海藻糖合酶蛋白质、基因、质粒、微生物和生产海藻糖的方法

专利名称：海藻糖合酶蛋白质、基因、质粒、微生物和生产海藻糖的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及生产海藻糖的微生物和生产海藻糖的方法。本发明还涉及新的海藻糖合酶蛋白质、海藻糖合酶基因、携带所述海藻糖合酶基因的重组质粒以及用所述重组质粒转化的微生物。
现有技术描述海藻糖是一种非还原性二糖，是由α-1，1键相连的二糖α-D-吡喃葡萄糖苷基-α-D-吡喃葡萄糖苷。海藻糖在医药、食品和化妆品领域有广泛的应用。但是，由于迄今为止其生产不足且昂贵，所以海藻糖的应用受到很大的限制。
日本特许公开专利Hei5-91890和Hei6-145186公开从酵母中提取海藻糖的方法。有数种方法可用于从发酵的微生物培养物，例如节杆菌属(T.Suzuki，Agric.Biol.Chem.，33(2)，1969)、诺卡菌属(日本特许公开专利Sho50-154485)、微球菌属(日本特许公开专利Hei6-319578)、氨基酸发酵性酵母、短杆菌属(日本特许公开专利Hei5-211882)和酵母(Yoshikwa等，Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，1226-12300)中分离海藻糖。另外，在M.Scher的食品加工(FoodProcessing，4月，95-96，1993)中描述了用含有能够将葡萄糖转变成海藻糖的细菌基因的重组植物生产海藻糖的方法。日本特许公开专利83-216695公开了用麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶将麦芽糖转变成海藻糖的方法。但是，这些方法不太有效，因为其生产过程复杂且产率低。
最近公开了一些酶促方法。日本特许公开专利Hei7-143876和EPO628630 A2公开两步酶促转变法，其中通过麦芽寡糖基海藻糖(maltooligosyl trehalose)合酶和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶将淀粉转变成海藻糖。日本特许公开专利Hei7-170977和韩国特许公开专利95-3444公开了一步酶促转变法，其中通过海藻糖合酶将麦芽糖直接转变成海藻糖。但是，仍然需要提高海藻糖合酶的滴度以便在产率和成本方面使得从麦芽糖中生产海藻糖更有效。
在过去数年间，我们投入了很大的努力以便从土壤中分离出能够将麦芽糖转变成海藻糖的微生物。我们已经成功地筛选出一个新菌株，它可以高度表达海藻糖，而意想不到的是不产生任何副产品，这与所有已知的微生物都不同。其形态学和生理学特征表明该菌株是一个新的司徒茨氏假单胞菌菌株(Pseudomonas stutzeri)。已将该菌株命名为司徒茨氏假单胞菌CJ38。
我们从司徒茨氏假单胞菌CJ38的染色体中分离了海藻糖合酶的基因，并通过用限制酶Sau3AI将其克隆到已知载体pUC18中而确定了其核苷酸序列。另外，还从司徒茨氏假单胞菌CJ38中分离了海藻糖合酶蛋白质并用标准方法确定了其氨基酸序列。还发现这些序列明显不同于迄今为止已知的海藻糖合酶基因和所有蛋白质的序列。本发明构建了携带海藻糖合酶基因的重组质粒以便大量表达由所述基因编码的海藻糖合酶。
发明概述本发明提供了一种从麦芽糖生产海藻糖的新微生物，司徒茨氏假单胞菌CJ38。根据布达佩斯条约，该菌株于1999年2月12日被保藏在韩国汉城的韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM10150。由于在将麦芽糖转变成海藻糖时，该菌株不产生副产品如葡萄糖，因此，它是非常有价值的。本发明还提供了具有下列氨基酸序列的新的海藻糖合酶蛋白质Met Ser Ile Pro Asp Asn Thr Tyr Ile Glu Trp Leu Val Ser Gln5 10 15Ser Met Leu His Ala Ala Arg Glu Arg Ser Arg His Tyr Ala Gly20 25 30Gln Ala Arg Leu Trp Gln Arg Pro Try Ala Gln Ala Arg Pro Arg35 40 45Asp Ala Ser Ala Ile Ala Ser Val Trp Phe Thr Ala Tyr Pro Ala50 55 60Ala Ile Ile Thr Pro Glu Gly Gly Thr Val Leu Glu Ala Leu Gly65 70 75Asp Asp Arg Leu Trp Ser Ala Leu Ser Glu Leu Gly Val Gln Gly80 85 90Ile His Asn Gly Pro Met Lys Arg Ser Gly Gly Leu Arg Gly Arg95 100 105Glu Phe Thr Pro Thr Ile Asp Gly Asn Phe Asp Arg Ile Ser Phe110 115 120Asp Ile Asp Pro Ser Leu Gly Thr Glu Glu Gln Met Leu Gln Leu125 130 135Ser Arg Val Ala Ala Ala His Asn Ala Ile Val Ile Asp Asp Ile140 145 150Val Pro Ala His Thr Gly Lys Gly Ala Asp Phe Arg Leu Ala Glu155 160 165Met Ala Tyr Gly Asp Tyr Pro Gly Leu Tyr His Met Val Glu Ile170 175 180Arg Glu Glu Asp 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本发明还提供了携带具有上述核苷酸序列的海藻糖合酶基因的重组质粒。在优选的实施方案中，本发明提供了重组质粒pCJ104，其中将本发明海藻糖合酶基因的4.7kb Sau3AI DNA片段克隆到载体质粒pUC18中。这样可以有效且高水平表达海藻糖合酶基因。在更优选的实施方案中，本发明提供了重组质粒pCJ122，其中在载体质粒pUC18中含有本发明海藻糖合酶基因的2.5kb BamHI-BglII DNA片段，这样可以更高水平表达海藻糖合酶基因。
本发明提供了用重组质粒转化的大肠杆菌，所述重组质粒含有具有上述核苷酸序列的海藻糖合酶基因。在优选的实施方案中，本发明提供了用重组质粒pCJ104转化的大肠杆菌，这样可以高水平生产海藻糖合酶蛋白质。在更优选的实施方案中，本发明提供了用重组质粒pCJ122转化的大肠杆菌，这样可以以更高的水平生产海藻糖合酶蛋白质。
本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括将具有上述氨基酸序列的海藻糖合酶蛋白质与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括破碎用含有海藻糖合酶基因的重组质粒转化的大肠杆菌，所述海藻糖合酶基因具上述核苷酸序列，然后将破碎的细胞与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。在优选的实施方案中，本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括破碎用质粒pCJ104转化的大肠杆菌，将破碎的细胞离心，然后将所得的上清液与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。在更优选的实施方案中，本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括破碎用质粒pCJ122转化的大肠杆菌，将破碎的细胞离心，然后将所得的上清液与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
附图简述

图1用薄层层析对含有司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的反应溶液进行糖分析。G、M和T分别代表葡萄糖、麦芽糖和海藻糖。
图2表示用气相层析对含有司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的反应溶液(A)以及标准海藻糖样品(B)进行糖分析。Tre代表海藻糖。
图3表示用高效液相层析对标准海藻糖样品(A)和样品(B)和(C)进行糖分析。在含司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的溶液完全反应后得到样品(B)。在含司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的溶液反应完成后，通过将海藻糖酶加到反应溶液中得到样品(C)。符号Tre、Mal和Glu分别代表海藻糖、麦芽糖和葡萄糖。
图4表示含本发明海藻糖合酶基因的重组质粒pCJ104的构建图。
图5表示在本发明重组质粒pCJ104中的4.7kb Sau3AI片段的限制图谱。
图6表示本发明重组质粒pCJ121和pCJ122的构建图。
发明详述从土壤中分离了可通过海藻糖合酶从麦芽糖生产海藻糖的微生物，并鉴定其具有司徒茨氏假单胞菌的形态学和生理学特征。尚没有报道司徒茨氏假单胞菌可将麦芽糖转变成海藻糖。因此，我们分离的微生物可以被认为是一个新的司徒茨氏假单胞菌菌株并已命名为司徒茨氏假单胞菌CJ38。
我们用各种限制酶构建了本发明重组质粒pCJ104的限制图谱。已知两种海藻糖合酶基因序列(Biochim.Biophys.Acta 1996，1290，1-3和Biochim.Biophys.Acta 1997，1334，28-32)。将本发明与已知的限制图谱比较，表明pCJ104与已知的图谱不同。
来自已知微生物的海藻糖合酶蛋白质在N-末端相似。但是发现本发明海藻糖合酶蛋白质的N-末端序列与已知海藻糖合酶蛋白质的N-末端不同。结果列于下列表1。
表1海藻糖合酶蛋白质的N-末端序列
确定在本发明重组质粒pCJ104内的4.7kb Sau3AI片段的核苷酸序列和由其表达的海藻糖合酶蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
另外，将本发明海藻糖合酶蛋白质的完整序列与Biochim.Biophys.Acta 1996，1290，1-3和Biochim.Biophys.Acta 1997，1334，28-32中公开的海藻糖合酶蛋白质的序列进行比较。比较结果表明它们之间没有相似性。
用含重组质粒pCJ104或pCJ122的破碎的大肠杆菌转化体完成酶促转变反应。结果，来自本发明破碎细胞的海藻糖合酶的滴度显著高于野生型司徒茨氏假单胞菌CJ38的滴度。
下列表2中列出了本发明所用和制备的质粒和微生物的特性和获得途径。
表2
营养培养基(0.3％肉汤，0.5％胨，pH 6.8)和LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.0)分别用于培养司徒茨氏假单胞菌和大肠杆菌。为了培养通过电穿孔转化的细胞，使用SOC培养基(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)。在克隆海藻糖合酶基因时使用MacConkey琼脂培养基(4％细菌培养用Macconkey琼脂基，2.0％麦芽糖，pH 7.0)。加入浓度为50mg/L的氨苄青霉素。在通过电穿孔转化大肠杆菌时使用Gene Pulser(Bio-Rad)。按照《分子克隆，实验室操作手册》(Molecular Cloning，Laboratory Manual，第2版，Sambrook，J.，E.F.Frishc和T.Maniatis)和《分子克隆技术指南》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymol.Vol.152，Berger，S.L，A.R.Kimme)中所述的方法完成本发明中使用的遗传操作。
酶促反应在pH 6.0-7.0，优选pH 7.0-10，温度4℃-45℃，优选20℃-40℃下完成。麦芽糖在浓度小于50％时可作为底物。海藻糖合酶可以纯的形式或在破碎细胞中使用。
下列实施例具体说明本发明。从前述和下列实施例可以确信本领域技术人员完全能够完成本发明。实施例1筛选微生物将一铂环从土壤中分离的微生物接种到含50毫升LB培养溶液(0.5％酵母提取物，1.0％细菌用胰蛋白胨，0.5％盐)的500毫升锥形烧瓶中，然后在28℃培养2天。将培养液在4℃、8000rpm下离心5分钟。收集细胞，然后用生理盐水洗涤。将洗涤过的细胞悬浮在10毫升磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.0)中。用超声仪将细胞破碎，然后将破碎的细胞在4℃、1200rpm离心20分钟，上清液作为粗的酶溶液。用Bredford方法确定粗酶溶液中的蛋白质浓度。将100微克蛋白质与20微升100mM麦芽糖和10微升100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)混合。将蒸馏水加到混合物中直到总体积达到100微升，反应在30℃进行20小时。用TLC、HPLC和GC分析反应溶液中的糖。实施例2用薄层层析分析海藻糖(图1)反应完成后，将5微升反应溶液加到Kieselgel 60 TLC(Merck，Germany)上，放在含正丁醇-吡啶-水(7∶3∶1)溶剂体系的容器中展开样品。喷20％硫酸的甲醇溶液，然后在110℃干燥10分钟。由此确定样品中的糖。在所研究的至少1000种土壤微生物中，确定有两种可将麦芽糖转变成海藻糖。图1表示在反应前的样品中不存在海藻糖，但在反应完成后，在标准海藻糖样品的位点上可检测到糖。实施例3用气相层析分析海藻糖(图2)反应完成后，用减压干燥器将10微升反应溶液干燥。将干燥的产物溶解于20微升二甲基甲酰胺中，将所得溶液与相同体积的双(三甲基)三氟乙酰胺混合形成三甲基硅烷衍生物。将1微升样品用于GC分析。如图2所示，在与标准海藻糖样品相同的时间点观察到反应溶液的峰。实施例4用高效液相层析分析海藻糖(图3)反应完成后，将一半反应溶液与相同体积的苯酚混合除去蛋白质。将由此得到的样品溶液用于HPLC分析。在与标准海藻糖样品相同的时间点观察到样品的峰。将剩下的一半反应溶液加热到100℃，10分钟以除去酶活性。其与特异性作用于α-1，1-海藻糖的海藻糖酶(Sigma)在37℃反应10分钟。反应完成后，将溶液与相同体积的苯酚溶液混合以除去蛋白质。将由此所得的溶液用于HPLC，结果在与标准海藻糖相同的时间点不出现峰。实施例5鉴定能够将麦芽糖转变成海藻糖的微生物通过电子显微镜观察本发明的土壤微生物，所述微生物是带有鞭毛的棒形细菌。其通过O/F试验被鉴定为需氧细菌，并且是革兰氏阴性菌。表1中总结了所述微生物的生理学特征。将本发明微生物的这些特征与Bergy’s Manual of Systemic Bacteriology，1984和专利文献中描述的微生物进行比较，将本发明的微生物鉴定为司徒茨氏假单胞菌，因为其与该种微生物在生理学和形态学上最相近。
表1
实施例6克隆海藻糖合酶基因(图4)(1)从司徒茨氏假单胞菌分离染色体DNA让司徒茨氏假单胞菌在营养培养基中生长，在静止期早期，离心回收细胞。将回收的细胞用TE溶液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mMEDTA，pH 8.0)洗涤两次。将洗涤的细胞悬浮在20毫升STE缓冲液(20％蔗糖，10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA，pH 8.0)中，将5mg/mL溶菌酶和RNase A加到悬浮液中。在37℃反应2小时。反应完成后，将SDS加到浓度为1％，然后在37℃继续反应30分钟。将该溶液与相同体积的苯酚反应4小时，然后离心。将5M NaCl加到所得的上清液中直到其浓度达到0.1M。用玻璃棒，加入2倍体积的无水乙醇得到染色体DNA。将染色体DNA用70％乙醇洗涤，然后溶于TE溶液用于接下来的试验。
(2)制备基因组文库在37℃，将从司徒茨氏假单胞菌分离的纯染色体DNA用限制酶Sau3AI部分消化15-30分钟。加热使限制酶失活，完成琼脂糖凝胶电泳以得到3-10 kb DNA片段。如图5所示，将质粒pUC18用BamHI消化，然后用牛肠磷酸酶处理。将裂解的DNA与预先得到的3-10kbDNA片段混合，在15℃用T4 DNA连接酶连接16小时。将由此所得的重组体用于转化。按如下所述通过电穿孔完成转化。将大肠杆菌NM522在LB培养基中培养14-15小时。将所得的培养物接种在1升LB上以便开始在600nm的吸收值为0.07-0.1，然后进行培养直到吸收值为0.8。将细胞离心，然后悬浮在1升HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙烷磺酸)]缓冲液中。再将细胞离心，并悬浮在500毫升冷无菌去离子蒸馏水中。再将细胞离心，然后悬浮于20毫升10％甘油溶液。再将细胞离心，然后悬浮于2-3毫升10％甘油溶液以便将细胞浓度调整到2-4×1，010/ml。将细胞悬浮液快速冷冻，于-70℃保存。冷冻的细胞可在约一个月的时间使用，在此期间其转化频率不会降低。将40微升冷冻细胞悬浮液在冰中融解，将复原的悬浮液与已连接的DNA溶液混合。将混合物放在直径为0.2cm的基因脉冲仪杯中，将电场的电容和强度分别固定在25uF和12.5kV/cm。在电阻为200-400Ω通过一个电脉冲后，立即加入1毫升SOC培养基并在37℃培养1小时。在LB-氨苄青霉素琼脂培养基上对培养物划线，然后培养24小时得到至少5万个菌落。将这些菌落一起在LB肉汤中培养2小时。用碱溶解分离纯DNA，然后由此构建基因组文库。
(3)海藻糖合酶基因的克隆通过电穿孔用上述得到的基因组文库转化不能以麦芽糖作为碳源的大肠杆菌ATCC35467。在含20g/L麦芽糖的MacConkey-氨苄青霉素琼脂培养基上对转化的细胞划线。在司徒茨氏假单胞菌的海藻糖合酶基因被导入大肠杆菌后，麦芽糖通过大肠杆菌中的海藻糖酶就转变成葡萄糖。由于所得葡萄糖被代谢，因此，pH降低，MacConkey琼脂培养基上菌落的颜色由黄色变成红色。该原理适用于本发明的克隆系统。将用基因组文库转化的大肠杆菌ATCC35467在MacConkey琼脂培养基上培养得到红色菌落。质粒DNA的分离表明其含有约4.7kbDNA片段。将该质粒命名为pCJ104。为了检测酶，培养大肠杆菌ATCC35467/pUC18(对照)、大肠杆菌ATCC35467/pCJ104和野生型司徒茨氏假单胞菌CJ38。使大肠杆菌细胞在LB培养基上生长直到静止期早期。使司徒茨氏假单胞菌CJ38在营养培养基上生长。离心分离细胞并破碎。在pH 8.5-9.0、温度为35℃，将破碎的细胞在缓冲液20mM二乙醇胺中与作为底物的20％麦芽糖反应。将1.0％三氯乙酸加到反应溶液中，然后离心，用高效液相层析检测麦芽糖和海藻糖的量。结果列于下列表3。
表3酶滴定
*U＝μmol海藻糖/分钟实施例7海藻糖合酶基因的限制图谱构建(图5)用常规方法分离质粒pCJ104，然后用各种限制酶处理以构建限制图谱。
用约20种酶，例如AatII、BamHI、EcoRI、EcoRV、KpnI、NcoI、NdeI、PstI、SacI、SacII、SalI、SphI和XhoI对质粒pCJ104进行单、双和三消化。用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段，然后进行比较以构建限制图谱。实施例3海藻糖合酶基因的亚克隆和酶检测(1)海藻糖合酶基因的亚克隆(图6)完成亚克隆以确定海藻糖合酶基因在4.7kb质粒pCJ104中的位点。将质粒pCJ104用KpnI裂解，然后分离出3.35kb片段。将该片段导入载体pUC18/KpnI/CIP中，用所得的重组体转化大肠杆菌NM522。构建了将3.35kb片段定向克隆到pUC18/KpnI中的重组质粒pCJ121。另外，用BamHI和BglII对质粒pCJ104进行双裂解。纯化由此得到的2.5kb BamHI-BglII片段，然后连接到pUC18/BamHI/CIP中，再用该重组体转化大肠杆菌NM522。构建了将2.5kb BamHI-BglII片段定向克隆到pUC18/BamHI中的重组质粒pCJ122。最后，用BamHI和EcoRI对质粒pCJ104进行双消化，纯化所得的1.2kb BamHI-EcoRI片段。将该片段连接到载体pUC18/BamHI/EcoRI中，然后用所得的重组体转化大肠杆菌NM522。构建重组质粒pCJ123。
用构建的各重组质粒转化大肠杆菌ATCC35467。将转化体在含2.0％麦芽糖(20g/L)的MacConkey-氨苄青霉素培养基上培养，观察由此形成的菌落颜色。观察到携带pCJ121和pCJ122的大肠杆菌ATCC35467形成红色菌落，但携带pCJ123的大肠杆菌ATCC35467由于不能分解麦芽糖而形成黄色菌落。因此，可以看出海藻糖合酶基因位于较长的2.5kb BamHI-BglII片段，而不是1.2kb BamHI-EcoRI片段上。
(2)滴定含亚克隆质粒的转化体的海藻糖合酶将转化的大肠杆菌ATCC35467/pCJ121、ATCC35467/pCJ122和ATCC35467/pCJ123在LB-Ap培养基上培养至静止期早期。离心回收细胞，用适宜体积的20mM二乙醇胺溶液洗涤两次。将洗涤的细胞悬浮在适宜体积的20mM二乙醇胺溶液中，用超声仪破碎。将破碎的细胞离心，将由此得到的上清液用作酶液体。在35℃，将上清液与pH8.5-9.0的含20mM二乙醇胺的20％麦芽糖溶液反应。将1.0％三氯乙酸加到反应溶液中，离心并进行HPLC分析。将一单位酶活性定义为其每分钟产生1μmol海藻糖时的酶量。结果列于下列表5。
根据双滴定，大肠杆菌ATCC35467/pCJ122的酶滴度最高。在5升发酵罐中，于下列表6所列的条件下，高密度培养大肠杆菌ATCC35467/pCJ122。结果，非酶活性为5.0U/mg蛋白质，与在LB培养基中培养得到的相同，在高密度培养物中海藻糖合酶的滴度提高到30U/ml培养物(表5)。与野生型司徒茨氏假单胞菌相比，大肠杆菌ATCC35467/pCJ122的非酶活性和培养物滴度分别提高了50和约1300倍。
表5
表权利要求
1.具有下列氨基酸序列的海藻糖合酶蛋白质Met Ser Ile Pro Asp Asn Thr Tyr Ile Glu Trp Leu Val Ser Gln5 10 15Ser Met Leu His Ala Ala Arg Glu Arg Ser Arg His Tyr Ala Gly20 25 30Gln Ala Arg Leu Trp Gln Arg Pro Try Ala Gln Ala Arg Pro Arg35 40 45Asp Ala Ser Ala Ile Ala Ser Val Trp Phe Thr Ala Tyr Pro Ala50 55 60Ala Ile Ile Thr Pro Glu Gly Gly Thr Val Leu Glu Ala Leu Gly65 70 75Asp Asp Arg Leu Trp Ser Ala Leu Ser Glu Leu Gly Val Gln Gly80 85 90Ile His Asn Gly Pro Met Lys Arg Ser Gly Gly Leu Arg Gly Arg95 100 105Glu Phe Thr Pro Thr Ile Asp Gly Asn Phe Asp Arg Ile Ser Phe110 115 120Asp Ile Asp Pro Ser Leu Gly Thr Glu Glu Gln Met Leu Gln Leu125 130 135Ser Arg Val Ala Ala Ala His Asn Ala Ile Val Ile Asp Asp Ile140 145 150Val Pro Ala His Thr Gly Lys Gly Ala Asp Phe Arg Leu Ala Glu155 160 165Met Ala Tyr Gly Asp Tyr Pro Gly Leu Tyr His Met Val Glu Ile170 175 180Arg Glu Glu Asp Trp Glu Leu Leu Pro Glu Val Pro Ala Gly Arg185 190 195Asp Ser Val Asn Leu Leu Pro Pro Val Val Asp Arg Leu Lys Glu200 205 210Lys His Tyr Ile Val Gly Gln Leu Gln Arg Val Ile Phe Phe Glu215 220 225Pro Gly Ile Lys Asp Thr Asp Trp Ser Val Thr Gly Glu Val Thr230 235 240Gly Val Asp Gly Lys Val Arg Arg Trp Val Tyr Leu His Tyr Phe245 250 255Lys Glu Gly Gln Pro Ser Leu Asn Trp Leu Asp Pro Thr Phe Ala260 265 270Ala Gln Gln Leu Ile Ile Gly Asp Ala Leu His Ala Ile Asp Val275 280 285Thr Gly Ala Arg Val Leu Arg Leu Asp Ala Asn Gly Phe Leu Gly290 295 300Val Glu Arg Arg Ala Glu Gly Thr Ala Trp Ser Glu Gly His Pro305 310 315Leu Ser Val Thr Gly Asn Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ile Arg Lys320 325 330Ala Gly Gly Phe Ser Phe Gln Glu Leu Asn Leu Thr Ile Asp Asp335 340 345Ile Ala Ala Met Ser His Gly Gly Ala Asp Leu Ser Tyr Asp Phe350 355 360Ile Thr Arg Pro Ala Tyr His His Ala Leu Leu Thr Gly Asp Thr365 370 375Glu Phe Leu Arg Met Met Leu Arg Glu Val His Ala Phe Gly Ile380 385 390Asp Pro Ala Ser Leu Ile His Ala Leu Gln Asn His Asp Glu Leu395 400 405Thr Leu Glu Leu Val His Phe Trp Thr Leu His Ala Tyr Asp His410 415 420Tyr His Tyr Lys Gly Gln Thr Leu Pro Gly Gly His Leu Arg Glu425 430 435His Ile Arg Glu Glu Met Tyr Glu Arg Leu Thr Gly Glu His Ala440 445 450Pro Tyr Asn Leu Lys Phe Val Thr Asn Gly Val Ser Cys Thr Thr455 460 465Ala Ser Val Ile Ala Ala Ala Leu Asn Ile Arg Asp Leu Asp Ala470 475 480Ile Gly Pro Ala Glu Val Glu Gln Ile Gln Arg Leu His Ile Leu485 490 495Leu Val Met Phe Asn Ala Met Gln Pro Gly Val Phe Ala Leu Ser500 505 510Gly Trp Asp Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu Ala Pro Glu Gln Val515 520 525Glu His Leu Met Gly Asp Gly Asp Thr Arg Trp Ile Asn Arg Gly530 535 540Gly Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Ala Pro Glu Ala Ser Val Ser Ala545 550 555Glu Gly Leu Pro Lys Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Leu Ala Glu560 565 570Gln Leu Gln Arg Pro Gly Ser Phe Ala Cys Gln Leu Lys Arg Ile575 580 585Leu Ser Val Arg Gln Ala Tyr Asp Ile Ala Ala Ser Lys Gln Ile590 595 600Leu Ile Pro Asp Val Gln Ala Pro Gly Leu Leu Val Met Val His605 610 615Glu Leu Pro Ala Gly Lys Gly Val Gln Leu Thr Ala Leu Asn Phe620 625 630Ser Ala Glu Pro Val Ser Glu Thr Ile Cys Leu Pro Gly Val Ala635 640 645Pro Gly Pro Val Val Asp Ile Ile His Glu Ser Val Glu Gly Asp650 655 660Leu Thr Asp Asn Cys Glu Leu Gln Ile Ash Leu Asp Pro Tyr Glu665 670 675Gly Leu Ala Leu Arg Val Val Ser Ala Ala Pro Pro Val Ile680 685
2.具有下列核苷酸序列的海藻糖合酶基因GATCGCTGGC GTACTGCAGG TAGAGCAGGC GCATCGGCCC CCAGGGCGCA TCGGCCGGCT 60CCGCTGTGCC CTGCTGGTTC ATGAAGCGGA CGAAGCGGCC ATCGCGGAAC CGTGGACGCC 120ATTCGGGGCT GTCCGGGTCG CGGCTGTCGG TGAGCGTGCG CCACAGGTCG CTGCGAAACG 180GCGGACCGCT CCAAAGCGCG CCGTGGATGG GATCGCCGAG CAGTTCGTGC AGCTCCCAGG 240AACGTTGCGA ATGCAGCGCG CCGAGGCTCA GGCCATGCAG ATACAGGCGC GGTCGGCGTT 300CGGCCGGCAG TTCGGTCCAG TAGCCATAGA TCTCGGCGAA TAGCGCGCGG GCCACGTCGC 360GGCCGTAGTC GGCCTCCACC AGCAGCGCCA GCGGGCTGTT CAGATAGGAG TACTGCAACG 420CCACGCTGGC GATATCGCCG TGGTGCAGGT ATTCCACTGC GTTCATCGCC GCCGGGTCGA 480TCCAGCCGGT ACCGGTGGGC GTCACCAGCA CCAGCACCGA TCGCTCGAAG GCGCCGCTGC 540GCTGCAGCTC GCGCAAGGCC AGACGCGCCC GCTGGCGCGG GGTCTCTGCC GCCCGCAGAC 600CGACGTAGAC GCGAATCGGC TCGAGCGCCG AGCGGCCGCT CAAGACGCTG ATATCCGCCG 660CCGACGGGCC GGAGCCGATG AACTCGCGGC CGGTGCGGCC CAGCTCCTCC CAGCGCAGCA 720ACGAGGCCCG GCTGCCGCTT TTCAGCGGCG AGGCCGGTGG CGCCGTCTCC GGTTCGATCA 780GGGCGTCGTA CTGCGCGAAG GATGCGTCCA GCATGCGCAG TGCCCGCGCC GCCAGCACAT 840CGCTGAGCAG CGACCAGAAC AGCGCCAGCG CCACCAGCAC GCCGATCACG TTGGCCAGGC 900GCCGTGGCAG CACGCGGTCG GCGTGCCGCG AGACGAAGCG CGACACCAGC CGATACAGAC 960GCGCCAGCGT CAGCAGGATG AGAAAGGTCG CCAGCGCGGT GAGAATGACT TCGAGCAGGT1020GCGCACTGCT CACCGGCGGC ATGCCCATCA GCGCGCGTAC CGCGTTCTGC CAGCCGGCGA1080CCTGGCTGAG GAAATACCCG GCCAGCAGCA GGCAGCCGAC CGCGATCAGC AGATTGACCC1140GCTCGCGCTG CCAGCCTGGG CGCTCCGGCA GTTCCAGATA GCGCCACAGC CAGCGCCAGA1200ACACGCCGAG GCCATAGCCC ACCGCCAGCG CCGCGCCGGC CAGCACGCCC TGGCTCAGCG1260TCGAGCGCGG CAGCAGCGAT GGCGTCAGCG CCGCGCAGAA GAACAGCGTG CCCAGCAGCA1320GGCCGAAACC GGACAGCGAG CGCCAGATAT AGAGGACGGG CAGGTGCAGC ATGAAGATCT1380CCGCGGTCGG GTGACGGCGT CGCGCCTCGG CATATCGAGG CGTGTCCGGT CGTGCGGTTC1440CCGTGATGGT CCGCAGCAGG CCAATCCGAT GCAACGATGG CCGAGCGGCC GACTCAAACG1500TCTACATTTC CCTAGTGCTG CCGGAACCGA TCGCCG1536ATG AGC ATC CCA GAC AAC ACC TAT ATC GAA TGG CTG GTC AGC CAG TCC1584ATG CTG CAT GCG GCC CGC GAG CGG TCG CGT CAT TAC GCC GGC CAG GCG1632CGT CTC TGG CAG CGG CCT TAT GCC CAG GCC CGC CCG CGC GAT GCC AGC1680GCC ATC GCC TCG GTG TGG TTC ACC GCC TAT CCG GCG GCC ATC ATC ACG1728CCG GAA GGC GGC ACG GTA CTC GAG GCC CTC GGC GAC GAC CGC CTC TGG1776AGT GCG CTC TCC GAA CTC GGC GTG CAG GGC ATC CAC AAC GGG CCG ATG1824AAG CGT TCC GGT GGC CTG CGC GGA CGC GAG TTC ACC CCG ACC ATC GAC1872GGC AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG AGC CTG GGG ACC1920GAG GAG CAG ATG CTG CAG CTC AGC CGG GTG GCC GCG GCG CAC AAC GCC1968ATC GTC ATC GAC GAC ATC GTG CCG GCA CAC ACC GGC AAG GGT GCC GAC2016TTC CGC CTC GCG GAA ATG GCC TAT GGC GAC TAC CCC GGG CTG TAC CAC2064ATG GTG GAA ATC CGC GAG GAG GAC TGG GAG CTG CTG CCC GAG GTG CCG2112GCC GGG CGT GAT TCG GTC AAC CTG CTG CCG CCG GTG GTC GAC CGG CTC2160AAG GAA AAG CAC TAC ATC GTC GGC CAG CTG CAG CGG GTG ATC TTC TTC2208GAG CCG GGC ATC AAG GAC ACC GAC TGG AGC GTC ACC GGC GAG GTC ACC2256GGG GTC GAC GGC AAG GTG CGT CGC TGG GTC TAT CTG CAC TAC TTC AAG2304GAG GGC CAG CCG TCG CTG AAC TGG CTC GAC CCG ACC TTC GCC GCG CAG2352CAG CTG ATC ATC GGC GAT GCG CTG CAC GCC ATC GAC GTC ACC GGC GCC2400CGG GTG CTG CGC CTG GAC GCC AAC GGC TTC CTC GGC GTG GAA CGG CGC2448GCC GAG GGC ACG GCC TGG TCG GAG GGC CAC CCG CTG TCC GTC ACC GGC2496AAC CAG CTG CTC GCC GGG GCG ATC CGC AAG GCC GGC GGC TTC AGC TTC2544CAG GAG CTG AAC CTG ACC ATC GAT GAC ATC GCC GCC ATG TCC CAC GGC2592GGG GCC GAT CTG TCC TAC GAC TTC ATC ACC CGC CCG GCC TAT CAC CAT2640GCG TTG CTC ACC GGC GAT ACC GAA TTC CTG CGC ATG ATG CTG CGC GAA2688GTG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCG GCG TCA CTG ATC CAT GCG CTG CAG2736AAC CAT GAC GAG TTG ACC CTG GAG CTG GTG CAC TTC TGG ACG CTG CAC2784GCC TAC GAC CAT TAC CAC TAC AAG GGC CAG ACC CTG CCC GGC GGC CAC2832CTG CGC GAA CAT ATC CGC GAG GAA ATG TAC GAG CGG CTG ACC GGC GAA2880CAC GCG CCG TAC AAC CTC AAG TTC GTC ACC AAC GGG GTG TCC TGC ACC2928ACC GCC AGC GTG ATC GCC GCG GCG CTT AAC ATC CGT GAT CTG GAC GCC2976ATC GGC CCG GCC GAG GTG GAG CAG ATC CAG CGT CTG CAT ATC CTG CTG3024GTG ATG TTC AAT GCC ATG CAG CCC GGC GTG TTC GCC CTC TCC GGC TGG3072GAT CTG GTC GGC GCC CTG CCG CTG GCG CCC GAG CAG GTC GAG CAC CTG3120ATG GGC GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATC AAT CGC GGC GGC TAT GAC CTC3168GCC GAT CTG GCG CCG GAG GCG TCG GTC TCC GCC GAA GGC CTG CCC AAG3216GCC CGC TCG CTG TAC GGC AGC CTG GCC GAG CAG CTG CAG CGG CCA GGC3264TCC TTC GCC TGC CAG CTC AAG CGC ATC CTC AGC GTG CGC CAG GCC TAC3312GAC ATC GCT GCC AGC AAG CAG ATC CTG ATT CCG GAT GTG CAG GCG CCG3360GGA CTC CTG GTG ATG GTC CAC GAG CTG CCT GCC GGC AAG GGC GTG CAG3408CTC ACG GCA CTG AAC TTC AGC GCC GAG CCG GTC AGC GAG ACC ATC TGC3456CTG CCC GGC GTG GCG CCC GGC CCG GTG GTG GAC ATC ATT CAC GAG AGT3504GTG GAG GGC GAC CTC ACC GAC AAC TGC GAG CTG CAG ATC AAC CTC GAC3552CCG TAC GAG GGG CTT GCC CTG CGT GTG GTG AGC GCC GCG CCG CCG GTG3600ATC TGA GCGC3610CCTCTTCGCG CGCCCCGGGT CCGCCGCTAT AGTGCGCAGC GCCTGGGGCG CGCATTGCCC3670TCGCCGTCGA GACCAGCCCG TGTCGTTCAC TTCGCTTTTC CGCCTTGCGC TGCTGCCGCT3730GGCGCTGCTT GCCGCACCCG TCTGGGCGCA GACCGCCTGC CCGCCCGGCC AGCAGCCGAT3790CTGCCTGAGC GGCAGCTGCC TCTGCGTGCC GGCCGCCGCC AGCGATCCAC AGGCGGTCTA3850CGACCGCGTG CAGCGTATGG CTACGCTGGC CCTGCAGAAC TGGATCCAGC AGTCGCGCGA3910CCGCCTGATG GCCGGCGGCG TCGAGCCGAT ACCGCTGCAC ATCCGCTCGC AGCTCGAGCC3970GTATTTCGAT CTTGCCGTGC TGGAGAGTGC GCGGTACCGC GTCGGCGACG AGGTGGTGCT4030GACTGCCGGC AACACCCTGC TGCGCAACCC GGACGTCAAT GCCGTGACCC TGATCGACGT4090CATCGTCTTC CGCCACGAGG AGGATGCCCG GGACAACGTC GCGCTCTGGG CCCATGAGCT4150CAAGCACGTC GAGCAATATC TGGACTGGGG CGTCGCCGAG TTCGCCCGGC GCTATACGCA4210GGATTTCCGT GCCGTGGAGC GCCCGGCCTA TGCGCTGGAG CGTGAGGTGG AAGAGGCCCT4270GCGCGAGACG CAGACGCGGC GCTGAGCGAG CTGATCGGTG CTGCTGCCCG CACTGGGCTG4330AAGCCCACCA ATGACGCCGG CGAAAACGAA AAACCCCGCC GAGGCGGGGT TTCTGACGCG4390GGTTGTGCGG TCAGCTCAGA ACGCCGGGAC CACGGCGCCC TTGTACTTTT CCTCGATGAA4450CTGGCGTACT TGCTCGCTGT GCAGCGCGGC AGCCAGTTTC TGCATGGCAT CGCTGTCCTT4510GTTGTCCGGA CGGGCGACCA GAATGTTCAC GTATGGCGAG TCGCTGCCCT CGATCACCAG4570GGCGTCCTGG GTCGGGTTCA GCTTGGCTTC CAGCGCGTAG TTGGTGTTGA TCAGCGCCAG4630GTCGACCTGG GTCAGCACGC GCGGCAGAGT CGCGGCTTCC AGTTCGCGGA TCTTGATCTT4690CTTCGGGTTC TCGGCGATGT CTTCGGCGTG GCGGTGATGC CGGCGCCGTC CTTCAGACCG4750ATC 4753
3.一种重组质粒，含权利要求1的海藻糖合酶基因。
4.根据权利要求1的重组质粒，其为重组质粒pCJ122。
5.用权利要求1的重组质粒转化的大肠杆菌。
6.根据权利要求5的转化体，其中所述重组质粒是pCJ122。
7.生产海藻糖的方法，该方法包括将权利要求1的海藻糖合酶与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
8.生产海藻糖的方法，该方法包括破碎权利要求5的已转化的大肠杆菌，离心已破碎的细菌，将所得上清液与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
9.一种从麦芽糖生产海藻糖的新微生物司徒茨氏假单胞菌CJ38。
全文摘要
本发明涉及生产海藻糖的微生物和生产海藻糖的方法。本发明还涉及新的海藻糖合酶蛋白质、海藻糖合酶基因、携带所述海藻糖合酶基因的重组质粒以及用所述重组质粒转化的微生物。
文档编号C12N1/20GK1346405SQ99816517
公开日2002年4月24日 申请日期1999年3月24日 优先权日1999年3月24日
发明者李世永, 宋银景, 朴彦兴, 权相浩, 李光镐, 金昌谦, 李镇镐, 郑成五, 田永重 申请人:第一制糖株式会社