专利名称：利用叶柄外植体进行的土壤杆菌介导的高效棉花转化的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程一般领域，尤其是通过土壤杆菌转化棉花叶柄外植体接着进行体细胞胚胎再生而将外源遗传物质导入棉花。
背景棉花是国际上最有价值并广泛种植的经济作物之一。世界棉花年产量超过一亿包，价值450亿美元。亚洲是最大的棉花产地，世界上五大棉花制造商中有四个位于亚洲。棉花不仅是纺织业的主要支柱，也为生产除草剂、控制病虫害的化学品的生产商提供了巨大的有利市场。有多种从分子水平改良棉花的机会，包括提高产量和纤维质量及创造新的抗除草剂、昆虫、线虫和病变的品种。(Steward，1991)。
棉花的组织培养在1935年，Skovsted首次报道了棉花的胚胎培养。Beasley(1971)报道了棉花中愈伤组织的形成是受精的胚珠在Murashige & Skoog(MS)基质上从珠孔端长出旁枝。从G.klotzschianum(Price & Smith，1979)悬浮培养物中获得体细胞胚胎发生。在1983年，Davidonis & Hamilton首次成功的从培养了两年的愈伤组织获得有效的可重复的棉花(陆地棉)植株的再生。从此棉植株从各种外植体(Zhang & Feng，1992；Zhang，1994)再生，外植体包括子叶(Davidonis等，1987；Davidonis & Hamilton，1983；Finer，1988；Firoozabady等，1987)、下胚轴(Cousins等，1991；Rangan & Zavala，1984；Rangan & Rajasekaran，1996；Trolinder & Goodin，1988；Umbeck等，1987，1989)、茎(Altman等，1990；Bajaj等，1989；Chen等，1987；Finer & Smith，1984)、苗端(Bajaj等，1985；Gould等，1991；Turaev & Shamina，1986)、未成熟胚胎(Bealsey，1971；Stewart & Hsu，1977，1978)、叶柄(Finer & Smith，1984；Gawel等，1986；Gawel &Robacker，1990)、叶(Fener & Smith，1984；Gawel &Robacker，1986)、根(Chen & Xia，1991；Kuo等，1989)、愈伤组织(Finer & McMullen，1990；Trolinder等，1991)和原生质体(Chen等，1989)。
棉花的转化十年前首次报道使用下胚轴和子叶做外植体的土壤杆菌介导的棉花转化(Firoozababy等，1987；Umbeck等，1987)。通过土壤杆菌介导的转化，已将几种有用的基因导入棉花中，包括害虫和除草剂抗性基因(Perlak等，1990；Trolinder等，1991；Chen等，1994)。已经使用外植体(例如下胚轴、子叶、下胚轴和子叶产生的愈伤组织，及未成熟胚胎)进行土壤杆菌介导的转化和粒子轰击(de Framond等，1983；Finer & McMullen，1990；Firoozabady等，1987；Perlak等，1990；Rangan &Rajasekaran，1996；Rajasekaran等，1996；Trolinder等，1991；Umbeck等，1987，1989，1992)。另外，离体胚轴的分生组织也已通过粒子轰击被用于棉花转化(Chlan等，1995；John，1996；John & Keller，1996；McCabe & Martinell，1993)。Zhou等(1983)在自体授粉一天后将DNA注射到中轴胎座中而转化棉花。
然而，转化率通常较低，用下胚轴作外植体时，在20％到30％之间(Firoozabady等，1987；Cousins等，1991；Rajasekaran等，1996)。有报道使用子叶作外植体并用编码章鱼碱合成酶的ocs基因作报道基因时的显著性高转化效率，高达80％(Firoozababy等，1987)。然而，因为在确定的没有被根癌土壤杆菌感染转化的几种植物中已经发现了章鱼碱，所以使用章鱼碱作为转化标记的有效性仍不可靠(Wendt-Gallitelli和Dobrigkeit，1973)。一份最近的报道说明子叶的转化效率大约在20到30％(Cousins等，1991)。当使用粒子轰击法时，该转化效率甚至更低(Keller等，1997)。用于转化的外植体类型的差异可能对转化和再生的效率有显著性影响。已有报道，例如，为了减少假阳性转化体，子叶是一种优于下胚轴的外植体(Firoozabady等，1987)。
棉花转化也高度依赖于基因型(Trolinder，1985a，1986；Trolinder & Goodin，1987，1988a，1988b；Trolinder &Chen，1989)。除了少数可再生的并可转化的品种，如陆地棉cv.Coker 312和陆地棉Jin7，大部分其它重要的优良商用品种，如陆地棉cv.D&P 5415和陆地棉cv.Zhongmian 12，用这些方法不能转化和再生。缺少高效植物再生方法已被视为应用土壤杆菌介导的棉花转化的主要障碍(Gawel等，1986；Firoozabady等，1987)。
发明的详细描述本发明公开了一种有效的用叶柄作为外植体的基因转化棉植株，包括优良品系的方法。通过使用叶柄作为外植体，和一系列改良培养基，与以前报道的方法相比，转化效率显著增强并且缩短了从转化到再生所需的时间。
通过使用本发明的方法，从土壤杆菌转化到转基因小植株再生的整个过程需要6-7个月。所报道的下胚轴和子叶方法通常需要7-9个月或更长的时间完成相同的过程(Cousins等，1991；Chen等，未报道的观察结果)。将小植株培养到合适移植入土壤中的大小还需要两个月。
将外源基因导入土壤杆菌使得外源基因稳定地转移到暴露于土壤杆菌的植物或植物组织中的技术是本领域公知的，其不属于本发明的一部分。优选使用所谓“缓和(disarmed)”土壤杆菌菌株或Ti质粒，即，已除去或灭活由野生型土壤杆菌导致的冠瘿病的肿瘤性质的基因的菌株或质粒。在文献中可见大量缓和土壤杆菌菌株的实例(例如，pAL4404，pEHA101和pEH105(Walkerpeach &Veltern，1994))。更优选使用所谓二元载体系统，例如在Schilperoort等1990，1995中所描述的。二元载体系统允许在大肠杆菌中操作携带要导入植株中的外源基因的质粒，这使得载体构建的方法更易于进行。
类似地，使用本领域公知的技术构建载体，包括构建含有要导入植株的外源基因的嵌合基因，这不属于本发明的一部分。嵌合基因应包括在要表达的宿主中有活性的启动子。例如，为了转化细胞的选择，在转化过程的不同阶段具有一系列选择标记是优选的。与在大肠杆菌中具有活性的启动子相连的选择标记(例如提供对抗生素如卡那霉素、头孢噻肟或链霉素抗性的基因)可以用于选择含该标记的细菌(即，转化体)。另一种与植物活性启动子如CaMV 35S启动子或T-DNA启动子如NPT II NOS启动子相连的选择标记可以用于选择转化植物细胞。要导入植物细胞的目的外源基因应含有与编码序列功能相关的植物活性启动子，这样启动子在转化细胞中驱动基因表达。同样，植物活性启动子，如CaMV 35S，NPT II NOS启动子或任何组织特异性的启动子均为本领域公知的而且选择适当的启动子正是本领域的常规技术。
本方法可以用于产生表达任何数目外源基因的转基因植物，而不被这种基因的选择限制。目的外源基因的选择根据研究者的目的而定，能够用于本发明的目的基因的大量实例是本领域公知的(例如，苏云金杆菌毒素基因、除草剂抗性基因如提供抗草甘膦抗性的莽草酸合成酶基因、美国专利5,188,642，或提供抗2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)抗性的2，4-D单加氧酶基因，Bayley等，理论及应用遗传学，82卷，PP.645-49，雄性不育基因如美国专利5,741,684的反义基因(Fabijanski，等)，甚或美国专利5,723,765(Oliver等)描述的精细作物保护系统)。
本领域认为棉花再生有很强的品种依赖性。已证明Coker系列棉花品种相对易于转化。然而，DP 5412，Zhongmian 12和许多其它品种仍然难于再生。海岛棉和其它二倍体种情况是相同的。然而棉花的体细胞胚胎发生和再生成整个植株是高度基因型依赖的过程，用本发明方法已成功转化并再生两种不同的棉花品种，即美国Coker 312和中国Si-Mian 3。因此认为本发明可广泛应用于不同棉花种系的转化。
用标准Southern杂交技术已证实本发明的方法产生的棉花的基因组中的转基因整合，同样可以鉴定各转基因品系中的插入转基因的拷贝数(参见实施例6，见下)。可以检测转基因棉F1代中转基因的存在，并可以分析F1代的转基因遗传模式以证实其稳定性和遗传性。
与其它报道的方法相比，本发明的棉花转化系统具有更高的转化效率和生存率。这有几方面的原因。本发明中，使用叶柄作为外植体进行转化。不同类型的棉花外植体对植株的转化和再生效率有显著性影响。(Firoozabady等，1987)。曾有报道用叶柄进行体细胞胚胎发生的诱导。但再生并不成功或再生率极低(Finer和Smith，1984；Gawel等，1986)。而本发明中，通过使用下文所述的改良培养基显著提高了再生效率。在优选的实施方案中，在含低浓度2，4-D和激动素的MMST培养基(见下文所述)中培养幼嫩的在初生维管束组织中富含薄壁组织细胞的叶柄时，获得高质量的愈伤组织。
使用本发明，在悬浮培养基中诱导胚胎的时间可以缩短到10-14天，而不是以前报道的3周(Cousins等，1991)。发现缩短悬浮培养基处理的时间对高频率诱导胚胎发生是很重要的。因为当棉花愈伤组织在悬浮培养基中长时间保存时，产生高百分比的很难再生的玻璃体胚胎，所以减少异常胚胎的产生也是重要的(Chen等，未发表的观察结果)。
为了除幼小植株生长期以外的不同阶段的最大细胞生长，使用葡萄糖作为单一碳源。培养基中葡萄糖的量可以为约10至约50g/l，优选为约30g/l。在幼小植株生长期，优选葡萄糖和蔗糖各为约10g/l作为碳源以促进幼小植株的健康生长。
对于愈伤组织的生长、胚胎发生和愈伤组织增殖，pH 5.8-7.5，优选pH6.2-7.0，最优选pH6.5。为了小植株根部健康生长，优选pH7.0的培养基。
为了有效的愈伤组织引发和胚胎潜能诱导，在愈伤组织诱导和选择培养基中低浓度的2，4-D和激动素是重要的。2，4-D的量可以为0至约0.5mg/l，优选为约0.05mg/l。激动素的量为0.0mg/l至约1.0mg/l，优选为约0.1mg/l。在愈伤组织分化阶段和胚胎萌发阶段，当培养基中不添加植物激素时获得最佳的结果。
氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺是特别有利于胚胎萌发和根部发生的优于无机氨氮的氮源。在胚胎萌发的培养基中，天冬酰胺的量为约200至约1000mg/l，优选为约500mg/l。谷氨酰胺的量为约500至约2000mg/l，优选为约1000mg/l。使用这些优选的氮源，当胚胎萌发、生长和根部发生被优先促进时，非胚胎发生的愈伤组织生长被抑制。
在除与土壤杆菌共培养之外的棉花转化的不同阶段，植物组织和愈伤组织优选保持在28℃，但可以在25-35℃变化。为了有效的转化，共培养阶段的温度不应高于28℃。棉花转化和再生的所有阶段的优选光照条件均为每天光照16小时(60-90，μEm-2S-1)，8小时避光。
与以前报道的转化和再生方法(Umbeck等，1987；Firoozabady等，1987，Cousins等)不同，本发明使用的培养基在几个方面得到优化(a)除用于在植入温室前培养幼小植株的培养基之外，所有的培养基都使用葡萄糖作为单一碳源；(b)培养基调至高pH值(6.5-7.0)；(c)仅在愈伤组织引发阶段使用低浓度的2，4-D(0.05mg/l)和激动素(0.1mg/l)，在其它阶段不使用激素；(d)用于胚胎萌发的培养基中使用天冬酰胺和谷氨酰胺替代无机氨氮。这些改良适合棉花胚胎发生和小植株生长的生理需要。已发现健康的胚胎发生和小植株生长，特别是根系发生，极大地得利于这些优化的培养基。例如，已发现天冬酰胺和谷氨酰胺是优于无机氨氮的氮源，利于胚胎萌发和根部发生。在含有天冬酰胺和谷氨酰胺作为氮源的优选的MMS3培养基(如下文所述)中，当胚胎萌发、生长和根部发生被有利地促进时，非胚胎生成的愈伤组织的生长受到抑制。由于健康的根部发生，由本发明方法获得的移植转基因棉存活率几乎是100％。报道的下胚轴和子叶方法(Umbeck等，1987；Firoozabady等，1987)，不好的根部发生被认为是移植转基因棉植株的低存活率的主要原因。
以下是实施例中优选使用的组织培养基(1)幼苗生长培养基(每升)1/2 MS基本盐混合物(Sigma M5524)0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉兰糖胶(PhytagelTM，Sigma)pH7.0(2)叶柄预培养培养基(每升)MS基本盐混合物0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉兰糖胶(PhytagelTM，Sigma)pH7.0(3)共培养培养基(每升)MS基本盐混合物100mg盐酸硫胺素1mg盐酸吡多醇1mg烟酸100mg 肌醇0.05mg 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.1mg 激动素30g葡萄糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉兰糖胶(PhytagelTM，Sigma)pH 6.5(4)MMS1-愈伤组织诱导和选择培养基(每升)共培养培养基50mg 卡那霉素500mg 头孢噻肟(5)MMS2-分化培养基(每升)MS基本盐混合物10mg 盐酸硫胺素1mg盐酸吡多醇1mg烟酸100mg 肌醇0.9g KNO330g葡萄糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉兰糖胶(PhytagelTM，Sigma)pH6.5(6)MMS3-胚胎萌发培养基(每升)3.8gKNO3440mg CaCl2·H2O375mg MgSO4·7H2O170mg KH2PO41g 谷氨酰胺500mg 天冬酰胺43mgEDTA三价铁-钠盐MS微量营养物(Murashige和Skoog，1962)10mg 盐酸硫胺素1mg盐酸吡多醇1mg烟酸100mg 肌醇30g葡萄糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉兰糖胶(PhytagelTM，Sigma)pH6.5(7)幼小植株培养基S&H培养基大量和微量元素(Strewart和Hsu，1977)10mg 盐酸硫胺素1mg盐酸吡多醇1mg烟酸100mg 肌醇10g葡萄糖10g蔗糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉兰糖胶(PhytagelTM，Sigma)pH7.0下述实施例的目的在于说明本发明，而非在任何意义上限制本发明的范围，本发明的范围仅在权利要求中限定。实施例1土壤杆菌菌株和质粒A.使用土壤杆菌菌株LBA 4404(pBI121GFP)转化棉花叶柄和幼小的茎。
图1显示pBI121GFP物理图谱，其含有GFP作为报道基因和NPTII基因(编码新霉素磷酸转移酶)作为选择标记。GFP和NPTII基因分别受CaMV 35S启动子和nos启动子的控制。为了构建pBI121GFP，将来自质粒pGFP2的720bp的GFP基因XbaI-SstI片段克隆到质粒载体pBI121(Clonetech)上相同的位点以替代GUS基因。通过电穿孔将pBI121GFP质粒导入根癌土壤杆菌LBλ4404中。
收集低光照条件下在温室中生长8-12周植株的幼嫩叶柄。用70％乙醇表面灭菌叶柄几秒钟，然后用20％漂白溶液(Clorox Co.USA，含1％氯)表面灭菌20分钟。在无菌水中清洗五次后，叶柄在MS培养基中预培养3天。
将叶柄和幼嫩的茎切成约2cm长的片段。将片段浸入稀释的细菌悬浮液中5分钟，然后转移到含有浸在50mml共培养培养基中的滤纸的塑料平皿(100×25mm)上。平皿置于24℃培养箱中连续光照48小时。将共培养外植体转移到MMSI培养基中并在28℃培养，每天光照(60-90，μEm-2s-1)16小时，避光8小时。2-4周后在叶柄片段的切割端产生愈伤组织。4-6周后已出现卡那霉素抗性的愈伤组织，计算愈伤组织的数目并检测GFP基因的表达。
在荧光显微镜下，未转化的对照愈伤组织显红色，而表达GFP基因的转化愈伤组织显示鲜明的绿色荧光。总共检测113个推测转化的愈伤组织的GFP活性，GFP基因的转化频率是39.8％(表1)。当使用棉花品种Si-Mian 3的叶柄转化时，发现26个检测的愈伤组织中有11个为GFP阳性，转化效率是42.3％。表1棉花Coker 312和Si-Mian 3叶柄的转化频率
实施例4诱导体细胞胚胎发生和植株再生选择急剧生长和强表达GFP的愈伤组织并将其转移到液体MMS2培养基中悬浮培养2周。选择易成粉状的乳白色颗粒状愈伤组织并将其转移到半固体分化培养基MMS2中。约2个月后，产生大量胚状体。1-2个月内，培养基上逐渐发生胞质紧密的胚胎发生结构，并产生大胚胎。短时间的悬浮培养处理，不仅对高频率诱导胚胎发生很重要，而且对产生高质量的胚状体很重要。再次检查GFP基因的表达均是GFP阳性的。
将具有强GFP活性的胚状体和胚胎发生愈伤组织转移到MMS3培养基中。1-2个月后，将约1-2cm高的具有1-2片真叶和根部发生良好的小植株转移到幼小植物生长培养基培养约一个月。约一个月后，将具有6-8片叶子和高约10-15cm的小植株移植于土壤中并移入温室。所有30株移植的转基因植株均存活并发现表达GFP蛋白。获得所使用的转基因小植株所需要的总时间少于7个月，移植于温室后看到小植株另需2个月(参见表2)。表2从转化叶柄片段到植株再生的时间范围(Coker 312)
实施例5检测GFP蛋白活性使用Leica MZ FLIII荧光立体显微镜，其具有480/40nM激发滤片和510nM阻挡滤片，检测GFP蛋白活性的表达。
在荧光立体显微镜下，转化愈伤组织、胚状体，和幼嫩小植株中GFP基因的绿色荧光易于分辨，而未转化的对照呈红色。可能是因为某些生色的化学物质积累于根部，未转化的根部是例外，其在荧光显微镜下显示弱绿色。但由于GFP蛋白产生的绿色荧光更亮更均一，所以仍然可鉴定出有GFP活性的根。在荧光立体显微镜产生的蓝光下，诸如叶和茎这样富含叶绿素的绿色植物组织的红色荧光清晰可见。在GFP阳性绿色植物组织中，由于红色和绿色荧光的重叠，黄色荧光也可检测到。然而，与植物其它部分相比，GFP基因在花瓣和花药中的表达更低。实施例6转基因植物的分析根据Paterson等(1993)纯化推测转化品系和未转化对照植株的基因组。用EcoRI消化后，EcoRI切割位于嵌合GFP基因T-DNA左边缘和Nos-3′终止子之间的inj(图1)，根据生产商说明书用0.8％的TAE琼脂糖凝胶分离DNA并转移到Hybond-N膜上。通过紫外交联将DNA固定于膜上，再用DIG标记的GFP基因编码区杂交。根据生产商说明书(BOEHRINGER MANNHEIM)用抗-DIG-AP缀合物检测杂交探针。
用GFP基因编码区作为杂交探针，Southern杂交分析来自11个随机选择的转基因品系和1个未转化的对照植株的基因组DNA样品。数据表明11个品系中7个有单拷贝，3个品系有2拷贝，1个品系有6拷贝的T-DNA插入。具有单一拷贝T-DNA插入的转基因品系的高百分比说明这种转化方法导致基因沉默和不希望的插入突变体的危险较低。
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权利要求
1.生产转基因棉植株的方法，所述方法包括下列步骤(a)获得棉叶柄外植体，(b)将叶柄外植体暴露于携带包含外源基因和选择标记的载体的根癌土壤杆菌培养物，该土壤杆菌能够实现外源基因和选择标记抗性基因稳定转移到叶柄外植体细胞的基因组中，(c)培养叶柄外植体以诱导愈伤组织形成，(d)选择表达外源基因的转化愈伤组织，(e)在悬浮培养液中培养所选择的愈伤组织以诱导胚状体形成，(f)使胚状体再生成整株转基因棉植株。
2.如权利要求1所述的方法，其中的叶柄外植体在暴露于根癌土壤杆菌培养物之前预培养一段时间。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)-(e)中使用的培养基含有葡萄糖作为单一碳源。
4.如权利要求3所述的方法，其中葡萄糖的量为约10g/l至约50g/l。
5.如权利要求4所述的方法，其中葡萄糖的量为约30g/l。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和(d)-(e)中使用的培养基不含激素。
7.如权利要求1所述的方法，其中胚状体萌发在含有选自天冬酰胺、谷氨酰胺，或天冬酰胺和谷氨酰胺二者的氮源的培养基中进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中氮源的量为约700mg/l至约5g/l。
9.如权利要求8所述的方法，其中氮源的量为约3.8g/l。
10.如权利要求7所述的方法，其中氮源是天冬酰胺和谷氨酰胺二者，且天冬酰胺的量为约200mg/l至约1g/l，谷氨酰胺的量为约500mg/l至约2g/l。
11.如权利要求10所述的方法，其中天冬酰胺的量为约500mg/l，谷氨酰胺的量为约1g/l。
12.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)的悬浮培养基的保存时间少于约20天。
13.如权利要求12所述的方法，其中步骤(e)的悬浮培养基的保存时间为约10至约20天。
14.如权利要求13所述的方法，其中步骤(e)的悬浮培养基的保存时间为约14天。
15.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)在低浓度的一种或多种激素的存在下进行。
16.如权利要求15所述的方法，其中任何一种激素的浓度为0至约1mg/l。
17.如权利要求15所述的方法，其中步骤(c)在浓度为0至约0.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸和浓度为0至约1mg/l的激动素的存在下进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为约0.05mg/l，激动素的浓度为约0.1mg/l。
全文摘要
本发明公开了土壤杆菌介导转化叶柄组织从而产生转基因棉的方法。本发明包括步骤(a)获得棉花叶柄的外植体,(b)将叶柄外植体暴露于携带包含外源基因和选择标记的载体的根癌土壤杆菌培养物,该土壤杆菌能够实现外源基因和选择标记抗性基因稳定转移到叶柄外植体细胞的基因组中,(c)培养叶柄外植体以诱导愈伤组织形成,(d)选择表达外源基因的转化愈伤组织,(e)在悬浮培养基中培养所选择的愈伤组织以诱导胚状体形成,(f)使胚状体再生形成整株转基因棉植株。
文档编号C12N5/10GK1352692SQ9981672
公开日2002年6月5日 申请日期1999年6月11日 优先权日1999年6月11日
发明者陈志贤, 张炼辉 申请人:分子农业生物学院