGGGGGGCTGCA----3’人工合成第三DNA片段的负链，该负链的碱基序列为5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’退火后形成第三DNA片段，第三DNA片段的的两端为粘性末端，与经SpeI、pstI双酶切的第二重组质粒的两端相匹配，连接后形成第三重组质粒PCPG123/T。
5.根据权利要求1所述的含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，其特征在于在PCR扩增前，先于通气良好的试管中加入含氨苄青霉素的LB培养基，然后接入含重组质粒的大肠杆菌，于37℃剧烈振摇下培养12～16h，然后将上述培养菌加入到2000ml含氨苄青霉素的LB中，于37℃剧烈振摇下培养12～16h，最后于4℃以6000转/分离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全部流尽，用碱裂解法制备重组质粒PCPG12/T和PCPG123/T。
全文摘要
含CpG DNA畜禽疫苗佐剂的PCR制备方法，据由序列为5’－GGTGCATCGATGCAGGGGGG－3’、5’－GGTGCGTCGATGCAGGGGGG－3’及5’－TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT－3’串联而成的D19D282006 DNA片段的序列，合成其正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加能与载体末端匹配的碱基，将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中3分钟以上，冷却至室温，形成含CpG基序的目的片段，将DNA片段插入载体相应的酶切位点，并将其转化感受态大肠杆菌得到重组质粒；据目的片段两端的重组质粒DNA序列，设计特异引物；以重组质粒为模板，加入特异引物，进行三温循环PCR扩增，具体参数为92℃～98℃预变性5～10分钟；92℃～98℃，45～60秒，50～58℃，45～60秒，72℃，45～60秒，进行30～35个循环；最后在72℃延伸10分钟。
文档编号C12P19/00GK1554770SQ20031010622
公开日2004年12月15日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年11月7日
发明者朱鸿飞, 李光富 申请人:深圳市未来海洋科技发展有限公司