弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶、基因及其使用方法

专利名称：弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶、基因及其使用方法
背景技术：
发明领域本发明涉及分子生物学、细菌学和工业发酵领域。更明确地说，本发明涉及对弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)中一个新的膜结合山梨糖醇脱氢酶之亚基的核酸序列和蛋白质的鉴定和分离。本发明进一步涉及从D-山梨糖醇发酵产生L-山梨糖以及随后2-酮-L-古洛糖酸的产生。
相关领域山梨糖醇脱氢酶(SDH)是一种酶，在生产2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)(合成维生素C的一个重要前体)的过程中，其负责在山梨糖发酵期间将D-山梨糖醇有效转化为L-山梨糖。葡糖杆菌属(Gluconobacter)具有数种SDH，根据它们对辅因子的需要可分类为(1)NAD-依赖的，(2)NADP-依赖的，以及(3)NAD(P)-不依赖的类型。其中，在工业的山梨糖发酵期间，认为NAD(P)-不依赖的酶直接参与山梨糖的有效产生(Cummins，J.T.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，224，323；226，301(1957))。
从D-山梨糖醇生产L-山梨糖的方法一般通过发酵醋酸细菌(如弱氧化葡糖杆菌和木醋杆菌(Acetobacter xylinum))进行。室温条件下，24小时内可进行96-99％的转化(Liebster，J.等人，化学杂志(Chem.List.)，50395(1956))。
通过SDH作用产生的L-山梨糖是产生2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的一个底物。产生2-KLG的许多方法是公知的。例如，对广泛品种的细菌通过氧化L-山梨糖经过山梨酮(sorbosone)中间产物至2-KLG而发酵产生2-KLG的方法进行了描述，其中细菌为氧化葡糖杆菌(美国专利Nos.4,935,359；4,960,695；5,312,741；和5,541,108)；Pseudogluconobactersaccharoketogenes(美国专利No.4,877,735；欧洲专利No.221 707)；Pseudomonas sorbosoxidans(美国专利Nos.4,933,289和4,892,823)；上述菌与其它属(如醋杆菌属(Acetobacter)、芽胞杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、分支杆菌属(Mycobacterium)和链霉菌属(Streptomyces)(美国专利Nos.3,912,592；3,907,639；和3,234,105))的微生物混合物；以及新的菌株(美国专利No.5,834,231)。
文献中已鉴定了一些参与山梨糖醇、山梨糖和山梨酮发酵氧化的酶。美国专利Nos.5,88,786；5,861,292；5,834,263和5,753,481公开了编码L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶的核酸分子和/或者分离的蛋白质；并且美国专利No.5,747,301公开了一种具山梨糖醇脱氢酶特性的酶。
除了基于对辅因子的需要而区分葡糖杆菌属SDH外，在文献中也可找到其它的物理特性来区分这些不同的酶。例如在美国专利No.5,747,301中所鉴定的山梨糖醇脱氢酶是基于其亚细胞定位(膜结合的)和800±50KDa的haloenzyme分子量(79±5KDa的10个同源亚基)而区分的。由Shinagawa等人分离的膜结合D-山梨糖醇脱氢酶(E.Shinagawa，K.Matsushita，O.Adachi和M.Ameyama(农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.)，46，135-141，1982))由三种亚基组成，其分子量为63,000、51,000和17,000。
在致力于提高产生2-KLG商业发酵的产量时，发明者在一株弱氧化葡糖杆菌中，鉴定了一种新的膜结合山梨糖醇脱氢酶，其不同于文献中描述的其它山梨糖醇脱氢酶(Choi，E.C.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Lett.)，125；45(1995))。
发明概述本发明涉及弱氧化葡糖杆菌的一种新的膜结合山梨糖醇脱氢酶。所分离的山梨糖脱氢酶包含三个亚基75kDa的第一个亚基，其包含作为辅因子的吡咯并喹啉醌(PQQ)；50kDa的第二个亚基，其为细胞色素c；以及29kDa的第三个亚基，其在酶的稳定性和催化活性方面起着重要作用。
本发明提供了此处描述的葡糖杆菌属山梨糖醇脱氢酶的三个蛋白质亚基的核酸分子。在第一个具体的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其涉及如SEQ ID NO1所示的第一个SDH亚基(75kDa)。在第二个具体的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其涉及如SEQ ID NO2所示的第二个SDH亚基(50kDa)。在第三个具体的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其涉及如SEQ ID NO3所示的第三个SDH亚基(29kDa)。其它相关的实施方案涉及载体、其产生方法及携带该载体的宿主细胞。
本发明也提供了分离的核酸分子，其编码本发明之SDH的三个亚基。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一个克隆的核酸分子，其编码75kDa和50kDa亚基。山梨糖醇脱氢酶第一个及第二个亚基的结构基因分别为2,265bp和1,437bp长，它们聚集在该克隆的核酸分子中，其中该克隆的核酸分子为显示操纵子特性的5.7kb PstI DNA片段。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了一个克隆的核酸分子，其编码第三个(29kDa)SDH亚基之蛋白质。编码第三个亚基的结构基因为921bp长，且存在于4.5kb ClaI DNA片段中。其它相关的实施方案涉及载体、其产生方法及携带该载体的宿主细胞。
本发明也涉及此处描述的SDH之三个亚基的分离多肽。
本发明也提供了产生D-山梨糖的方法，其包括(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自包含SEQ ID NO1多核苷酸序列的多核苷酸；包含SEQ ID NO2多核苷酸序列的多核苷酸；以及包含SEQ ID NO3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
本发明的另一个方面涉及产生2-KLG的方法，其包括(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自包含SEQ IDNO1多核苷酸序列的多核苷酸；包含SEQ ID NO2多核苷酸序列的多核苷酸；以及包含SEQ ID NO3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
附图简述

图1表示使用pH5.0(A)和PH6.0(B)醋酸钠缓冲液的DEAE-TSK柱层析。
图2表示对DEAE-TSK柱层析法分离的峰I级分(A)和峰II级分(B)的SDS-PAGE分析。
图3表示使用pH6.5磷酸钠缓冲液的DEAE-TSK柱层析。
图4表示在pH6.5时用DEAE-TSK柱分离的峰I(列1)，峰II(列3)以及峰III(列2)柱级分的SDS-PAGE分析。列M表示分子量标准标记。
图5表示用胰蛋白酶消化峰II蛋白质后的HPLC层析谱，其中峰II蛋白质来自pH6.5时的DEAE-TSK柱层析。虚线代表流动相中乙腈的浓度梯度。
图6表示λGEM5-1的限制性酶切图谱。用作探针的1.53kb DNA片段(#SDH2-1)用实心条显示。
图7表示λGEM5-1中5.7kb PstI片段用不同组的限制性酶切后产生的S1、S2和S3 DNA片段的定位。
图8表示5.7kb PstI片段中的4,830个碱基的核苷酸序列(SEQ IDNO7)。第一个和第二个亚基推断的氨基酸序列显示在核苷酸序列下。通过对纯化的山梨糖醇脱氢酶N-末端氨基酸测序而获得的氨基酸序列用下划线表示。信号序列切割位点用三角形标记。血红素结合序列用虚的下划线表示。潜在的核糖体结合序列(SD)封闭在框中。转录终止茎-环结构用箭头表示。第一个亚基基因完整的编码序列位于665-2,929处(SEQ IDNO1)，其中信号序列位于665-766，且编码SDH第一个亚基成熟蛋白质的序列位于767-2,929(SEQ ID NO22)。第二个亚基基因完整的编码序列位于2,964-4,400处(SEQ ID NO2)，其中信号序列位于2,964-3,071，且编码SDH第二个亚基成熟蛋白质的序列位于3,072-4,400(SEQ IDNO23)。
图9表示ClaI-#69的限制性酶切图谱。封闭框表示山梨糖醇脱氢酶第三个亚基基因的编码区。
图10表示包括山梨糖醇脱氢酶第三个亚基基因的DNA片段之核苷酸序列(SEQ ID NO8)。推断的氨基酸序列显示在核苷酸序列下，信号序列切割位点用三角形标记。潜在的核糖体结合序列(SD)封闭在框中。第三个亚基基因完整的编码序列位于1,384-2,304处(SEQ ID NO3)，其中信号序列位于1,384-1,461，且编码SDH第三个亚基成熟蛋白质的序列位于1,462-2,304(SEQ ID NO24)。
优选的实施方案详述1、定义克隆载体质粒或噬菌体DNA或其它DNA序列，其可在宿主细胞中自主复制，并且其通过一个或少量几个限制性内切酶识别位点表征，在上述识别位点处，DNA序列以可决定的方式被切割但不丢失载体所必需的生物功能，并且可将DNA片段插入其中，引起该DNA片段的复制和克隆。该克隆载体可进一步包含标记，其适用于对克隆载体所转化之细胞的鉴定。标记例如，可提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
表达表达是从结构基因产生多肽的过程。该过程包括将基因转录为mRNA和将此mRNA翻译为多肽。
表达载体类似于克隆载体的载体，但其在转化进宿主后可增强克隆于其中的基因的表达。克隆的基因通常置于(即有效连接于)某些控制序列(如启动子序列)的控制之下。启动子序列可为组成型的或可诱导型的。
基因一段DNA序列，其包含表达蛋白质或多肽所需的信息。
宿主任一原核或真核细胞，其为可复制的表达载体或克隆载体的接纳体。此处所用术语“宿主”也包括用公知的基因工程技术设计的原核或真核细胞，在其染色体或基因组上含有目标基因。此类宿主实例见Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二版(Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)。
同源的/非同源的如果两个核酸分子的核苷酸序列相似性高于50％，则认为它们是“同源的”，这一点可通过HASH-编码算法确定(Wilber，W.J.和Lipman，D.J.，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，80726-730(1983))。如果两个核酸分子的核苷酸序列相似性低于50％，则认为它们是“非同源的”。
突变如此处所用，该术语指目标核苷酸序列中单一碱基对的改变、插入、或删除。
诱变如此处所用，该术语指在DNA中产生突变的过程。对于“随机”诱变，突变的确切位点是不可预测的，其可发生在微生物染色体的任一处，并且突变的发生是由试剂(如放射性)引起的物理损伤或化学处理的结果。
操纵子如此处所用，该术语指细菌基因表达和调节的单位，包括DNA中的结构基因和调节元件。
亲代菌株如此处所用，该术语指一株微生物菌株，其易于受到一些形式的诱变而产生本发明的微生物。
表型如此处所用，该术语指依赖于微生物的遗传组成的、可观察到的物理特征。
启动子一段DNA序列，其通常描述为基因的5’区，位于起始密码子邻近处。毗连基因的转录起始于启动子区。如果启动子是可诱导型启动子，那么诱导剂可提高转录速率；相反，如果启动子是组成型启动子，转录速率不受诱导剂调节。
重组宿主根据本发明，重组宿主可为任一原核或真核细胞，其包含在表达载体或克隆载体上的目标克隆基因。该术语也包括那些经基因工程设计过的原核或真核细胞，在该有机体的染色体或基因组上包含目标基因。
重组载体任一包含目标克隆基因的克隆载体或表达载体。
2、山梨糖醇脱氢酶的分离和纯化使用一系列的柱层析步骤，本发明从弱氧化葡糖杆菌KCTC2111(韩国典型培养物保藏中心)2111(等同于ATCC 621)的胞浆膜分离和纯化SDH。提供了该纯化酶的生化特性，并且分离了每一个亚基，用氨基酸序列分析仪(Applied Biosystems，Model 477A)测定了每一个亚基的N-末端氨基酸序列。
不同于已报道的、来自弱氧化葡糖杆菌IFO 3254菌株的、FAD-依赖的SDH(Shinagawa，E等人，农业与生物化学，46135(1982))，新表征的酶含有作为辅因子的吡咯并喹啉醌(PQQ)，且包含三个亚基(Choi，E.C.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报，125；45(1995))。
本发明的SDH可用标准的蛋白质技术分离。简言之，在SYP培养基中(5％D-山梨糖醇、1％Bacto-Peptone、0.5％酵母提取物)培养弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111，在10mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)中裂解细胞。12,000g离心去除细胞碎片后，所得上清超离心以回收胞浆膜级分。用1.5％正辛基葡糖苷(Boehringer Mannheim)溶解胞浆膜级分，通过一系列的层析柱(包括CM-TSK 650(S)(Merck)、DEAE-TSK 650(S)(Merck)、Mono-S(Pharmacia)和Superose 12(Pharmacia))完成纯化。
所纯化的酶对多元醇具有活性，如D-山梨糖醇(100％)、D-甘露醇(68％)和D-核糖醇(70％)。当加入吡咯并喹啉醌(PQQ)时，酶活性增高达9倍，暗示PQQ是酶的辅因子；荧光谱分析确证纯化的酶包含吡咯并喹啉醌(PQQ)。纯化酶的吸收谱分析阐示该酶包含细胞色素c。当纯化的酶在pH4.3下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(Reisfeld，R.A.等人，自然(Nature)，195281(1962))时，它在活性染色后的胶上形成一条单一的活性带。
纯化酶的最初SDS-PAGE分析显示该酶包含三个亚基，为75kDa、50kDa和14kDa，分别将它们命名为第一个亚基、第二个亚基和第三个亚基(Choi，E.C.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报，125；45(1995))。然而在对该酶的进一步研究中，发现29kDa的另一个亚基对SDH的稳定性和催化活性起着很重要的作用。就是说在研究一系列pH条件以增加DATE-TSK柱纯化过程中蛋白质的分离性能时发现，在pH5.0洗脱时部分分离的活性峰在pH6.0洗脱时完全分离为两个分别的活性峰。先洗脱的活性峰很快失去了酶活性，而后洗脱的活性峰仍然稳定。通过SDS-PAGE分析这两个峰，发现具稳定酶活性的峰除了包含75kDa和50kDa亚基外，还包含一个额外的29kDa亚基，而迅速失去酶活性的峰只包含75kDa和50kDa亚基。这个额外的29kDa亚基重命名为第三个亚基在丙烯酰胺胶上将以前指定的第三个亚基(14kDa亚基)与其它亚基比较相对含量时，不能确定14kDa亚基是否是酶的一个真正亚基。也发现了将洗脱缓冲液的pH进一步增加至pH6.5会导致三个亚基完全分离为单个的亚基。
通过Ferric-Dupanol测定法(Wood，W.A.等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)，5287(1962))测试两个或三个亚基的不同组合对酶活性的恢复，发现只有存在29kDa的第三个亚基，酶活性才完全恢复。因此可得出结论29kDa的第三个亚基在SDH的稳定性和催化活性方面起着重要的作用。
用D-山梨糖醇作为底物时，测定的米-曼氏常数为Km＝120mM，Vmax＝3.9×10-5M/分钟。二氯酚靛酚(DCIP)或高铁氰化物作为酶的电子受体可有效发挥作用。当加入吩嗪硫酸甲酯(PMS)作为电子传递体时，酶活性增加。加入钙或镁离子可显著增加纯化酶的活性，而加入铜离子可严重抑制酶的活性。
本发明之SDH酶的纯化和表征的进一步详述在实施例1中提供。
3、本发明的核酸分子本发明提供分离的核酸分子，其编码此处描述的SDH酶三个亚基中的一个或多个亚基。设计用于操纵分离的核酸分子的方法和技术为本领域公知。例如，核酸分子的分离、纯化和克隆方法，以及描述真核和原核宿主细胞的使用和其中的核酸及蛋白质表达的方法和技术在Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二版。冷泉港，纽约，1989，和分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，FrederickM.Ausubel等人Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1987中描述，在此处公开引用作为参考。
更明确地，本发明提供了一些分离的核酸分子，其编码本发明之SDH酶单独的75kDa、50kDa和29kDa亚基蛋白质。另外，本发明提供了一些分离的核酸分子，其编码本发明之SDH酶的一个或多个亚基蛋白质。为了清楚起见，描述了本发明特定的分离核酸分子。然后，更加详细地描述了这些分离的核酸分子的特性和表征。
除非另外指出，此处通过测定DNA分子序列而得到的所有核苷酸序列是使用自动DNA测序仪(如Applied Biosystems，Inc.的Model 373A)测定的，并且由此处测定之DNA分子所编码多肽的所有氨基酸序列是通过翻译上述测定的DNA序列而预测的。因此，任何用这种自动方法测定的DNA序列、任何此处测定的核苷酸序列可能含有一些错误，这一点为本领域公知，自动化测定的核苷酸序列一般至少约90％，更一般至少约95％到至少约99.9％等同于被测序DNA分子的实际核苷酸序列。实际序列可通过其它方法更精确地测定，其中包括本领域公知的手工DNA测序法。与实际的序列相比，在测定的核苷酸序列中单碱基插入或删除会引起核苷酸序列的翻译移码，致使预测的、由测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列自该插入或删除处开始完全不同于由被测序DNA分子编码的实际氨基酸序列，这一点也是本领域公知的。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第一个亚基(75kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQ IDNO1的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO1多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO4的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码的片段为SEQ ID NO4氨基酸序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第一个亚基(75kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第一个亚基(75kDa)的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第二个亚基(50kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQID NO2的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO2多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO5的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码的片段为SEQ ID NO5氨基酸序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第二个亚基(50kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第二个亚基(50kDa)的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQID NO3的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO3多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO6的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码的片段为SEQ ID NO6氨基酸序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明之SDH酶第一个(75kDa)和第二个(50kDa)亚基蛋白质的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQ ID NO7的多核苷酸；以及(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO7多核苷酸的至少约20个核苷酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第一个(75kDa)和第二个(50kDa)亚基蛋白质的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于本发明之SDH酶第一个(75kDa)和第二个(50kDa)亚基蛋白质的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQID NO8的多核苷酸；以及(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO8多核苷酸的至少约20个核苷酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸序列。
“分离的”核酸分子是指DNA或RNA核酸分子，其已被从其天然环境移出。例如，包含在载体中的重组DNA分子被认为是为了本发明目的而分离的。分离的DNA分子之进一步的实例包括异源宿主细胞内存在的重组DNA分子或在溶液中的纯化(部分地或基本地)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明之DNA分子的体内或体外RNA转录本。根据本发明之分离的核酸分子进一步包括合成产生的此类分子。
RNA载体也可应用于本发明所公开的SDH核酸分子。这些载体是基于正链或负链RNA病毒的，其在许多真核细胞中自然复制(Bredenbeek，P.J.和Rice，C.M.，病毒学(Virology)，3297-310(1992))。这些病毒不像逆转录病毒，它们缺乏中间体DNA的生活周期相，完全以RNA形式存在。例如，用甲病毒作为外源蛋白质的表达载体，因为它们可应用于大范围的宿主细胞并且可提供高水平的表达；这类病毒的实例包括辛德比斯病毒(Sindbis virus)和无名森林病毒(Semliki Forest virus)(Schlesinger，S.，生物技术趋势(TIBTECH)1118-22(1993)；Frolov，I.等人，美国国家科学院院报9311371-11377(1996))。通过使用Invitrogen的辛德比斯表达系统，研究者在实验室可方便地以DNA形式维持重组分子(pSinrep 5质粒)，而以RNA形式增殖也是可行的。在用于表达的宿主细胞内，包含目标基因的载体完全以RNA形式存在，并且如果希望的话可以那种状态不断增殖。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了变体的核酸分子，其编码此处描述之分离的核酸分子的一部分、类似物或衍生物。变体包括那些通过核苷酸替换、删除或添加而产生的变体，其可涉及到一个或多个核苷酸。变体可为编码区、非编码区或两者中的改变。编码区的改变可产生保守的或不保守的氨基酸替换、删除或添加。
本发明之分离的核酸分子的变体可自然发生，如自然的等位基因变体，“等位基因变体”是指基因的一些交替形式之一，其中所述基因位于有机物染色体上的某个位点。基因II(Genes II)，Lewin，B.，ed.，John Wiley& Sons，纽约(1985)。非自然发生的变体可使用本领域公知的诱变技术产生。
本发明之分离的核酸分子也包括多核苷酸序列，其与此处描述的分离的核苷酸分子相比较95％、96％、97％、98％和99％是相同的。计算机程序如BestFit程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin SequenceAnalysis Package)，Unix版本10，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)可用于确定任一特定的核酸分子与此处公开的核苷酸序列或此处描述的保藏克隆之核苷酸序列是否至少有95％、96％、97％、98％和99％是相同的。BestFit使用Smith和Waterman的局部同源性算法，应用数学进展(Advances inApplied Mathematics)2482-489(1981))，以发现两序列间的最佳同源片段。
例如，当计算机对比程序(如BestFit)用于确定与参照核苷酸序列具95％的同一性时，它是对参照核苷酸序列之全长来计算同一性百分率，并且允许参照序列之核苷酸总数中有高达5％的同源性差异。这样，所分析的每100个碱基对中，95％的同一性表示被测序列中每100个核苷酸中，有多达5个核苷酸与参照核苷酸序列不同。
本发明也包括此处描述的核苷酸序列片段和分离的核酸分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了至少20个碱基长的片段。此类片段的长度用数学易于定义。例如，SEQ ID NO1提供了一种长为2,265个碱基的分离的核酸分子。至少20个碱基长的SEQ ID NO1的片段(F1)可定义为F1＝20+X，其中X定义为0或从1至2,245之间的任一全整数。同样，此处描述的其它分离的核酸分子片段可如下定义对于长为1,437个碱基的SEQ ID NO2，至少20个碱基长的SEQ ID NO2的片段(F2)可定义为F2＝20+X，其中X定义为0或从1至1,417之间的任一全整数。对于长为921个碱基的SEQ ID NO3，至少20个碱基长的SEQ ID NO3的片段(F3)可定义为F3＝20+X，其中X定义为0或从1至901之间的任一全整数。对于长为4,830个碱基的SEQ ID NO7，至少20个碱基长的SEQ ID NO7的片段(F7)可定义为F7＝20+X，其中X定义为0或从1至4,810之间的任一全整数。对于长为2,700个碱基的SEQ ID NO8，至少20个碱基长的SEQ ID NO8的片段(F8)可定义为F8＝20+X，其中X定义为0或从1至2,680之间的任一全整数。本领域技术人员将了解本发明之分离的核酸序列片段可为单链或双链分子。
本发明公开了分离的核酸分子，其编码本发明之SDH酶的三个亚基蛋白质。计算机分析提供了关于每一个亚基的开放读码框、推定的信号序列及成熟蛋白质形式的信息。编码第一个(75kDa)和第二个(50kDa)的基因完全包含在λGEM5-1克隆的一个5.7kb PstI片段中，在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)，韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology，KRIBB)，52，Oun-Dong，Yusong-Ku，Taejon 305-33，韩国，该克隆保藏在细菌中保藏号为KCTC 0593BP，以及作为DNA保藏的保藏号为KCTC 0597BP。第三个(29kDa)亚基基因包含在称为ClaI-#69中的一个4.5kb长的序列中，在韩国典型培养物保藏中心(KoreanCollection for Type Cultures，KCTC)，韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)，52，Oun-Dong，Yusong-Ku，Taejon 305-33，韩国，ClaI-#69保藏在细菌中的保藏号为KCTC 0594BP，以及作为DNA保藏的保藏号为KCTC0598BP。
这样，本发明提供了携带于新菌株KCTC 0593BP中的分离的核酸分子(KCTC 0597BP)，并且本发明也提供了携带于新菌株KCTC 0594BP中的分离的核酸分子(KCTC 0598BP)。
从λGEM5-1的5.7kb PstI片段获得的序列见图8，并命名为SEQ IDNO7。第一个亚基基因完整的编码序列位于665-2,929处(SEQ IDNO1)，其中信号序列位于665-766，且编码SDH第一个亚基成熟蛋白质的序列位于767-2,929(SEQ ID NO22)。第二个亚基基因完整的编码序列位于2,964-4,400处(SEQ ID NO2)，其中信号序列位于2,964-3,071，且编码SDH第二个亚基成熟蛋白质的序列位于3,072-4,400(SEQ IDNO23)。
这样，本发明的另一个实施方案提供了分离的核酸分子，其衍生于图8中从λGEM5-1的5.7kb PstI片段获得的如SEQ ID NO7所示的序列。此类分离的核酸分子包括以下核苷酸(1)如SEQ ID NO28所示的SEQ ID NO7中1-644的核苷酸；(2)如SEQ ID NO29所示的SEQ IDNO7中50-644的核苷酸；(3)如SEQ ID NO30所示的SEQ ID NO7中100-644的核苷酸；(4)如SEQ ID NO31所示的SEQ ID NO7中150-644的核苷酸；(5)如SEQ ID NO32所示的SEQ ID NO7中200-644的核苷酸；(6)如SEQ ID NO33所示的SEQ ID NO7中250-644的核苷酸；(7)如SEQ ID NO34所示的SEQ ID NO7中300-644的核苷酸；(8)如SEQ ID NO35所示的SEQ ID NO7中350-644的核苷酸；(9)如SEQ ID NO36所示的SEQ ID NO7中400-644的核苷酸；(10)如SEQ ID NO37所示的SEQ ID NO7中450-644的核苷酸；(11)如SEQ ID NO38所示的SEQ ID NO7中500-644的核苷酸；(12)如SEQ ID NO39所示的SEQ ID NO7中550-644的核苷酸；(13)如SEQ ID NO40所示的SEQ ID NO7中600-644的核苷酸；(14)如SEQ ID NO1所示的SEQ ID NO7中665-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的全长；(15)如SEQ IDNO22所示的SEQ ID NO7中767-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的成熟形式；(16)如SEQ ID NO2所示的SEQID NO7中2,964-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的全长；(17)如SEQ ID NO23所示的SEQ ID NO7中3,072-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的成熟形式；(18)如SEQ ID NO41所示的SEQ ID NO7中2,930-2,963的核苷酸；(19)如SEQ ID NO42所示的SEQ ID NO7中4,401-4,451的核苷酸；(20)如SEQ ID NO43所示的SEQ ID NO7中4,401-4,501的核苷酸；(21)如SEQ ID NO44所示的SEQ ID NO7中4,401-4,551的核苷酸；(22)如SEQ ID NO45所示的SEQ ID NO7中4,401-4,601的核苷酸；(23)如SEQ ID NO46所示的SEQ ID NO7中4,401-4,651的核苷酸；(24)如SEQ ID NO47所示的SEQ ID NO7中4,401-4,701的核苷酸；(25)如SEQ ID NO48所示的SEQ ID NO7中4,401-4,751的核苷酸；(26)如SEQ ID NO49所示的SEQ ID NO7中4,401-4,801的核苷酸；以及(27)如SEQ ID NO50所示的SEQ ID NO7中4,401-4,830的核苷酸。
从ClaI-#69克隆中获得的序列见图10，并命名为SEQ ID NO8。第三个亚基基因全部的编码序列位于1,384-2,304处(SEQ ID NO3)，其中信号序列位于1,384-1,461，且编码SDH第三个亚基成熟蛋白质的序列位于1,462-2,304(SEQ ID NO24)。
这样，本发明的另一个实施方案提供了分离的核酸分子，其衍生于图10中从ClaI-#69克隆中获得的如SEQ ID NO7所示的序列。此类分离的核酸分子包括以下核苷酸(1)如SEQ ID NO51所示的SEQ IDNO8中1-1,383的核苷酸；(2)如SEQ ID NO52所示的SEQ ID NO8中50-1,383的核苷酸；(3)如SEQ ID NO53所示的SEQ ID NO8中100-1,383的核苷酸；(4)如SEQ ID NO54所示的SEQ ID NO8中150-1,383的核苷酸；(5)如SEQ ID NO55所示的SEQ ID NO8中200-1,383的核苷酸；(6)如SEQ ID NO56所示的SEQ ID NO8中250-1,383的核苷酸；(7)如SEQ ID NO57所示的SEQ ID NO8中300-1,383的核苷酸；(8)如SEQ ID NO58所示的SEQ ID NO8中350-1,383的核苷酸；(9)如SEQ ID NO59所示的SEQ ID NO8中400-1,383的核苷酸；(10)如SEQ ID NO60所示的SEQ ID NO8中450-1,383的核苷酸；(11)如SEQ ID NO61所示的SEQ ID NO8中500-1,383的核苷酸；(12)如SEQ ID NO62所示的SEQ ID NO8中550-1,383的核苷酸；(13)如SEQ ID NO63所示的SEQ ID NO8中600-1,383的核苷酸；(14)如SEQ ID NO64所示的SEQ ID NO8中600-1,383的核苷酸；(15)如SEQ ID NO65所示的SEQ ID NO8中650-1,383的核苷酸；(16)如SEQ ID NO66所示的SEQ ID NO8中700-1,383的核苷酸；(17)如SEQ ID NO67所示的SEQ ID NO8中750-1,383的核苷酸；(18)如SEQ ID NO68所示的SEQ ID NO8中800-1,383的核苷酸；(19)如SEQ ID NO69所示的SEQ ID NO8中850-1,383的核苷酸；(20)如SEQ ID NO70所示的SEQ ID NO8中900-1,383的核苷酸；(21)如SEQ ID NO71所示的SEQ ID NO8中950-1,383的核苷酸；(22)如SEQ ID NO72所示的SEQ ID NO8中1,000-1,383的核苷酸；(23)如SEQ ID NO73所示的SEQ ID NO8中1,050-1,383的核苷酸；(24)如SEQ ID NO74所示的SEQ ID NO8中1,100-1,383的核苷酸；(25)如SEQ ID NO75所示的SEQ ID NO8中1,150-1,383的核苷酸；(26)如SEQ ID NO76所示的SEQ ID NO8中1,200-1,383的核苷酸；(27)如SEQ ID NO77所示的SEQ ID NO8中1,250-1,383的核苷酸；(28)如SEQ ID NO78所示的SEQ ID NO8中1,300-1,383的核苷酸；(29)如SEQ ID NO79所示的SEQ ID NO8中1,350-1,383的核苷酸；(30)如SEQ ID NO3所示的SEQ ID NO8中从1,384-1,461的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的全长；(31)如SEQ ID NO24所示的SEQ ID NO8中从1,462-2,304的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的成熟形式；(32)如SEQ ID NO80所示的SEQ ID NO8中2,305-2,355的核苷酸；(33)如SEQ ID NO81所示的SEQ ID NO8中2,305-2,405的核苷酸；(34)如SEQ ID NO82所示的SEQ ID NO8中2,305-2,455的核苷酸；(35)如SEQ ID NO83所示的SEQ ID NO8中2,305-2,505的核苷酸；(32)如SEQ ID NO84所示的SEQ ID NO8中2,305-2,555的核苷酸；(32)如SEQ ID NO85所示的SEQ ID NO8中2,305-2,605的核苷酸；(32)如SEQ ID NO86所示的SEQ ID NO8中2,305-2,655的核苷酸；以及(33)如SEQ ID NO87所示的SEQ ID NO8中2,305-2,700的核苷酸。
本发明也包括重组构建体，其包含上面概述的一个或多个序列。构建体包含载体(如质粒或病毒载体)，其中已正向或反向插入了本发明的序列。在该实施方案的一个优选的方面，构建体进一步包含调节序列，包括例如，与序列有效连接的启动子。大量合适的载体和启动子为本领域技术人员公知并可通过商业购买获得。以实例的方式提供下列载体细菌的-pET(Novagen)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBs、phagescript、psiX174、pBlueScript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；以及真核的pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。这样，可使用这些和任一其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制且能生存。
启动子区可选自使用具有选择性标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体的任一目标基因。两个合适的载体为pKK232-8和pCM7。特定命名的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核的启动子包括CMV立即早期、HSV胸腺嘧啶激酶、早期和晚期SV40、逆病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。本领域一般的技术水平足以选择合适的载体和启动子。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生此处描述之载体的方法，其包含(a)将本发明之分离的核酸分子插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和增殖该载体。
合适宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞，如葡糖杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、醋杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、假葡糖杆菌属(Pseudogluconobacter)、芽胞杆菌属、土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞；真菌和酵母生物，包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)；昆虫细胞，例如果蝇属S2(Drosophila S2)和灰翅夜蛾属Sf9(Spodoptera Sf9)细胞；动物细胞例如CHO、COS和鲍斯黑色素瘤细胞(Bowes melanomacells)；以及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域公知。
4.本发明的多肽本发明提供了本发明之SDH酶的分离的多肽分子。设计用于操纵分离的多肽分子的方法和技术为本领域熟知。例如分离和纯化多肽分子的方法在蛋白质科学最新方法(Current Protocols in Protein Science)，JohnE.Coligan等人Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1997进行了描述，此处对其公开引用以作参考。
更明确地，本发明提供了一些分离的多肽分子，其编码本发明之SDH酶单独的75kDa、50kDa和29kDa亚基蛋白质。为了清楚起见，描述了本发明特定的分离的多肽分子。然后，更加详细地描述了这些分离的多肽分子的特性和表征。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含的多肽序列选自(a)由SEQ ID NO1的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQ IDNO4的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO4多肽序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含的多肽序列选自(a)由SEQ ID NO2的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQ IDNO5的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO5多肽序列的至少约10个氨基酸长。
仍然在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含的多肽序列选自(a)由SEQ ID NO3的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQID NO6的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO6多肽序列的至少约10个氨基酸长。
本发明的其它实施方案包括一种分离的多肽序列，其包含由分离的核酸序列SEQ ID NO7编码的多肽；一种分离的多肽序列，其包含由分离的核酸序列SEQ ID NO8编码的多肽；一种分离的多肽序列，其包含由KCTC保藏号No.0593BP中的DNA克隆编码的多肽；以及一种分离的多肽序列，其包含由KCTC保藏号No.0594BP中的DNA克隆编码的多肽。
此处所用术语“分离的多肽”是指从其天然环境移出的多肽。这样，产生和/或包含在重组的宿主细胞中的多肽被认为是为了本发明目的而分离的。从重组的宿主细胞部分地或基本地纯化的多肽也称为“分离的多肽”。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物、以及原核或真核宿主中通过重组技术产生的产物，其中原核或真核宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的多肽可为糖基化的或非糖基化的，这取决于重组体生产过程中所使用的宿主。此外本发明的多肽也可含有起始的被修饰过的甲硫氨酸残基，在有些情况下这是宿主介导的加工的结果。
本发明的多肽也包括上述多肽的变体。术语“变体”包括自然的等位基因变异的多肽序列，其存在保守的或不保守的氨基酸替换、删除或添加。术语“变体”也包括那些经人工(通过公知的诱变技术或通过化学合成方法)而产生的分离的多肽序列。此类人为的变体包括存在保守的或不保守的氨基酸替换、删除或添加的多肽序列。
本领域技术人员熟知是否某个特定的氨基酸是保守的还是不保守的。保守氨基酸的替换不会显著影响蛋白质的折叠或活性。作为例子，表1列出了保守氨基酸替换的列表。
表1.保守氨基酸的替换
可通过本领域公知的方法鉴定本发明之蛋白质中对功能所必需的氨基酸，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)2441081-1085(1989))。
本发明之分离的多肽分子也包括这样的多肽序列，其与此处描述之分离的多肽分子相比较95％、96％、97％、98％和99％是相同的。计算机程序如BestFit程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin SequenceAnalysis Package)，Unix版本10，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)可用于确定任一特定的多肽分子与此处公开的多肽序列或此处描述的保藏克隆之分离的DNA分子所编码的多肽序列是否至少有95％、96％、97％、98％和99％是相同的。BestFit使用Smith和Waterman的局部同源性算法，应用数学进展2482-489(1981))，以发现两序列间的最佳同源片段。
例如，当计算机对比程序(如BestFit)用于确定与参照多肽序列具95％的同一性时，它是对参照多肽序列之全长来计算同一性百分率，并且允许参照序列之氨基酸总数中有高达5％的同源性差异。这样，所分析的每100个氨基酸中，95％的同一性表示被试序列的每100个氨基酸中，有多达5个氨基酸与参照多肽序列不同。
本发明也包括此处描述的多肽序列片段和分离的多肽分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了至少10个氨基酸长的片段。此类片段的长度用数学易于定义。例如，SEQ ID NO4提供了一种长为754个氨基酸的分离的多肽分子。至少10个氨基酸长的SEQ ID NO4的片段(F4)可定义为F4＝10+X，其中X定义为0或从1至744之间的任一全整数。同样，此处描述的其它分离的多肽分子片段可如下定义对于长为478个氨基酸的SEQ ID NO5，至少10个氨基酸长的SEQ ID NO5的片段(F5)可定义为F5＝10+X，其中X定义为0或从1至468之间的任一全整数。对于长为306个氨基酸的SEQ ID NO6，至少10个氨基酸长的SEQID NO6的片段(F6)可定义为F6＝10+X，其中X定义为0或从1至296之间的任一全整数。
本发明特别优选的实施方案提供了如下的分离的多肽(1)本发明之SDH亚基1的全长多肽，其由分离的核酸分子SEQ ID NO1编码并鉴定为SEQ ID NO4；(2)本发明之SDH亚基2的全长多肽，其由分离的核酸分子SEQ ID NO2编码并鉴定为SEQ ID NO5；(3)本发明之SDH亚基3的全长多肽，其由分离的核酸分子SEQ ID NO3编码并鉴定为SEQ ID NO6；(4)本发明之SDH亚基1多肽的成熟形式，其由分离的核酸分子SEQ ID NO22编码并鉴定为SEQ ID NO25；(5)本发明之SDH亚基2多肽的成熟形式，其由分离的核酸分子SEQ ID NO24编码并鉴定为SEQ ID NO26；以及本发明之SDH亚基3多肽的成熟形式，其由分离的核酸分子SEQ ID NO23编码并鉴定为SEQ ID NO27。
本发明也提供了产生多肽的方法，其包括(a)含有SEQ ID NO2的分离的核酸分子或其变体的宿主细胞的生长；(b)表达由该分离的核酸分子编码的多肽；以及(c)分离该多肽。
在另一个实施方案中，本发明也提供了产生多肽的方法，其包括(a)含有SEQ ID NO1的分离的核酸分子或其变体的宿主细胞的生长；(b)表达由该分离的核酸分子编码的多肽；以及(c)分离该多肽。
本发明提供的另一个过程是为了产生多肽，其包括(a)含有SEQ IDNO3的分离的核酸分子或其变体的宿主细胞的生长；(b)表达由该分离的核酸分子编码的多肽；以及(c)分离该多肽。
合适宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞如葡糖杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌、醋杆菌属、假单胞菌属、假葡糖杆菌属、芽胞杆菌属、土壤杆菌属细胞；真菌和酵母生物包括酵母属、克鲁维酵母属、曲霉属和根霉属；昆虫细胞例如果蝇属S2和灰翅夜蛾属Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS和鲍斯黑色素瘤细胞；以及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域公知。
多肽可以修饰形式表达(如融合蛋白质)并且不仅可包含分泌信号，还可包含额外的异源功能区。例如，额外的氨基酸区(特别是带电荷氨基酸)可加至多肽的N-末端，以提高在纯化过程中，或接下来的处理和贮存过程中多肽在宿主细胞中的稳定性和持久性。肽部分也可加至多肽上以利于纯化。这些区可在多肽的最后制备前去除。向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、提高稳定性以及促进纯化等是本领域熟悉的和常规的技术。
从重组的细胞培养物中，用熟知的方法可回收并纯化本发明的多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，使用高效液相色谱法(“HPLC”)纯化。
5.L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的产生本发明提供了产生L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的方法，它们对维生素C的产生是有用的。
在一个实施方案中，本发明提供了从D-山梨糖醇产生L-山梨糖的方法，其包含(a)用至少一种分离的核苷酸序列转化宿主细胞，其中分离的核苷酸序列选自(i)一种包含SEQ ID NO1多核苷酸序列的多核苷酸；(ii)一种包含SEQ ID NO2多核苷酸序列的多核苷酸；以及(iii)一种包含SEQ ID NO3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了2-酮-L-古洛糖酸的产生方法，其包含(a)用至少一种分离的核苷酸序列转化宿主细胞，其中分离的核苷酸序列选自(i)一种包含SEQ ID NO1多核苷酸序列的多核苷酸；(ii)一种包含SEQ ID NO2多核苷酸序列的多核苷酸；以及(iii)一种包含SEQ ID NO3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
在此处提供的方法中，为产生L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸所使用的作为宿主细胞的合适的细菌为本领域技术人员共知，这些细菌包括，但不限于，大肠杆菌、短杆菌属、棒杆菌属、葡糖杆菌属、醋杆菌属、假单胞菌属和假葡糖杆菌属。
表达本发明之SDH酶的其它宿主细胞包括在美国专利No.5,834,231中鉴定的菌株；氧化葡糖杆菌DSM 4025(美国专利No.4,960,695)；氧化葡糖杆菌TIOO(应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63454-460(1997))；Pseudogluconobacter saccharoketogenes IFO 14464(欧洲专利No.221 707)；Pseudomonas sorbosoxidans(美国专利No.4,933,289)；和液化醋杆菌(Acetobacter liquefaciens)IFO 12258(应用与环境微生物学61413-420(1995))。
在本发明的其它实施方案中，本领域公知的许多发酵技术可应用于本发明之涉及L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的产生的过程中。一般地，L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸可通过发酵方法产生，如分批型发酵或属于补料分批型的发酵。分批型发酵时，在发酵一开始即加入所有的营养物。补料分批或持续补料分批型发酵时，不断向培养物中补充一种或多种营养物，其中营养物从发酵刚好开始时、或在培养物达到了某个时期后、或当培养液中补加的营养物消耗完了时补充。属于补料分批型发酵中的一系列持续分批发酵为反复的补料分批或填充-取出发酵，其在继续供给营养物的同时，于某些时候例如，当发酵罐满了时，取走发酵罐内容物的一部分。发酵以这种方式可持续较长时间。
另一种发酵类型(连续发酵或恒化培养)连续供给完全培养基，同时连续或半连续地取出培养液，以这种方式使发酵罐中液体培养基之体积维持大体上恒定。连续发酵原则上可维持无限长的时间。
分批发酵时，在培养物中必需营养物之一消耗尽之前，或者在发酵条件变得不利(例如pH降至某个抑制微生物生长的值)之前，有机体可生长。补料分批发酵时，通常使用方法来维持有利的生长条件(例如通过使用pH控制)，并且通过向培养物中供给一种或多种营养物以防止这些营养物耗尽。微生物将继续生长，其生长速率用营养补料的速率表示。通常单一的营养物(经常为碳源)会成为对生长的限制。同样的原理适用于连续发酵，通常在培养基补料中一种营养物是限制的，所有其它营养物是过量的。限制的营养物将以很低浓度(往往低得检测不到)存在于培养液中。可使用不同类型的营养物限制。碳源限制是最常用的。其它实例为通过氮源限制、通过氧限制、通过一种特定的营养物如维生素或氨基酸限制(在微生物对这样一个化合物是营养缺陷的情况下)、通过硫磺限制和通过含磷物限制。
合适的追加碳源的阐明性实例包括但不限于其它糖类如葡萄糖、果糖、D-甘露醇、淀粉或淀粉水解物、纤维素水解物以及糖蜜；有机酸如乙酸、丙酸、乳酸、蚁酸、苹果酸、柠檬酸和延胡索酸；以及醇类如丙三醇。
合适的氮源的阐明性实例包括但不限于氨，包括氨气和氨水；无机酸或有机酸的胺盐，如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和醋酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐，以及其它含氮物质，包括纯的或粗制备之氨基酸、肉膏、蛋白胨、鱼粉、鱼水解物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母馏出物、大豆粉、棉籽粉等。
合适的无机盐的阐明性实例包括但不限于钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、锰盐、钴盐、锌盐、铜盐以及其它超微量元素的盐和磷酸盐。
合适的痕量营养物、生长因子等的阐明性实例包括，但不限于辅酶A、泛酸、生物素、硫胺素、核黄素、盐酸吖啶黄单核苷酸、盐酸吖啶黄腺嘌呤二核苷酸、其它的维生素、氨基酸(如半胱氨酸)、硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸、烟酰胺等，它们以纯的或部分纯化的化学化合物，或者于天然物质中存在。本发明之微生物菌株的培养可使用任一本领域技术人员公知的浸没发酵技术(如气升式发酵)、传统的喷射搅拌设计或者振摇培养来进行。
所使用的培养条件(包括温度、pH、通气速率、搅拌速率、培养持续时间等)可通过一个本领域技术人员靠经验决定，以使L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的产量最高。特定培养条件的选择取决于以下因素，如使用特定发明的微生物菌株、培养基组成和类型、培养技术以及类似考虑。
合适的回收2-KLG的方法之阐明性实例在美国专利Nos.5,474,924；5,312,741；4,960,695；4,935,359；4,877,735；4,933,289；4,892,823；3,043,749；3,912,592；3,907,639和3,234,105中描述。
根据上述方法之一，首先通过公知的方法(如离心或过滤)从培养液中去除微生物，并且将所得的溶液真空浓缩。然后通过过滤获得结晶的2-KGL，并且如果希望的话，通过重结晶纯化。同样地，2-KGL可通过公知的方法获得，如离子交换树脂、溶剂提取、沉淀、盐析等方法。
当2-KGL以游离酸形式获得时，可使用传统方法如所希望地将其转换为盐，与钠、钾、钙、氨或类似阳离子形成的盐。另外，当2-KGL以盐的形式回收时，可使用传统方法将它转换为其游离形式或转换为其它盐。
此处引用的所有专利和出版物作为参考。现在已总体上描述了本发明，通过参考下列以例证方式提供的实施例，本发明将更易理解，并且除非特别说明，它们不用于限制本发明。
实施例实施例1从弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111分离并表征SDH给出了从弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111纯化本发明之吡咯并喹啉醌(PQQ)-依赖的SDH的改良方法。相对于最初的纯化方案(Choi，E.S.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报，12545(1995))，改进涉及到对亚基的分辨率变大以及酶活性的稳定性提高。
步骤1弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111的培养将弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111接种于5ml SYP培养基(5％D-山梨糖醇、1％Bacto蛋白胨和0.5％酵母提取物)并且于30℃培养20小时。取1毫升(ml)此培养物，转移至500ml烧瓶中的50ml同样的培养基中，于旋转式摇瓶机上30℃培养20小时(180转/分钟)。这样制备的培养物用作5L罐式发酵器的接种物，其中含有3L同样的培养基，将这3L培养物生长至早期稳定期。
步骤2膜级分的制备于12,000g离心10分钟收获细胞，用10mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)洗一次，并且在珠搅拌器(Edmund Buhler，Vi4)中用玻璃珠(直径为0.1mm)于4℃破碎90秒。如此制备的匀浆物于12,000g离心5分钟，以去除细胞碎片和玻璃珠。所得到的上清于100,000g离心60分钟，可获得沉淀形式的粗膜级分。
步骤3从膜级分中溶解SDH以40mg蛋白质/ml 1.5％正辛基葡糖苷重悬并溶解粗膜级分，于4℃搅拌2小时。所得的悬液于12,000g离心10分钟，给出上清，称之为溶解的SDH级分。在纯化过程中使用的所有溶液包含0.75％正辛基葡糖苷。
步骤4酶活性测定以二氯酚靛酚(DCIP)作为人工电子受体，并以吩嗪硫酸甲酯(PMS)作为电子传递体，用分光光度法测定酶活性。反应混合物含有50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)、10mM MgCl2、5mM CaCl2、5mM KCN、0.1mMPMS、0.12mM DCIP、250mM D-山梨糖醇、0.75％n-辛基葡糖苷和酶溶液，总体积为1.0ml。使用pH5.0时DCIP的摩尔消光系数ε＝5,600cm-1M-1。酶活性的一个单位定义为每分钟酶催化减少1μmol DCIP的量。
也可用Ferric-Dupanol法(Wood，W.A.等人，酶学方法，5287(1962))测定实施例1步骤6描述的重建亚基的酶活性。单一的或者不同组合的亚基蛋白质于25℃预温育5分钟。加入10mM(终浓度)高铁氰化钾和250mM(终浓度)D-山梨糖醇开始反应。一段合适的时间后，加入硫酸铁-月桂硫酸钠溶液(Fe2(SO4)3·nH2O 5g/L、月桂硫酸钠3g/L和85％的磷酸95ml/L)终止反应，并且用分光光度计于660nm处测定普鲁士色的吸收。
步骤5离子-交换层析法溶解的级分上样于经10mM醋酸钠(pH5.0)平衡过的CM-TSK 650(S)(Merck)柱(2.5×20cm)。用醋酸钠线性梯度(从10mM至500mM)洗脱CM-TSK柱。合并活性级分并用膜滤器(Amicon，YM10)超滤浓缩，然后上样于DEAE-TSK650(S)(Merck)柱(2.5×20cm)。DEAE-TSK柱用pH5.0或pH6.0的10mM醋酸钠(pH5.0)无梯度洗脱。
如图1所示，于pH6.0洗脱时(图1-B)，活性峰的分辨率远高于pH5.0的洗脱(图1-A)，且酶活性峰I和II完全分开。洗脱后立即测量级分的酶活性，以及洗脱后1小时测量级分的酶活性，发现pH5.0时一同洗脱下来的峰I和II级分的酶活性随着时间的变化没有明显的不同。然而对于pH6.0时分别洗脱下来的峰I和II级分，峰I的酶活性在洗脱后1小时内降至小于最初值的十分之一，而峰II的酶活性仍然不变。
SDS-PAGE(Laemmli，U.K.，自然(nature)，227，680(1970))分析DEAE-TSK柱于pH6.0时洗脱下来的包含峰I和II的级分(图2)。图2-A显示峰I的级分。列M显示标准的分子量标记。如列1至4所示，可观察到75kDa的第一个亚基条带和50kDa的第二个亚基条带，但没有观察到29kDa的第三个亚基条带。在这种条件下，洗脱后1小时，酶活性减少十倍多。图2-B显示峰II的级分。列M显示标准的分子量标记。如列5至8所示，可观察到峰II级分除了包含75kDa和50kDa的亚基外，还包含29kDa的第三个亚基条带。该观察表明29kDa的第三个亚基可能在SDH的稳定性方面起着重要作用。
步骤6用不同亚基重建SDH因为在DEAE柱层析中，将洗脱缓冲液的pH从5.0增加至6.0可提高层析峰的分辨率，故将洗脱缓冲液的pH进一步增至6.5。如实施例1步骤5所述的、经CM-TSK 650(S)柱层析得到的、部分纯化SDH上样于用20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)预平衡的DEAE-TSK 650(S)柱(2.5×16.5cm)，并且用180ml同一缓冲液无梯度洗脱，然后用20mM和500mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)各160ml进行梯度洗脱。SDS-PAGE分析柱级分。
如图3所示，在无梯度洗脱过程中，75kDa的第一个亚基最先洗脱(峰I)，然后是29kDa的第三个亚基(峰II)，并且在梯度洗脱过程中，50kDa的第二个亚基稍后洗脱(峰III)。如图4所示，这三个峰的SDS-PAGE分析表明这三个亚基基本上是纯的，并且相互间完全分开。
由于在非变性条件下，三个亚基可被纯化并分离为单一的种类，故进行了重建实验以确定每个亚基在SDH酶催化活性中的作用。将pH6.5时从DEAE柱洗脱的每个亚基约100pmol，或单独或以不同组合预孵育，用实施例1步骤4描述的Ferric-Dupanol法测定酶活性(表2)。单独的每个亚基显示极低水平的酶活性。当第一个亚基和第二个亚基重建时，与单独的第一个亚基相比较，酶活性提高了2倍。向第一个亚基中以及第一个和第二个亚基的混合物中加入第三个亚基时，酶活性分别提高了30倍和20倍，这些结果表明第三个亚基对SDH的催化活性及该酶的稳定性起着重要作用。
表2
实施例2SDH亚基N-末端氨基酸序列的测定对实施例1制备的纯化SDH进行SDS-PAGE(12.5％凝胶)，并将分离的蛋白质电印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bollag，D.M.和Edelstein，S.J.，蛋白质方法(Protein Methods)，Wiley-Liss，Inc.，8(1991))。丽春红S染色观察后，将含有每个SDH亚基的膜部分切成片，并且每个亚基的膜片直接用氨基酸序列分析仪(Applied Biosystems，Model 477A)分析N-末端氨基酸序列。
表3显示了所得到的第一个和第三个亚基的数据(SEQ ID Nos9和11)。没有得到第二个亚基的N-末端氨基酸序列，很可能因为存在封闭的N-末端。封闭的N-末端的类似发现已有报道，其为另一个醋酸菌Acetobacter pasteurianus(Takemura，H.等人细菌学杂志(J.Bacteriol.)，175，21，6857(1993))的乙醇脱氢酶复合体之细胞色素c亚基，其中将N-末端的封闭归因于N-末端谷氨酸残基被修饰为焦谷氨酸残基，在对N-末端氨基酸测序时后者抗Edman降解。
因此，为了得到纯化的SDH之第二个亚基的N-末端序列，对分离的SDH蛋白质首先用焦谷氨酸氨肽酶处理，以释放出潜在的被封闭N-末端。简而言之，将实施例1纯化的SDH约50pg溶解于消化缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液、10mM EDTA、5mM二硫苏糖醇和5％(v/v)甘油，pH8.0)，并与3.75g焦谷氨酸氨肽酶(Boehringer Mannheim)4℃温育18小时，然后于25℃额外温育4小时。温育后，将反应混合物进行SDS-PAGE，电印迹至PDVF膜，并切下膜上的第二个亚基条带，然后如上所述分析N-末端氨基酸序列。在表3中SEQ ID NO10显示了N-末端氨基酸序列的10个残基。
表3
实施例3第三个亚基内部氨基酸序列的测定对于第三个亚基，除测定了其N-末端氨基酸序列外，还测定其内部氨基酸序列，以促进相应基因的克隆。按以前所述方法(Matsudaira，P.T.，实用微测序蛋白质和肽纯化指导(A Practical Guide to Protein and PeptPurification for Microsequencing)，学术出版社(Academic Press)p.37(1989))，将如实施例1步骤6所述分离的约7μg第三个亚基用胰蛋白酶(Boehringer Mannheim)消化，。用Brownlee SPHERI-5 RP 18柱(0.2×22cm)通过HPLC分离胰蛋白酶消化物，并将该柱用15-70％乙腈以210微升/分钟进行60分钟的线性梯度洗脱。214nm处监测洗脱物，并收集分离得好的三个肽峰(图5中表示为1、5和7)并且如(实施例2)所述分析它们的氨基酸序列。表4中，峰1、5和7的内部氨基酸序列显示如下(分别为SEQ ID NO12、13和14)。
表4
实施例4含有SDH基因之一部分的1.53kb DNA片段的引物设计和分离根据第一个亚基的N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO9)，合成两条简并引物，引物1(5’-CCGGAATTCGAA(G)GAT(C)ACIGGIACIGC-3’)(SEQ ID NO15)和引物2(5’-ATT(C，A)ACIAAT(C)GCIGAT(C)CAA(G)CAT(C)CC-3’)(SEQ ID NO16)。
用Takeda和Shimizu法(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))分离的弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111基因组DNA用BamHI部分消化。质粒pBluescript SK(Stratagene)用NaeI和BamHI限制性酶切，并将基因组DNA的BamHI部分消化产物连接至质粒的BamHI位点。
按照单特异引物PCR(SSP-PCR)法(White，B.，SSP-PCR和基因组步移(SSP-PCR and genome walking)，《分子生物学方法，PCR法》(Method in Mol.Biol.，PCR protocols)，Humana Press，15339(1993))进行30个循环的聚合酶链反应(PCR)，以分离大小为1.53kb的克隆(#SDH2-1)。
如上制备的连接反应混合物用基因特异性引物(引物1)和T7引物扩增。虽然属的T7引物可与所有被连接片段的末端退火，而所得的产物只呈线性增长。但是，将基因特异性引物1和T7引物与特异性产物同时退火会导致特异性一级产物呈指数扩增。用巢式引物(基因特异性引物2)和T7引物进行二级PCR可产生特异性二级产物，其进一步证实了一级PCR的特异性。
将PCR产物连接至质粒pT7 Blue(Novagen)，并且用SEM法(Inoue，H.等人，基因，9623(1990))转化大肠杆菌DH5α。于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中(1％Bacto-Tryptone、0.5％酵母提取物和1％NaCl)培养转化子。然后，用碱裂解法提取质粒(Sambrook，J.等人，分子克隆，CSH Press，p.125(1988))。
以这个质粒作为模板，用引物1或者引物2与T7引物进行PCR，产生阳性反应。#SDH2-1片段的部分核苷酸测序进一步证实了引物1结合位点下游推导出的氨基酸序列与实验测定的N-末端氨基酸序列相匹配。但#SDH2-1只包含第一个亚基基因的一部分。
实施例5以1.53kb DNA片段作为探针，分离包含SDH亚基基因的λGEM5-1克隆用DIG标记和检测试剂盒Kit(使用DIG系统进行滤膜杂交的用户指南(The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization)，p.6-9，Boehringer Mannheim(1993))标记实施例4分离的#SDH2-1。
为了构建弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111的基因组DNA文库，将按照实施例4所述方法从弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111分离的基因组DNA用Sau3A I部分消化。部分消化的DNA于0.8％的琼脂糖凝胶电泳，用QLAEXII Gel提取试剂盒(QIAGEN)洗脱大小在15至23kb的DNA。然后，将洗脱的DNA连接至λGEM-11载体(Promega)的BamHI位点。根据指导手册，用Packagene体外包装体系(Promega)将连接混合物包装入噬菌体λ颗粒。大肠杆菌LE392细胞30℃生长于含0.2％麦芽糖和10mM MgSO4的TB培养基(1％Bacto-Tryptone和0.5％NaCl)中，当OD600达到0.6后存贮在4℃。将包装混合物加入细胞悬液，并将该混合物于37℃温育30分钟，以引起感染。向这个混合物中加入3ml融化的(45℃)TB顶层琼脂(在含10mM MgSO4的TI3培养基中有0.8％Bacto-Agar)，轻轻涡旋并立即倒于LB平板上。平板于37℃倒置温育过夜。
将λ噬菌斑固定于尼龙膜(Amersham)，并用预杂交液(5×SSC，1％(w/v)封闭试剂、0.1％N-十二烷基肌氨酸、0.02％SDS和50％(v/v)甲酰胺)在杂交炉中(Hybaid)对膜进行预杂交，42℃，3小时。然后用杂交液(用预杂交液稀释的、DIG-标记的#SDH2-1探针)进行膜杂交，42℃，16小时。通过DIG-标记的#SDH2-1探针的噬菌斑杂交(使用DIG系统进行滤膜杂交的用户指南。Boehringer Mannheim(1993))，在约20,000个λ噬菌体的噬菌斑中有11个噬菌斑给出阳性信号。
从阳性λ克隆分离λDNAs，并用λDNA纯化试剂盒(Stratagene)纯化。分离的λDNAs用BamHI消化，并进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。将凝胶上分离的DNA片段转移至尼龙膜，并如上述同样的条件下，用#SDH2-1作为探针，再次进行Southern杂交分析。选择了一个给出阳性信号的克隆，并用XhoI从克隆中切下15kb的插入DNA，然后将其克隆入pBluescript SK的XhoI位点，得到λGEM5-1。用一些不同的限制性酶消化，绘制λGEM5-1克隆的图谱。
实施例6λGEM5-1克隆中5.7kb PstI片段核苷酸序列的测定实施例5获得的阳性克隆，λGEM5-1，用一些不同的限制性酶消化，绘制图谱，并且如实施例5所述进行Southern杂交分析。一个与#SDH2-1杂交的5.7kb PstI片段被亚克隆，并且测定了其核苷酸序列。为了使DNA测序简单化，用限制性酶组KpnI-PstI、NotI-SacII和PstII-SacI分别构建了三个重叠的亚克隆S1、S2和S3，如图7所示。用ExoIII-Mungbean缺失试验盒(Stratagene)对每一个亚克隆制备了一系列的删除克隆。用染料末端终止循环测序方便反应试剂盒(AppliedBiosystems)进行核苷酸测序反应，并于自动的DNA测序仪(AppliedBiosystems，Model 373A)测定序列。
图8显示了5.7kb PstI片段中4,830bp的核苷酸序列(SEQ IDNO7)。测序的DNA包含两个开放读码框(ORFs)，分别具有2,265个核苷酸和1,437个核苷酸。第一个ORF编码第一个亚基。第一个亚基基因前为SD序列，“AGGA”位于651-654bp。第一个亚基的34个氨基酸信号序列位于SEQ ID NO7的665-766bp。第一个亚基蛋白质成熟部分的编码序列位于SEQ ID NO7的767-2,929bp，其编码720个氨基酸的多肽，推导出的N-末端氨基酸序列与通过N-末端氨基酸序列分析而得到的15个氨基酸残基正好一致。
第二个ORF接在第一个ORF后，这两个ORF被一个短的基因间隔区隔开。第二个ORF编码第二个亚基。第二个亚基基因的SD序列(AGGA)位于SEQ ID NO7的2,950-2,953bp，并且结构基因位于SEQID NO7的2,964-4,400bp。第二个亚基基因编码478个氨基酸的多肽，其中包括36个氨基酸的信号序列。推导出的成熟多肽的氨基酸序列与将样品用焦谷氨酸氨肽酶处理后通过实验所获得的序列完全匹配。第二个亚基基因终止密码子的下游发现了反转重复序列。
第一个和第二个亚基成熟蛋白质的计算分子量分别为79kDa和48kDa，其分别与SDS-PAGE测定的实验值75kDa和50kDa相一致。
此外，也发现了出现在第一个亚基中的特征PQQ-结合序列，共有序列表征性地出现在PQQ-依赖的脱氢酶的氨基和羧基末端。表5中，存在于氨基末端部分的特征PQQ-结合序列显示为SEQ ID NO17，存在于羧基末端部分的特征序列显示为SEQ ID NO18(此处，X表示任意氨基酸)。氨基末端特征序列位于812-898bp，羧基末端序列位于1,490-1,555bp。这些数据提供了额外证据证明第一个亚基包含作为辅因子的吡咯并喹啉醌(PQQ)。
表5
此外，也发现了位于第一个亚基基因的2,612-2,626bp处一个单一的血红素结合序列(下表6的SEQ ID NO19)，以及位于第二个亚基基因中的三个血红素结合序列，位于以下位置3,129-3,143；3,573-3,587和3,981-3,995bp(此处，XA表示任意氨基酸，XB表示任意不同于XA的氨基酸)。
表6
同源序列的数据库检索确定了第一个亚基基因的DNA序列与许多包含辅因子吡咯并喹啉醌(PQQ)的脱氢酶具很大程度的相似性特别是，Acetobacter polyoxogenes的乙醇脱氢酶(Tamaki，T.等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)，1088，292(1991))和Acetobacteraceti的乙醇脱氢酶(Inoue，T.等人，细菌学杂志，171，3115(1989))与第一个亚基分别有77％和70％相同。第二个亚基基因的数据库检索提供了它与弱氧化葡糖杆菌IFO12528(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))的细胞色素c具最大程度的相似性，匹配的核苷酸序列的同一性为83％，氨基酸序列的同一性为88％。
实施例7320bp DNA片段的引物设计和PCR克隆，该片段包含第三个亚基基因的一部分实施例6所述的第一个和第二个亚基基因的核苷酸序列分析表明分离的操纵子克隆不包含第三个亚基基因。进一步对5’和3’侧翼区测序也未能显示第三个亚基的存在。因此，为了分离编码第三个亚基的基因，基于氨基酸序列信息合成简并引物，以通过PCR产生一段用作探针的短DNA片段，其包含第三个亚基基因的一部分。
基于实施例2获得的第三个亚基成熟蛋白质之N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO11)以及实施例3获得的胰蛋白酶消化肽的内部氨基酸序列之一(SEQ ID NO13)，分别合成两条简并引物，引物3(5’-GGGAATTCTTT(C)CAA(G)GAA(G)ATGAAT(C)AA-3’)(SEQ IDNO20)和引物4(5’-GGGAATTCTTGAAA(G)CC NGC A(G)TCA(G)TA-3’)(SEQ ID NO21)。
用Takeda和Shimizu法(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))制备的弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111基因组DNA作为模板，用引物3和4进行PCR反应。反应产生了一条320bp的DNA片段。将该320bp PCR产物连接至pBluescript SK(Stratagene)，并且用SEM法(Inoue，H.等人，基因(Gene)，9623(1990))转化大肠杆菌DH5α。于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养转化子。然后，用碱裂解法提取质粒(Sambrook，J.等人，分子克隆，CSH Press，p.125(1988))。以这个质粒DNA作为模板，用引物3和引物4进行PCR反应确证亚克隆。320bp片段的部分核苷酸测序进一步证实了引物3结合位点下游推导出的氨基酸序列与实验测定的N-末端氨基酸序列相匹配。但320bp片段只包含第三个亚基基因的N-末端部分。
实施例8以320bp DNA片段作为探针，分离第三个亚基基因用DIG标记和检测试剂盒(使用DIG系统进行滤膜杂交的用户指南，p.6-9，Boehringer Mannheim(1993))标记(实施例7)分离的320bp DNA片段。对Takeda和Shimizu法(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))分离的弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111基因组DNA用BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、PstI或XhoI消化，0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并如所述(Southern，E.M.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)98,503(1975))转移至尼龙膜(NYTRAN，Schleicher & Schuell)。用预杂交液(5×SSC，1％(w/v)封闭试剂、0.1％N-十二烷基肌氨酸、0.2％SDS和50％(v/v)甲酰胺)在杂交炉中(Hybaid)对膜进行预杂交，42℃，2小时。然后用杂交液(用预杂交液稀释的、DIG-标记的探针)进行膜杂交，42℃，12小时。对所用的每一个酶Southern杂交均给出强的分散信号。洗脱对应于阳性信号的、位于4.5kb ClaI处的DNA，并克隆于pBlueseript SK，以构建一个小文库。如上所述通过重复Southern杂交筛选该小文库，以得到阳性克隆。选择一个给出了阳性信号的克隆并指定为ClaI-#69。图9表示ClaI-#69的限制性酶图谱。
实施例9包含第三个亚基的4.5kb ClaI片段之核苷酸序列分析测定并分析了在4.5kb ClaI-#69克隆的中第三个亚基基因的核苷酸序列。为了使DNA测序简单化，对一些重叠的限制性片段亚克隆，并测定了每一个克隆的核苷酸序列。用染料末端终止循环测序方便反应试剂盒(Applied Biosystems)进行核苷酸测序反应，并于自动的DNA测序仪(Applied Biosystems，Model 373A)测定序列。
图10显示了4.5kb ClaI片段中2700bp的核苷酸序列(SEQ IDNO8)。所测序的DNA中包含一个具有921个核苷酸的开放读码框(ORF)，其编码第三个亚基多肽。第三个亚基基因前为潜在的SD序列(AGG)，其位于1,375-1,377bp。第三个亚基多肽的氨基酸信号序列位于1,384-1,461bp。第三个亚基蛋白质成熟部分的编码序列位于1,462-2,304bp，其编码一个具有280个氨基酸的多肽，所推导出的N-末端氨基酸序列与通过N-末端氨基酸序列分析而得到的25个氨基酸残基正好一致。第三个亚基成熟蛋白质的计算分子量为29,552Da，其与SDS-PAGE测定的实验值29kDa相一致。
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
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INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
PCT/IB 99/00736
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
序列表<110>Choi，Eui-SungRhee，Sang-KiLee，Eun-Hae<120>弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶基因及其使用方法<130>1533.087CN00<140><141><150>PCT/IB99/00736<151>1999-04-23<160>87<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2265<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>1atggtttctg gtctactgac gccgatcaac gttacgaaga agcgccttct gggttgcgct 60gctgctctgg cattctgcgc cacctctcct gtcgccctgg ctgaggacac aggaacagcc 120attacaaacg ccgaccagca tccgggtgac tggatgagct atggccggac ctattccgag 180cagcgctaca gcccgctgga tcagatcacc aaggacaatg cgagcaatct gaagctggca 240tggcactacg atctggatac caaccgtggt caggaaggta cgccgctgat cgttgatggc 300gtcatgtacg ccaccacaaa ctggagcaag atgaaggctc tggatgcagc tacgggcaag 360ctgctgtggt cttacgatcc aaaggttcca ggcaacatcg ccgaccgcgg ctgctgcgat 420acggtcaacc gtggtgcagc ctactggaac ggcaaagtct atttcggcac cttcgacggt 480cgcctgattg ccctggatgc caagaccggc aagctggtct ggagcgtcta tacggttccc 540aaggaagcgc agctgggtca ccagcgctcc tacacggttg acggtgctcc ccgtatcgcc 600aagggcaagg tcatcatcgg caacggcggt gcagagttcg gcgcccgtgg cttcgtgacg 660gcgtatgacg ctgaaacggg aaagatggac 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1.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO1的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO1多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO4的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码为SEQ ID NO4氨基酸序列的至少约10个氨基酸长的片段。
2.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 1中分离的核酸分子相同。
3.一种含有权利要求1的核酸之载体。
4.一种产生权利要求3的载体的方法，其包含(a)将权利要求1的多核苷酸插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
5.一种包含权利要求3的载体之宿主细胞。
6.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO2的多核苷酸，或其片段；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO2多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO5的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码为SEQ ID NO5氨基酸序列的至少约10个氨基酸长的片段。
7.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 6中分离的核酸分子相同。
8.一种含有权利要求6的核酸之载体。
9.一种产生权利要求8的载体的方法，其包含(a)将权利要求6的多核苷酸插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
10.一种包含权利要求8的载体之宿主细胞。
11.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO3多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO6的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码为SEQ ID NO6氨基酸序列的至少约10个氨基酸长的片段。
12.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与权利要求11中分离的核酸分子相同。
13.一种含有权利要求11的核酸之载体。
14.一种产生权利要求13的载体的方法，其包含(a)将权利要求11的多核苷酸插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和增殖该载体。
15.一种包含权利要求13的载体之宿主细胞。
16.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO7的多核苷酸，以及；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO7多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
17.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 16中分离的核酸分子相同。
18.一种含有权利要求16的核酸之载体。
19.一种产生权利要求18的载体的方法，其包含(a)将权利要求16的多核苷酸插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求18的载体。
21.权利要求16的核酸分子，其中该多核苷酸具有KCTC保藏号No.0593BP中包含的DNA克隆之完整核苷酸序列。
22.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO8的多核苷酸，以及；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO8多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
23.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 22中分离的核酸分子相同。
24.一种含有权利要求22的核酸之载体。
25.一种产生权利要求24的载体的方法，其包含(a)将权利要求22的多核苷酸插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
26.一种包含权利要求24的载体之宿主细胞。
27.权利要求22的核酸分子，其中该多核苷酸具有KCTC保藏号No.0594BP中包含的DNA克隆之完整核苷酸序列。
28.一种从D-山梨糖醇生产L-山梨糖的方法，其包括(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自(b)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO1的多核苷酸序列；(c)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO2的多核苷酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO3的多核苷酸序列；以及(e)筛选和增殖该转化的宿主细胞。
29.权利要求28的方法，其中该宿主细胞为葡糖杆菌属。
30.一种分离的多肽，其包含选自如下的多肽序列(a)由SEQ ID NO3的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQ ID NO6的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO6多肽序列的至少约10个氨基酸长。
31.一种产生多肽的方法，其包括(a)生长权利要求15的宿主细胞。(b)表达权利要求29的多肽；以及(c)分离该多肽。
32.一种增加2-酮-L-古洛糖酸产量的方法，其包括(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自(b)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO1的多核苷酸序列；(c)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO2的多核苷酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO3的多核苷酸序列；以及(e)筛选和增殖该转化的宿主细胞。
33.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)如SEQ ID NO28所示的SEQ ID NO7中1-644的核苷酸；(b)如SEQ ID NO29所示的SEQ ID NO7中50-644的核苷酸；(c)如SEQ ID NO30所示的SEQ ID NO7中100-644的核苷酸；(d)如SEQ ID NO31所示的SEQ ID NO7中150-644的核苷酸；(e)如SEQ ID NO32所示的SEQ ID NO7中200-644的核苷酸；(f)如SEQ ID NO33所示的SEQ ID NO7中250-644的核苷酸；(g)如SEQ ID NO34所示的SEQ ID NO7中300-644的核苷酸；(h)如SEQ ID NO35所示的SEQ ID NO7中350-644的核苷酸；(i)如SEQ ID NO36所示的SEQ ID NO7中400-644的核苷酸；(j)如SEQ ID NO37所示的SEQ ID NO7中450-644的核苷酸；(k)如SEQ ID NO38所示的SEQ ID NO7中500-644的核苷酸；(l)如SEQ ID NO39所示的SEQ ID NO7中550-644的核苷酸；(m)如SEQ ID NO40所示的SEQ ID NO7中600-644的核苷酸；(n)如SEQ ID NO1所示的SEQ ID NO7中665-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的全长；(o)如SEQ ID NO22所示的SEQ ID NO7中767-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的成熟形式；(p)如SEQ ID NO41所示的SEQ ID NO7中2,930-2,963的核苷酸；(q)如SEQ ID NO2所示的SEQ ID NO7中2,964-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的全长；(r)如SEQ ID NO23所示的SEQ ID NO7中3,072-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的成熟形式；(s)如SEQ ID NO42所示的SEQ ID NO7中4,401-4,451的核苷酸；(t)如SEQ ID NO43所示的SEQ ID NO7中4,401-4,501的核苷酸；(u)如SEQ ID NO44所示的SEQ ID NO7中4,401-4,551的核苷酸；(v)如SEQ ID NO45所示的SEQ ID NO7中4,401-4,601的核苷酸；(w)如SEQ ID NO46所示的SEQ ID NO7中4,401-4,651的核苷酸；(x)如SEQ ID NO47所示的SEQ ID NO7中4,401-4,701的核苷酸；(y)如SEQ ID NO48所示的SEQ ID NO7中4,401-4,751的核苷酸；(z)如SEQ ID NO49所示的SEQ ID NO7中4,401-4,801的核苷酸；以及(aa)如SEQ ID NO50所示的SEQ ID NO7中4,401-4,830的核苷酸。
34.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列(a)如SEQ ID NO51所示的SEQ ID NO8中1-1,383的核苷酸；(b)如SEQ ID NO52所示的SEQ ID NO8中50-1,383的核苷酸；(c)如SEQ ID NO53所示的SEQ ID NO8中100-1,383的核苷酸；(d)如SEQ ID NO54所示的SEQ ID NO8中150-1,383的核苷酸；(e)如SEQ ID NO55所示的SEQ ID NO8中200-1,383的核苷酸；(f)如SEQ ID NO56所示的SEQ ID NO8中250-1,383的核苷酸；(g)如SEQ ID NO57所示的SEQ ID NO8中300-1,383的核苷酸；(h)如SEQ ID NO58所示的SEQ ID NO8中350-1,383的核苷酸；(i)如SEQ ID NO59所示的SEQ ID NO8中400-1,383的核苷酸；(j)如SEQ ID NO60所示的SEQ ID NO8中450-1,383的核苷酸；(k)如SEQ ID NO61所示的SEQ ID NO8中500-1,383的核苷酸；(l)如SEQ ID NO62所示的SEQ ID NO8中550-1,383的核苷酸；(m)如SEQ ID NO63所示的SEQ ID NO8中600-1,383的核苷酸；(n)如SEQ ID NO64所示的SEQ ID NO8中600-1,383的核苷酸；(o)如SEQ ID NO65所示的SEQ ID NO8中650-1,383的核苷酸；(p)如SEQ ID NO66所示的SEQ ID NO8中700-1,383的核苷酸；(q)如SEQ ID NO67所示的SEQ ID NO8中750-1,383的核苷酸；(r)如SEQ ID NO68所示的SEQ ID NO8中800-1,383的核苷酸；(s)如SEQ ID NO69所示的SEQ ID NO8中850-1,383的核苷酸；(t)如SEQ ID NO70所示的SEQ ID NO8中900-1,383的核苷酸；(u)如SEQ ID NO71所示的SEQ ID NO8中950-1,383的核苷酸；(v)如SEQ ID NO72所示的SEQ ID NO8中1,000-1,383的核苷酸；(w)如SEQ ID NO73所示的SEQ ID NO8中1,050-1,383的核苷酸；(x)如SEQ ID NO74所示的SEQ ID NO8中1,100-1,383的核苷酸；(y)如SEQ ID NO75所示的SEQ ID NO8中1,150-1,383的核苷酸；(z)如SEQ ID NO76所示的SEQ ID NO8中1,200-1,383的核苷酸；(aa)如SEQ ID NO77所示的SEQ ID NO8中1,250-1,383的核苷酸；(bb)如SEQ ID NO78所示的SEQ ID NO8中1,300-1,383的核苷酸；(cc)如SEQ ID NO79所示的SEQ ID NO8中1,350-1,383的核苷酸；(dd)如SEQ ID NO3所示的SEQ ID NO8中从核苷酸1,384-1,461的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的全长；(ee)如SEQ ID NO24所示的SEQ ID NO8中从核苷酸1,462-2,304的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的成熟形式；(ff)如SEQ ID NO80所示的SEQ ID NO8中2,305-2,355的核苷酸；(gg)如SEQ ID NO81所示的SEQ ID NO8中2,305-2,405的核苷酸；(hh)如SEQ ID NO82所示的SEQ ID NO8中2,305-2,455的核苷酸；(ii)如SEQ ID NO82所示的SEQ ID NO8中2,305-2,505的核苷酸；(jj)如SEQ ID NO83所示的SEQ ID NO8中2,305-2,555的核苷酸；(kk)如SEQ ID NO85所示的SEQ ID NO8中2,305-2,605的核苷酸；(ll)如SEQ ID NO86所示的SEQ ID NO8中2,305-2,655的核苷酸；以及(mm)如SEQ ID NO87所示的SEQ ID NO8中2,305-2,700的核苷酸。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、细菌学和工业发酵领域。更明确地说,本发明提供了分离的核酸分子以及含有该分离的核酸分子的载体和宿主细胞,其中分离的核酸分子编码本发明之新的、膜结合的、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)山梨糖醇脱氢酶(SDH)的三个亚基。本发明进一步提供了本发明之SDH酶的三个亚基的分离多肽,并且提供了产生L－山梨糖和2－酮－L－古洛糖酸的方法。
文档编号C12N9/04GK1354794SQ99816659
公开日2002年6月19日 申请日期1999年4月23日 优先权日1999年4月22日
发明者E－S·车, S－K·任, E－H·李 申请人:韩国生物科学和生物工艺学研究院, 科米技术公司, 阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司