专利名称：碳同化的调节的制作方法
背景技术：
OAA是产生细胞代谢物的很重要的物质，这些代谢物的例子有氨基酸，特别是谷氨酸家族(即谷氨酸、精氨酸和脯氨酸)和天冬氨酸家族(即天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸)。通过催化导致形成OAA的反应，PEP羧化酶在经代谢过程提供有机酸中起重要作用。例如，PEP羧化酶超量表达显著增加大肠杆菌(Escherichiacoli)从葡萄糖发酵产生琥珀酸。见Millard，C.等，Appl.Environ.Microbiol.621808-1810(1996)。因此，PEP羧化酶也在产生由谷氨酸和天冬氨酸形成的氨基酸中起重要作用。
氨基酸是细胞中普遍存在作为蛋白质成分的化合物。但是为了能量代谢和物质代谢的经济，其产生被严格控制。该控制主要是反馈控制，其中代谢途径的终产物抑制催化该途径早先步骤的酶的活性。PEP羧化酶也在其活性表达中接受各种调节。
例如，就短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)微生物的PEP羧化酶而言，PEP羧化酶活性被天冬氨酸抑制。见例如Mori，M.等，J.Biochem.981621-1630(1985)；O’Regan，M.等，基因(Gene)77237-251(1989)。因此，PEP羧化酶参与的上述氨基酸生物合成也被天冬氨酸抑制。但是，已描述了对天冬氨酸敏感性降低的棒杆菌属微生物PEP羧化酶活性。见Eikmanns，B.J.等，Mol.Gen.Genet.218330-339(1989)。
除了被天冬氨酸变构抑制外，乙酰辅酶A(乙酰-CoA)是例如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和大肠杆菌的PEP羧化酶的变构激活物。见Mori，M.等，J.Biochem.981621-1630(1985)；Morikawa，M.等，J.Biochem.811473-1485(1977)。不被天冬氨酸或乙酰辅酶A调节的其它生物的PEP羧化酶也有报道。见Valle，F.等，J.Indus.Microbiol.17458-462(1996)；O’Regan，M.等，基因77237-251(1989)；Vance，C.等，Plant Physiol.75261-264(1984)。
因为回补酶PEP羧化酶对于最佳OAA库维持是关键的，并由此决定了来自OAA的氨基酸的生物合成水平，所以改进氨基酸发酵生产的一个方法是操作相应的ppc基因。例如，乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ppc基因的扩增显示改善脯氨酸和苏氨酸的生产。见Sano，K.等，Agric.Biol.Chem.51597-599(1987)。
已开发了使用对反馈抑制不敏感的突变株进行氨基酸发酵有效生产的各种技术。但是，还没有利用来自植物的PEP羧化酶发酵生产天冬氨酸或谷氨酸家族氨基酸或利用整合至微生物染色体DNA中的棒杆菌ppc基因发酵生产相同家族氨基酸、且其中的PEP羧化酶基本不受乙酰辅酶A或天冬氨酸调节的报道。
美国专利4,757,009(Sano等；Ajinomoto公司)公开了一种通过发酵生产氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养携带含如下质粒、并具有编码氨基酸的染色体基因的棒杆菌属或短杆菌属菌株，所述质粒中操作性地插入了编码PEP羧化酶的基因，其中该基因是从携带PEP羧化酶基因的棒杆菌属或短杆菌属菌株分离的染色体基因；并从培养基中分离该氨基酸。从中分离PEP羧化酶编码基因的棒杆菌属或短杆菌属菌株是显示减弱的天冬氨酸反馈抑制的菌株。
欧洲专利358,940(Bachmann等；Degussa Aktiengesellschaft)公开了导入到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DM58-1中的pDM6质粒，该菌株保藏在德意志微生物保藏中心(DSM)，保藏号为DSM 4697，其中该质粒含有包含编码PEP羧化酶活性蛋白质生产的信息的遗传序列。此ppc基因是从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组库中分离的，且此PEP羧化酶不被乙酰辅酶A刺激。还公开了发酵生产L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的方法，其包括在适当培养基中培养含质粒pDM6的棒杆菌属或短杆菌属宿主菌，并从该培养基中回收L-氨基酸。
美国专利5,876,983(Sugimoto等；Ajinomoto公司)公开了一种生产氨基酸的方法，包括通过在选自3-溴丙酮酸、天冬氨酸-β-酰肼(aspartic acid-β-hydrazide)和DL-苏型-β-羟基天冬氨酸的野生型PEP羧化酶抑制剂存在时生长埃希氏菌属微生物，选择含有对天冬氨酸反馈抑制不敏感的突变PEP羧化酶编码DNA序列的埃希氏菌属微生物；在适当培养基中培养用该编码突变PEP羧化酶的DNA序列转化的埃希氏菌属或棒杆菌微生物；并从培养基中分离选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的氨基酸。
尽管有许多通过重组DNA技术培养产氨基酸细菌的例子，但不一定实现高水平的氨基酸生产能力。因此，仍还需要高滴度和高产率地发酵生产氨基酸的方法。基本上不受乙酰辅酶A或天冬氨酸调节的PEP羧化酶可能会改善从三碳中间物PEP向四碳中间物OAA的碳流动。此改善的流动可能会有助于形成来自OAA的化合物和增加氨基酸的生物合成。
发明概要因此，本发明涉及含有编码具PEP羧化酶活性的多肽的基因的DNA片段，其中该基因能在宿主微生物中表达，而且该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
本发明还涉及重组DNA分子，该分子包含质粒和其中操作性地插入的编码具有PEP羧化酶活性的多肽的基因，其中在包含埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属的宿主微生物中该重组DNA分子能增殖，该基因能被表达，而且其中该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
本发明还涉及用含有编码PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段转化的埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属宿主微生物，其中该基因来自单子叶植物纲(Monocotyledonae)或双子叶植物纲(Dicotyledonae)的植物或棒杆菌属或短杆菌属的微生物，该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感，而且用该DNA片段转化的宿主微生物表达该基因。
在本发明另一方面，提供发酵生产氨基酸的方法。该方法包括在适当培养基中培养属于埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物，并从培养基中分离氨基酸，其中该宿主微生物被含编码PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段转化，该微生物表达该基因，而且该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
此外，本发明涉及选择含有编码PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段的方法，其中该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。本发明还涉及增加PEP转化为OAA的转化率的方法，在发酵工艺中再循环碳的方法，不需要生物素而在发酵工艺中同化碳的方法，在发酵工艺中增加有机酸生产的方法，以及在发酵工艺中增加氨基酸生产的方法。
附图简述
图1是基因置换的策略图。
优选实施方案详述在详细说明本发明之前，将先定义说明书中使用的几个术语。
此处所用“激活物”包括所述多肽首先变为活性形式所必需的物质，以及仅仅增强活性的物质。
此处所用“氨基酸”是指天然存在的L型氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)。
“嵌合基因”是指含有异源调节和编码序列的基因。它是通过重组DNA技术产生的杂合基因。
“DNA片段”是指脱氧核糖核酸分子的片段。
此处所用“表达”用来指基因编码的蛋白产物的产生。
“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括编码区之前(5’非编码)和之后(3’非编码)调节序列。它是包含负责控制表达(即转录和翻译)的调节DNA序列及转录和翻译产生独特多肽的编码序列的不连续染色体区。
“宿主微生物”是指转化了导入的遗传物质的微生物。
“抑制”包括所述多肽的活性降低和活性完全缺乏。
此处所用“分离的”是指该材料从其原始环境(若天然存在的话，例如天然环境)中取出。
此处所用“多肽”或“蛋白质”是指由通过酰胺键(也称肽键)线性连接起来的单体(氨基酸)组成的分子。它是指氨基酸的分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义中包括肽、寡肽和蛋白质。该术语还用来指多肽的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生多肽不一定从指定的核酸序列翻译而来。它还可以以任何方式产生，包括化学合成或重组表达系统的表达。
“调节序列”是指位于编码序列上游(5’)、中间、和/或下游(3’)，并控制该编码序列的转录和/或表达的核苷酸序列，潜在地与细胞的蛋白质生物合成装置相关联。
“合成DNA”是指全部或部分通过化学合成方法产生的核酸分子。
“转化”在此是指外源基因转移至宿主细胞中作为宿主细胞基因组DNA的一部分或者作为独立分子，以及该基因遗传上稳定的遗传。
一方面，本发明提供含有编码具有PEP羧化酶活性的多肽的基因的DNA片段，其中该基因能在宿主微生物中表达，而且该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
编码PEP羧化酶的ppc基因可以是任何基因，只要它是编码单子叶植物纲或双子叶植物纲植物或者棒杆菌属或短杆菌属微生物的PEP羧化酶的基因，而且表达的多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。ppc基因优选确定了其碱基序列并被克隆。当它未被克隆时，可使用PCR方法等扩增和分离含该基因的DNA片段，然后用适当载体实现克隆化。ppc基因的优选供体是显示减弱的天冬氨酸反馈抑制的菌株。以对天冬氨酸拮抗抑制剂的抗性识别这类菌株。
PEP羧化酶是C4植物光合作用的一个关键酶。它特异定位在叶肉细胞的胞质溶胶中，被磷酸化/去磷酸化过程调节。见Giglioli-Guivarc’h，N.等，Cytometry 23241-249(1996)。此外，在豆类根瘤共生固氮过程中PEP羧化酶在二氧化碳同化中起关键作用。见Pathirana，S.等，Plant J.12293-304(1997)。
在一个实施方案中，含有编码具PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物。在优选实施方案中，该DNA片段来自苜蓿植物。最优选地，该DNA片段来自紫苜蓿(Medicagosativa)株系。
已显示，紫苜蓿株系的PEP羧化酶活性基本不被L-天冬氨酸抑制。见Vance，C.P.等，Phant Physiol.75261-264(1984)。而且，紫苜蓿的天然ppc核苷酸序列是已知的(Pathirana，S.等，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)20437-450(1992))，提供在SEQ ID NO1中，由此编码的天然PEP羧化酶的氨基酸序列提供在SEQID NO2中。因为这些序列是已知的，所以可以基于这些核苷酸序列设计并合成引物，然后以信使RNA为模板通过PCR获得该基因。
植物PEP羧化酶的翻译后调节通过例如该蛋白质的磷酸化来实现。见Jiao，J.A.等，Arch.Biochem.Biophys.269526-535(1989)；Duff，S.M.等，Eur.J.Biochem.22892-95(1995)。苜蓿PEP羧化酶含有若干保守序列，其中一个被认为参与磷酸化(MASIDAQLR，第8-16位残基)。见Pathirana，S.M.等，植物分子生物学20437-450(1992)。
在另一个优选实施方案中，通过一或多个核苷酸替代、缺失和/或插入修饰含编码单子叶植物纲或双子叶植物纲植物来源PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段。最优选地，该修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
在另一个实施方案中，含有编码具PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段来自短杆菌属或棒杆菌属的微生物。在优选实施方案中，该DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株。谷氨酸棒杆菌的天然ppc核苷酸序列显示在SEQ ID NO3中。
应理解，本发明活性PEP羧化酶分子中的氨基酸数可以变化，而且本发明设想包括苜蓿植物或棒杆菌属菌株来源的具有PEP羧化酶活性和不受调节的期望特征的所有氨基酸序列。也包括仅因保守替代而彼此不同的多肽序列。这些保守替代包括该序列中给定位置的一个氨基酸替代为相同类型的另一氨基酸。还包括位于该序列位置上不改变该多肽达到破坏该多肽生物学活性之程度的一个或多个非保守氨基酸替代、缺失和/或插入。
还考虑产生基本上不影响所得PEP羧化酶蛋白质分子功能特性的沉默改变的序列修饰，如序列中的缺失、插入、和/或替代。例如，设想了该基因序列中反映遗传密码简并性、或在给定位置导致产生化学上等同的氨基酸的改变。
因此可以理解，本发明不只是包括所述具体的示例性序列。和确定编码产物生物学活性的保持一样，所有提出的修饰均在本领域常规技术的范围内。
在另一个实施方案中，含有编码具PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段是嵌合基因，其包含短杆菌属或棒杆菌属微生物来源的不完整PEP羧化酶核苷酸序列和单子叶植物纲或双子叶植物纲植物来源的不完整PEP羧化酶核苷酸序列。这两个不完整序列一起形成能表达具有PEP羧化酶活性的多肽的完整嵌合ppc基因，其中该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
在一个优选实施方案中，一个不完整PEP羧化酶核苷酸序列来自属于棒杆菌属的微生物，而另一个不完整PEP羧化酶核苷酸序列来自苜蓿植物。最优选地，一个不完整PEP羧化酶核苷酸序列来自谷氨酸棒杆菌菌株，而另一个不完整PEP羧化酶核苷酸序列来自紫苜蓿株系。
在另一个实施方案中，所述DNA片段是互补DNA(cDNA)、基因组DNA或合成DNA。本发明编码PEP羧化酶的DNA片段可容易地以各种方式获得，这些方式包括但不限于化学合成、cDNA或基因组文库筛选、表达文库筛选、和/或cDNA的PCR扩增。用于分离这种DNA的这些方法和其它方法阐述于例如Sambrook等(分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(1989))、Ausubel等编(分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Current Protocols Press(1994))、Berger和Kimmel(酶学方法分子克隆技术指南(Methods in EnzymologyGuide to MolecularCloning Techniques)，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego(1987))。
ppc基因的分离可通过例如以下方法进行。尽管为简单起见以下实例是针对棒杆菌属的，但可以理解，同样可以使用短杆菌属的细菌。首先，从携带ppc基因的棒杆菌属菌株提取染色体基因(采用例如H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta 72619(1963)的方法)。用适当限制性酶切割该基因，然后亚克隆至能在棒杆菌或大肠杆菌中增殖的质粒穿梭载体中。为了切割染色体基因，可以通过控制切割程度，例如控制切割反应的时间、温度等，使用各种各样的限制性酶。用限制性酶切割DNA是本领域普通技术人员熟知的，不需要在此详加阐述。
用所得重组DNA转化棒杆菌或大肠杆菌的PEP羧化酶缺陷型突变体。由此获得的转化体可基于载体DNA和/或受体所拥有的特征通过常规方法选择和分离。例如，分离导致具有PEP羧化酶活性的细菌菌株，并从中分离ppc基因。
当培养用本发明DNA片段转化的上述微生物时，该DNA序列被表达，然后可以获得不需要乙酰辅酶A来活化、并基本上对天冬氨酸的抑制不敏感的酶。通过例如在有和/或无乙酰辅酶A存在时测定PEP羧化酶活性，可知晓该酶是否需要乙酰辅酶A作为激活物。通过例如在酶反应系统中有和/或无天冬氨酸存在时测定PEP羧化酶活性，可知晓由此获得的该酶是否基本上被天冬氨酸抑制。
可采用光谱测定法(Yoshinage，T.等，J.Biochem.68747-750(1970))等测定该酶的活性。例如，在反应进行时以连续或动力学方式进行酶分析，则可按照吸光度的降低(通常在340纳米处)以分光光度法测定该反应。
在本发明的另一方面，提供选择含有编码具PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段的方法，其中该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。该方法包括从携带ppc基因的棒杆菌属菌株提取染色体基因，用适当限制性酶切割该染色体基因，将此ppc基因与能在棒杆菌属细菌中增殖的质粒载体连接，转化其中ppc和pyc基因无功能的棒杆菌属菌株，分离在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上显示优良生长的菌株，并从该菌株中分离DNA片段。
丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)是重要回补酶，该酶从丙酮酸补充生长过程中生物合成消耗的OAA，该酶用在工业发酵的赖氨酸和谷氨酸生产中。除了PEP羧化酶外，最近发现pyc基因编码的生物素依赖性丙酮酸羧化酶在谷氨酸棒杆菌中是回补酶。谷氨酸棒杆菌中ppc和pyc基因两者失活导致该微生物不能依赖葡萄糖生长。见Peters-Wendisch，P.，等，Microbiology 144915-27(1998)。通过失活ppc和pyc两个基因，可按菌株在以葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基上生长的能力鉴定克隆至复制型质粒中的含有本发明ppc基因的DNA片段。
在另一个实施方案中，还在培养基中加入PEP羧化酶活性的抑制剂。例如，可以加入天冬氨酸类似物。类似化合物优选显示对产生野生型PEP羧化酶的棒杆菌属微生物有生长抑制作用，上述生长抑制作用可通过L-谷氨酸或L-天冬氨酸的存在来恢复，而且类似化合物抑制野生型PEP羧化酶活性。如果从棒杆菌属的微生物选择抗该类似化合物的菌株，则很有可能获得产生对天冬氨酸的反馈抑制不敏感的PEP羧化酶的宿主微生物。
在另一个实施方案中，分离显示来自OAA的氨基酸生产增加的菌株。这些氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。此外，可在没有乙酰辅酶A的基本培养基上培养菌株，并可测量PEP羧化酶活性。
在本发明的另一方面，提供如下重组DNA分子，其包含质粒和其中操作性地插入的编码具有PEP羧化酶活性的多肽的基因，其中在包含埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属的宿主微生物中该重组DNA分子能增殖，该基因能被表达，而且其中该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
本发明所用质粒载体可以是任何载体，只要它能在埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的细菌细胞中增殖即可。该载体DNA用切割染色体基因所使的相同限制性酶切割，或与具有染色体DNA切割片段和被切割载体DNA相应末端的互补碱基序列的寡核苷酸相连。然后将质粒载体和含染色体基因的片段进行连接。若基因通过这种方法或任何其它方法按有义方向和正确读框插入，使得在该质粒被其插入的细胞的遗传机器转录和翻译时表达PEP羧化酶，则称该基因“操作性地插入”到该质粒载体中。
在一个优选实施方案中，编码具有PEP羧化酶活性的多肽的基因来自苜蓿植物。最优选地，该DNA片段来自紫苜蓿株系。在另一个优选实施方案中，该基因通过一或多个核苷酸替代、缺失和/或插入被修饰。最优选地，该修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
在本发明的另一个方面，提供用含编码PEP羧化酶活性多肽的基因的本发明DNA片段转化的宿主微生物。作为宿主，可以使用用于生产L-氨基酸的微生物，例如那些属于短杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属、沙雷氏菌属(Seratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和节杆菌属(Arthrobacter)的微生物。
在一个优选实施方案中，所述含ppc基因的DNA片段在埃希氏菌属、短杆菌属或棒杆菌属的宿主微生物中表达。作为宿主，实例可以是属于埃希氏菌属的微生物，例如大肠杆菌，优选产L-赖氨酸的大肠杆菌，棒杆菌，优选产L-赖氨酸的菌株，等等。本发明所称的棒杆菌是一组需氧、革兰氏阳性、不耐酸、杆状、不能形成孢子的微生物，包括属于棒杆菌属的细菌，属于短杆菌属的迄今为止被归类为短杆菌属、但目前被统一成棒杆菌属细菌的细菌，以及属于短杆菌属、但与属于棒杆菌属的细菌关系密切的细菌。
在一个实施方案中，当所述DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物时，可用含有质粒和其中操作性地插入的DNA片段的重组DNA分子转化该宿主微生物。或者，可以通过将本发明的DNA片段整合至宿主染色体DNA中来转化该宿主微生物。
优选地，所述DNA片段来自苜蓿植物。最优选地，该DNA片段来自紫苜蓿株系。在另一个优选实施方案中，该植物来源的DNA片段通过一个或多个核苷酸替代、缺失和/或插入而被修饰。最优选地，该修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
而且，正如以上所述的，可以接受的是，将本发明的DNA序列插入能自我复制的载体DNA中，并导入宿主中。作为载体DNA，优选质粒载体，最优选能在宿主细胞中自我复制的那些。或者，也可以使用噬菌体DNA载体。
当含有基因的DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物、或短杆菌属或棒杆菌属的微生物时，也可以接受通过采用例如转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.1417(1983))、Mu噬菌体(日本专利公开文本2-109985)或同源重组(“分子遗传学实验”(Experiments in Molecular Genetics)，Cold Spring HarborLab.(1972))的方法将该DNA片段整合至宿主微生物的染色体DNA中。此外，为了将本发明的DNA整合至棒杆菌中，可以利用日本专利公开文本5-7491中公开的温度敏感性质粒。
在一个优选实施方案中，所述DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株，并被整合到宿主微生物的染色体DNA中。谷氨酸棒杆菌染色体中ppc基因的侧翼区域已被测序(SEQ ID NO3)。根据本发明的基因置换策略，除去染色体拷贝的ppc基因，并替换为抗生素抗性基因标记(图1)。该标记反过来又用本发明的修饰ppc基因置换。
此基因置换策略的独特设计有利于完全除去宿主微生物的染色体ppc DNA序列和替换新ppc基因，而不改变两个相邻基因，tpi基因和secG基因，的表达。tpi基因编码糖酵解酶丙糖磷酸异构酶，而secG基因编码secG，一个参与蛋白质外运的整合膜蛋白。
此基因置换策略的设计依赖于重建ppc基因侧翼的完整tpi和secG基因。可使用四个寡核苷酸克隆ppc侧翼的DNA区域(1)5′GTTGG TGAGC CACTG GAAAT CCGTG 3′(SEQ IDNO 4)(2)5′GATGT CATCG CGTAA AAAAT CAGTC 3′(SEQ IDNO 5)(3)5′CACTG CGCTG CGCAA CTCTA GATAG 3′(SEQ IDNO 6)(4)5′GACCA CCACC TTGCC GAAAT CTTGG 3′(SEQ IDNO 7)。
在本发明的另一方面，提供发酵生产氨基酸的方法。该方法包括在适当培养基中培养属于埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物，并从培养基中分离氨基酸，其中该宿主微生物被含编码PEP羧化酶活性多肽的基因的DNA片段转化，该宿主微生物表达该基因，而且该多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
培养上述宿主的方法与现有技术中产氨基酸微生物的培养方法没有特别不同。也就是说，使用含碳源、氮源、无机离子、补偿营养缺陷的物质、和可选的有机微量营养物质如氨基酸、维生素等的普通培养基。
对于碳源，可以使用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖等，以及有机酸如乙酸。对于氮源，可以使用氨气、含水铵(aqueous ammonium)、铵盐等。对于无机离子，可按需要向培养基中适当地加入钾离子、钠离子、镁离子、磷酸盐离子等。
适当地控制培养基的pH和温度，在有氧条件下进行培养，直到氨基酸的产生和积累基本停止。为了收集由此在培养基中积累的氨基酸，可采用常规方法。例如，在通过过滤、超滤、离心或其它已知方法除去细胞后，通过例如浓缩此无细胞溶液和结晶氨基酸(或其盐)回收氨基酸。或者，此化合物可通过离子交换层析来回收。
在一个优选实施方案中，氨基酸是来自OAA的氨基酸，如L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。最优选氨基酸是L-赖氨酸。
在另一方面，本发明提供增加PEP转化为OAA的转化率的方法。该方法包括用本发明的DNA片段转化宿主微生物。在一个优选实施方案中，此宿主微生物从埃希氏菌属、短杆菌属或棒杆菌属中选取。
PEP羧化酶催化PEP和二氧化碳之间的缩合反应，导致形成OAA。因此，基本上不受乙酰辅酶A或天冬氨酸调节的本发明PEP羧化酶增加PEP转化为OAA的转化率。
当所述DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物时，可通过整合或利用例如重组DNA分子来转化。当所述DNA片段来自短杆菌属或棒杆菌属的微生物时，通过将本发明的DNA片段整合到宿主微生物染色体DNA中来转化宿主微生物。
在另一方面，本发明提供在发酵工艺中再循环碳的方法。该方法包括用本发明的DNA片段转化宿主微生物。在一个优选实施方案中，此宿主微生物从埃希氏菌属、短杆菌属或棒杆菌属中选取。
TCA循环需要不断补充C4分子以替代氨基酸合成所消耗的此中间物。PEP羧化酶通过在向TCA循环供给四碳OAA中起回补作用而有助于完成此功能。通过用编码具PEP羧化酶活性的多肽的本发明DNA片段转化宿主微生物，提供了再循环碳的方法。
当所述DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物时，可通过整合或利用例如重组DNA分子来转化。当所述DNA片段来自短杆菌属或棒杆菌属的微生物时，通过将本发明的DNA片段整合到宿主微生物染色体DNA中来转化宿主微生物。
迄今为止，L-赖氨酸和L-谷氨酸使用短杆菌属或棒杆菌属中能产生这些氨基酸的棒杆菌通过发酵方法进行工业生产。在这些方法中，已知该棒杆菌的生长需要生物素。本PEP羧化酶的生物学活性不需要生物素。此外，PEP羧化酶一个主要生理作用是通过同化碳回补TCA循环。本发明的不受调节的PEP羧化酶改良了二氧化碳的同化。
因此，在另一方面，本发明提供不需要生物素而在发酵工艺中同化碳的方法。该方法包括用本发明的DNA片段转化宿主微生物。在一个优选实施方案中，此宿主微生物从埃希氏菌属、短杆菌属或棒杆菌属中选取。
当所述DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物时，可通过整合或利用例如重组DNA分子来转化。当所述DNA片段来自短杆菌属或棒杆菌属的微生物时，通过将本发明的DNA片段整合到宿主微生物染色体DNA中来转化宿主微生物。
回补酶PEP羧化酶是维持最佳OAA库所关键的，因此决定了由OAA而来的有机酸的生物合成水平。通过用本发明的DNA片段转化宿主微生物，可增加OAA的生产率。同样，也增加来自OAA的有机酸的生产。
因此，在另一方面，本发明提供在发酵工艺中增加有机酸生产的方法。在一个优选实施方案中，此宿主微生物从埃希氏菌属、短杆菌属或棒杆菌属中选取。
当所述DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物时，可通过整合或利用例如重组DNA分子来转化。当所述DNA片段来自短杆菌属或棒杆菌属的微生物时，通过将本发明的DNA片段整合到宿主微生物染色体DNA中来转化宿主微生物。
OAA是生产细胞代谢物如氨基酸的重要物质。通过增加PEP转化为OAA的转化率，本发明的ppc基因可由此增加氨基酸的生产。因此，在另一方面，本发明提供在发酵工艺中增加氨基酸生产的方法。该方法包括用本发明的DNA片段转化宿主微生物。
在一个优选实施方案中，此宿主微生物从埃希氏菌属、短杆菌属或棒杆菌属中选取。在另一个优选实施方案中，此氨基酸包含L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。最优选此氨基酸是L-赖氨酸。
当所述DNA片段来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物时，可通过整合或利用例如重组DNA分子来转化。当所述DNA片段来自短杆菌属或棒杆菌属的微生物时，通过将本发明的DNA片段整合到宿主微生物染色体DNA中来转化宿主微生物。
本公开中引用的所有专利和出版物都是表示本发明所在领域普通技术人员的技术水平，并全部完整地引入本文作为参考。
以上一般性地描述了本发明后，参考下列实施例将更容易理解本发明。这些实施例以举例说明的方式提供，而不旨在限制本发明，除非明确指出。
实施例1植物ppc基因在大肠杆菌中有功能苜蓿(紫苜蓿)ppc基因的cDNA克隆(APPC)在缺乏功能性PEP羧化酶且不能在以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基上生长的大肠杆菌突变株CGSC3594中有功能。当转化了APPC质粒(pMS2)时，大肠杆菌突变株CGSC3594能在以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基上生长。该苜蓿PEP羧化酶的DNA和氨基酸序列分别提供在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中。
实施例2苜蓿ppc基因显示对摇瓶中的棒杆菌属有生长刺激测定了苜蓿(紫苜蓿)来源的ppc基因对产赖氨酸棒杆菌属菌株BF100生长刺激的作用。生长测定为660nm处的光密度，滴度测定为克赖氨酸/升培养基，产率测定为(克赖氨酸/克消耗的葡萄糖)×100。存在30mg/L诱导物异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)。结果显示在表1中表1
实施例3野生型棒杆菌属菌株来源的ppc基因改善产赖氨酸棒杆菌属菌株的生产能力将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的ppc基因的cDNA克隆(CPPC)插入到pCPPC质粒中。当在摇瓶中用该pCPPC质粒转化了产赖氨酸谷氨酸棒杆菌菌株BF100时，改善了生产能力。
生长测定为660nm处的光密度，滴度测定为克赖氨酸/升培养基，产率测定为(克赖氨酸/克消耗的葡萄糖)×100。结果显示在表2中表2
实施例4野生型和产赖氨酸棒杆菌属菌株对乙酰辅酶A和L-天冬氨酸的敏感性在从野生型谷氨酸棒杆菌菌株(ATCC 13032)和产赖氨酸谷氨酸棒杆菌菌株(BF100)的提取物中观察到不同的对乙酰辅酶A和L-天冬氨酸的敏感性，这是通过PEP羧化酶活性确定的。使用粗提物通过分光光度法测定吸光度的改变(340 nm/min)作为活性单位。结果见表3
表3
实施例5用修饰的ppc基因置换染色体ppc基因谷氨酸棒杆菌染色体中ppc基因的侧翼区域已被测序(SEQ ID NO3)。除去ppc基因的染色体拷贝，并替换为抗生素抗性基因标记(图1)。该标记反过来又用本发明的修饰ppc基因替换。此基因置换策略的独特设计有利于完全除去宿主微生物的染色体ppc DNA序列和替换新的基因，而不改变两个相邻基因的表达。
此基因置换策略的设计依赖于重建ppc基因侧翼的完整tpi和secG基因。可使用四个寡核苷酸克隆ppc侧翼的DNA区域(1)5′GTTGG TGAGC CACTG GAAAT CCGTG 3′(SEQ IDNO 4)(2)5′GATGT CATCG CGTAA AAAAT CAGTC 3′(SEQ IDNO 5)(3)5′CACTG CGCTG CGCAA CTCTA GATAG 3′(SEQ IDNO 6)(4)5′GACCA CCACC TIGCC GAAAT CTTGG 3′(SEQ IDNO 7)。
鉴于包括实施例的前述说明，本领域技术人员将能以各种形式和实施方案实施本发明，而不背离所附权利要求书中限定的本发明精神和范围。
序列表<110>Rayapati，P.JohnCrafton，Corey M.
Archer-Daniels-Midland Company<120>碳同化的调节<130>1533.093PC00<140>PCT/US99/14437<141>1999-06-29<160>7<170>patentIn Ver.2.0<210>1<211>2901<212>DNA<213>紫苜蓿<220><221>CDS<222>(1)..(2901)<400>1atg gca aac aag atg gaa aaa atg gca tca att gat gca cag ctt aga48Met Ala Asn Lys Met Glu Lys Met Ala Ser Ile Asp Ala Gln Leu Arg1 5 10 15caa ttg gtt cct gca aaa gtg agt gaa gat gat aaa ctt att gag tat96Gln Leu Val Pro Ala Lys Val Ser Glu Asp Asp Lys Leu Ile Glu Tyr20 25 30gat gct ttg ttg ttg gat cgg ttt ctt gat att ctt caa gat tta cat144Asp Ala Leu Leu Leu Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln Asp Leu His35 40 45gga gag gat ctg aag gat tct gtt caa gaa gtg tat gaa ctg tct gct192Gly Glu Asp Leu Lys Asp Ser Val Gln Glu Val Tyr Glu Leu Ser Ala
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1.DNA片段，其包含编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，其中所述基因能在宿主微生物中表达，而且所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
2.权利要求1的DNA片段，其中所述DNA片段来自属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物。
3.权利要求2的DNA片段，其中所述DNA片段来自苜蓿植物。
4.权利要求3的DNA片段，其中所述DNA片段来自紫苜蓿株。
5.权利要求2的DNA片段，其中所述DNA片段被一个或多个核苷酸替代、缺失或插入所修饰。
6.权利要求5的DNA片段，其中所述修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
7.权利要求1的DNA片段，其中所述DNA片段来自属于短杆菌属或棒杆菌属的微生物。
8.权利要求7的DNA片段，其中所述DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株。
9.权利要求7的DNA片段，其中所述DNA片段被整合至宿主微生物的染色体DNA中。
10.权利要求1的DNA片段，其中所述DNA片段在包含埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属的宿主微生物中表达。
11.权利要求1的DNA片段，其中所述DNA片段是嵌合基因，该嵌合基因包含短杆菌属或棒杆菌属微生物来源的不完整磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶核苷酸序列和单子叶植物纲或双子叶植物纲植物来源的不完整磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶核苷酸序列。
12.权利要求1的DNA片段，其中所述DNA片段是cDNA、基因组DNA或合成DNA。
13.来自单子叶植物纲或双子叶植物纲植物的DNA片段，其包含编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，其中所述基因能在包含埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属的宿主微生物中表达，而且所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
14.权利要求13的DNA片段，其中所述DNA片段来自苜蓿植物。
15.权利要求14的DNA片段，其中所述DNA片段来自紫苜蓿株系。
16.权利要求13的DNA片段，其中所述DNA片段被一个或多个核苷酸替代、缺失或插入所修饰。
17.权利要求16的DNA片段，其中所述修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
18.权利要求13的DNA片段，其中所述DNA片段是cDNA、基因组DNA或合成DNA。
19.来自短杆菌属或棒杆菌属微生物的DNA片段，其包含编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，其中所述基因能在包含埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属的宿主微生物中表达，所述基因被整合到所述宿主微生物的染色体DNA中，而且所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
20.权利要求19的DNA片段，其中所述DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株。
21.权利要求19的DNA片段，其中所述基因通过以下方式被整合除去宿主微生物的染色体ppc基因，并插入所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，而不改变宿主微生物染色体ppc基因侧翼的两个基因的表达。
22.具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的分离的多肽，其中所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感，而且所述多肽由权利要求1、13和19之任一项的DNA片段编码。
23.重组DNA分子，该分子包含质粒和其中操作性地插入的编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，其中在包含埃希氏菌属、棒杆菌属和短杆菌属的宿主微生物中所述重组DNA分子能增殖，所述基因能被表达，所述基因来自单子叶植物或双子叶植物，而且其中所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
24.权利要求23的重组DNA分子，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因来自苜蓿植物。
25.权利要求24的重组DNA分子，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因来自紫苜蓿株系。
26.权利要求23的重组DNA分子，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因被一个或多个核苷酸替代、缺失或插入所修饰。
27.权利要求26的重组DNA分子，其中所述修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
28.具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的分离的多肽，其中所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感，而且所述多肽由权利要求23的DNA分子编码。
29.用DNA片段转化的埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物，所述DNA片段包含编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，其中所述基因来自单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物，所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感，而且用所述DNA片段转化的所述宿主微生物表达所述基因。
30.权利要求29的宿主微生物，其中所述宿主微生物是通过将所述DNA片段整合到所述宿主微生物的染色体DNA中而被转化的，或者是转化了含有质粒和其中操作性地插入的所述DNA片段的重组DNA分子。
31.权利要求29的宿主微生物，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因来自苜蓿植物。
32.权利要求31的宿主微生物，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因来自紫苜蓿株系。
33.权利要求29的宿主微生物，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因被一个或多个核苷酸替代、缺失或插入所修饰。
34.权利要求33的宿主微生物，其中所述修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
35.埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物，其中所述宿主微生物的染色体DNA中整合了包含编码具磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性多肽的基因的DNA片段，所述DNA片段来自棒杆菌属或短杆菌属的微生物，所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感，而且所述宿主微生物表达所述基因。
36.权利要求35的宿主微生物，其中所述DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株。
37.权利要求35的宿主微生物，其中所述基因通过以下方式被整合除去宿主微生物的染色体ppc基因，并插入所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，而不改变宿主微生物染色体ppc基因侧翼的两个基因的表达。
38.通过发酵生产氨基酸的方法，其包括(a)在适当培养基中培养埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物；和(b)从该培养基中分离氨基酸，其中所述宿主微生物(a)中转化了包含编码具磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性多肽的基因的DNA片段，所述宿主微生物(a)表达所述基因，而且所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
39.权利要求38的方法，其中在步骤(b)中所述氨基酸包含L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。
40.权利要求39的方法，其中在步骤(b)中所述氨基酸是L-赖氨酸。
41.权利要求38的方法，其中所述DNA片段来自属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物。
42.权利要求41的方法，其中所述DNA片段来自苜蓿植物。
43.权利要求42的方法，其中所述DNA片段来自紫苜蓿株系。
44.权利要求38的方法，其中所述DNA片段被一个或多个核苷酸替代、缺失或插入所修饰。
45.权利要求44的方法，其中所述修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
46.权利要求38的方法，其中所述DNA片段来自属于短杆菌属或棒杆菌属的微生物。
47.权利要求46的方法，其中所述DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株。
48.权利要求38的方法，其中所述编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因是嵌合基因，该嵌合基因包含短杆菌属或棒杆菌属微生物来源的不完整磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶核苷酸序列和单子叶植物纲或双子叶植物纲植物来源的不完整磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶核苷酸序列。
49.权利要求38的方法，其中所述DNA片段是cDNA、基因组DNA或合成DNA。
50.通过发酵生产氨基酸的方法，其包括(a)在适当培养基中培养埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物；和(b)从该培养基中分离氨基酸，其中所述宿主微生物(a)通过将包含编码具磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性多肽的基因的DNA片段整合到所述宿主微生物(a)的染色体DNA中而被转化，或者转化了含有质粒和其中操作性地插入的所述DNA片段的重组DNA分子，所述宿主微生物(a)表达所述基因，所述DNA片段来自单子叶植物或双子叶植物，而且所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
51.权利要求50的方法，其中在步骤(b)中所述氨基酸包含L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。
52.权利要求51的方法，其中在步骤(b)中所述氨基酸是L-赖氨酸。
53.权利要求50的方法，其中所述DNA片段来自苜蓿植物。
54.权利要求53的方法，其中所述DNA片段来自紫苜蓿株系。
55.权利要求50的方法，其中所述DNA片段被一个或多个核苷酸替代、缺失或插入所修饰。
56.权利要求55的方法，其中所述修饰包含缺失编码以下氨基酸序列的核苷酸Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg。
57.通过发酵生产氨基酸的方法，其包括(a)在适当培养基中培养埃希氏菌属、棒杆菌属或短杆菌属的宿主微生物；和(b)从该培养基中分离氨基酸，其中所述宿主微生物(a)通过将DNA片段整合到所述宿主微生物的染色体DNA中而被转化，所述DNA片段包含编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽的基因，所述宿主微生物(a)表达所述基因，所述DNA片段来自棒杆菌属或短杆菌属的微生物，而且所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
58.权利要求57的方法，其中整合方法是除去宿主微生物的染色体ppc基因，并插入所述DNA片段，而不改变宿主微生物染色体ppc基因侧翼的两个基因的表达。
59.权利要求57的方法，其中在步骤(b)中所述氨基酸包含L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。
60.权利要求59的方法，其中在步骤(b)中所述氨基酸是L-赖氨酸。
61.权利要求57的方法，其中所述DNA片段来自谷氨酸棒杆菌菌株。
62.选择含有编码具磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性多肽的基因的DNA片段的方法，其中所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感，该方法包括(a)从携带ppc基因的棒杆菌属菌株提取染色体基因；(b)用适当限制性酶切割所述染色体基因(a)；(c)将所述ppc基因(a)与能在棒杆菌属中增殖的质粒载体连接；(d)用所述质粒载体(c)转化其中ppc和pyc基因被失活的棒杆菌属菌株；(e)分离在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上显示优良生长的菌株；和(f)并从所述菌株(e)中分离含有编码具磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性多肽的基因的DNA片段，其中所述多肽不需要乙酰辅酶A来活化，并对天冬氨酸的反馈抑制不敏感。
63.权利要求62的方法，其中在步骤(e)中向培养基内加入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的抑制剂。
64.权利要求62的方法，其中在步骤(e)中分离显示来自草酰乙酸的氨基酸生产增加的菌株。
65.权利要求62的方法，其中在步骤(e)中菌株生长在没有乙酰辅酶A的基本培养基上。
66.增加磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的转化率的方法，该方法包括用权利要求1、13和19之任一项的DNA片段转化宿主微生物。
67.在发酵工艺中再循环碳的方法，该方法包括用权利要求1、13和19之任一项的DNA片段转化宿主微生物。
68.在发酵工艺中同化碳而不需要生物素的方法，该方法包括用权利要求1、13和19之任一项的DNA片段转化宿主微生物。
69.在发酵工艺中增加有机酸生产的方法，该方法包括用权利要求1、13和19之任一项的DNA片段转化宿主微生物。
70.在发酵工艺中增加氨基酸生产的方法，该方法包括用权利要求1、13和19之任一项的DNA片段转化宿主微生物。
全文摘要
本发明提供通过改善二氧化碳的同化增加微生物生产能力的方法。具体地,本发明提供具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽,该多肽不需要乙酰辅酶A来激活,且对天冬氨酸的反馈抑制不敏感,本发明还涉及编码该多肽的基因。编码不受乙酰辅酶A或天冬氨酸调节的PEP羧化酶的基因能改善从三碳中间物PEP到四碳中间物OAA的碳流动,有助于产生OAA来源的化合物,和增加氨基酸合成。本发明还提供含这些基因的重组DNA分子,用这些基因转化的细菌,和用此转化细菌生产氨基酸的方法。
文档编号C12N15/60GK1373810SQ99816826
公开日2002年10月9日 申请日期1999年6月29日 优先权日1999年6月29日
发明者P·J·洛伊帕蒂, C·M·克拉夫顿 申请人:阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司