作为pak65配体的chp多肽的制作方法

专利名称：作为pak65配体的chp多肽的制作方法
发明的背景Pho GTP酶(Rac，Cdc42Hs和Rho)参予调节包括转录激活、生长控制和细胞形态学再组织在内的多种生物学反应(Hall et al.，Science，1998，279509-514和Van Aelst et al.，Genes Dev.，1997，112295-2322)。将这些GTP酶微量注射到哺乳动物细胞内，证明Cdc 42Hs参予丝足的形成(Nobes et al.，Cell，1995，8153-62和Kozma et al.，Mol.Cell Biol.，1995，151942-1952)和Rac的活化以诱导片状伪足，然后激活Rho以诱导应力纤维(Ridleyet al.，Cell，1992，70401-410)。在过去的几年里，已鉴定了这些GTP酶的多种不同的下游分子靶。这些靶与GTP酶的活化GTP结合形式相互作用。已显示Cdc42Hs和Rac可与下列分子特异地相互作用WASP(Aspenstrom et al.，Curr Biol.，1996，670-75；Symonset al.，Cell，1996，84723-734；和Kolluri et al.，Proc.Natl.Acad Sci.，1996，936515-6518)、IQGAP(Hart et al.，EMBO J.，1996，152997-3005；和Kurodas et al.，J.Biol.Chem.，1996，27123363-23367)、POSH(Tapon et al.，EMBO J.，1998，171395-1404)、PORI(Van Aelst et al.，EMBO J.，1996，1153778-3786)、p67-phox(Diekmann et al.，Science，1994，265531-533)、MLK3(Teramoto et al.，J.Biol.Chem.，1996，27127225-27228)和PAK(Maser et al.，Nature 1993，363364-357；Martinet al.，EMBO J.，1995，141997-1978；和Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998)。p21活化的激酶(PAK)是GTP酶Rac和Cdc42Hs的下游效应物之一(Maser et al.，Nature，1993，363364-367；Martin et al.，EMBO J.1995，141997-1998；Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998；以及Sells et al.，Trends Cell Biol.1997，71623-1627)。GTP酶的GTP结合形式通过一个保守的GTP酶结合区(GBD)与PAK相互作用，并继之刺激Pak活性(Maser et al.，Nature 1993，363364-367；Martin et al.，EMBO J.1995，141997-1998；Bagrodia etal.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998，和Sells et al.，Trends Cell Biol.，1997，71623-1627)。已鉴定出3个哺乳动物PAK包括PAK1，2个小鼠PAK3和3个大鼠类似物PAKα、β及γ(Sells et al.，Trends Cell Biol.，1997，71623-1627)。
所有的PAK均含有调节区(PakR)和与酵母STE20紧密相关的高度保守的激酶区(Sells et al.，Trends Cell Biol.，1997，71623-1627)。RakR含有GBD和对于同含有SH3区域的蛋白质相互作用十分重要的聚脯氨酸序列(Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998)。酯母同系物STE20是参予激活酿酒酵母中MAP激酶级联的蛋白质激酶，对该同系物的研究揭示了其对PAK功能的可能作用。几个研究小组的结果显示，哺乳动物PAK可激活JNK MAP激酶级联(Minden et al.，Cell 1995，81147-157和Coso et al.，Cell 1995，811137-1146)，并且最近对Rac和Cdc42Hs效应物突变体的研究提示，PAK对于JNK活化是必不可少的(Lamarche et al.，Cell 1996，87519-529)。PAK是Rac和Cdc42Hs的效应物这一事实提示，它们在调节肌动蛋白细胞骨架的再组织中也可能起作用。有几篇报导证明向病灶性复合体及片状伪足补充PAK，但这些作用并不依赖于PAK激酶活性和与Cdc42Hs或Rac的相互作用(Dharmawardhaneet al.，J.Cell Biol.1997，1381265-1278；Sells et al.，Curr.Biol.1997，7202-210和Manser et al.，Mol.Cell Biol.1997，171129-1143)。此外，不与PAK相互作用的Rac和Cdc42Hs的效应物突变体能够促进诱生片状伪足和丝状假足(Lamarche et al.，Cell1996，87519-529)。
Pak2通过其富脯氨酸序列与NCK的SH3区(Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.1995，27027995-27998)和Grh2相互作用。最近，Manser等人(Mol.Cell 1998，1183-192)证明，PakR含有独特的脯氨酸序列，其可与新的GTP/GDP交换因子—PIX的SH3区域结合。提示PIX/PAK相互作用对于PAK与病灶性复合体的结合是重要的(Manser et al.，Mol.Cell 1998，1183-192)。
发明概要本发明涉及与蛋白激酶相互作用并类似于Rho家族成员的新一类细胞信号蛋白质的核酸、多肽及其片段。本发明特别涉及新的人类蛋白质Chp，它是一种可调节PAK和JNK活性、与JNK MAP激酶级联相互作用、调整细胞骨架活性及调节基因转录的细胞信号转导分子。
本发明进一步涉及在治疗、诊断和研究中使用这样的核酸和多肽的方法。例如，可利用Chp的核酸和多肽鉴定其活性调制剂，发展模拟人类疾病的动物模型。本发明还涉及Chp的配体，如多肽、抗体和核酸。
附图简要说明

图1显示编码全长度人Chp的核苷酸和氨基酸序列。
图2是人Chp、Cdc42和Rac1间的比较。
发明的详细说明已鉴定了编码一类新的Cdc42Hs相关蛋白质Chp的新的核酸及多肽序列。Chp具有下列一种或多种生物学活性PAK调节区结合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、GTP酶活性、GTP/GDP结合活性、细胞骨架再组织活性、高尔基体导向和保留信号活性、调节含有细胞骨架再组织所需成分之小泡供应的活性，或Chp特异性免疫原活性。
PAK调节区域结合活性是指，例如，全长度Chp或其生物学活性多肽片段与GTP酶Rho家族下游效应物之PAK(p21活化的激酶)家族，如Rac和Cdc 42Hs的多肽序列相互作用(如结合或附着)。在一优选实施方案中，调节区是PakR(或“PakR调节区”)，其为与酵母STE20相关的并可得自PAK2的高度保守的激酶区域(参见，例如，Manser，E.，Leun，T.，Salihuddin，H.，Tan，L.，and Lim，L，A non-receptortyrosine kinase that inhibits the GTPase activity of p21cdc42，Nature 1993，363364-367；Martin，G.A.，Bollag，G.McCormick，F.，and Abo，A，A novel Serine Kinase activated byracl/CDC42Hs-dependent autophosphorylation is related to PAK65and STE20，EMBO J.1995，141970-1978；Bagrodia，S.，Derijard，B.，Davis，R.J.，and Cerione，R.A.，Cdc 42 and PAK-mediatedsignaling leads to Jun Kinase and p38 mitogen-activated proteinKinase activation，J.Biol.Chem.1995，27027995-27998；Sells，M.A.and Chernof，J.Emerging from the Pak；the p21-activated Protein Kinase family，Trends Cell Biol.1997，7162-167)。
PakR可能包括GTP酶结合区(GBD)和聚脯氨酸序列(参见Bagrodiaet al.，J.Biol.Chem.1995，27027995-27998)。Chp结合区对于同PakR结合和刺激PAK激酶活性可能是有效的，如激动剂；或者，其可导致Chp多肽与PakR的结合，而不刺激PAK激酶活性，如拮抗剂。同样，Chp可能直接对JNK或对中间体具有JNK调节区结合活性。更一般地说，Chp对其它蛋白质，包括与PAK、JNK、MAP激酶或由它们衍生的合成多肽具有结合活性和/或刺激活性。
可常规检测结合活性。例如，可利竞争性结合试验鉴定化合物，如附着于Chp多肽上的多肽或抗体或其衍生物。可在有效发生结合的条件下使Chp多肽，PakR调节区与待试验底物结合活性的化合物(配体)组合。该试验可在液相中完成，其中由膜将已结合的和游离的配体分开；或者需要时，测定可在固相中完成。可使用高物料通过量方法，例如在芯片、晶片上进行固相测定。也可使用下文实施例中所述的基于细胞的功能性测定法，其中将Chp符合读框的融合到质膜导向信号上并使PakR符合读框的融合到Ras上，并且其与Chp多肽间的有效结合可拯救细胞存活性。
“PAK激酶刺激活性”是指，例如，全长度Chp或其生物学活性片段使PAK家族成员产生蛋白质激酶活性的能力。如下文和实施例中解释的，可通过正常人Chp或活化的Chp介导刺激活性。可在体内，或者可通过改变Chp的氨基酸序列实现激活。刺激作用可以是直接或间接的。例如，一般认为GTP酶的GTP结合形式通过保守的GTP酶结合区(GBD)和聚脯氨酸序列与PAK家族及其它激酶相互作用。当这种相互作用是“有效的”时，即可刺激激酶活性。虽然不拘泥于任何理论，但认为Chp可能通过与PAK中的特异性区域如PakR结合，产生或刺激PAK中的激酶活性。因此，PAK刺激活性可包括与PAK直接结合。如上文提到的，可将结合活性与激酶刺激活性分离开。
JNK激酶刺激活性是指，例如，全长度Chp或其生物学活性片段产生、导致或诱导JNK的蛋白激酶活性和/或p38 MAP激酶途径的能力(Minden et al.，Cell，811147-1157，1995；Coso et al.，Cell，811137-1146，1995)。这种刺激活性对JNK比ERK或p38更具选择性，即Chp并不能显著地诱导p38或ERK激酶活性。如图1中所示的正常人Chp或激活形式的人Chp可按JNK MAP激酶途径诱导激酶活性。可通过PAK介导JNK途径激活。
可按照下列实施例中所述的常规方法(如参见Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.27027995-27998，1995；Coso et al.，Cell 811137-1146，1995)检测激酶活性。
全长度Chp或其生物学活性多肽片段也可具有GTP/GDP结合和/或GTP酶活性。可按照所提到的参考文献中描述的常规方法(也参见Bourne et al.，Nature 349117-129，1991)检测这些活性。
另外，全长度Chp或其生物学活性多肽片段可具有细胞骨架再组织活性。这种活性意味着，例如，Chp多肽，特别是活化的Chp有能力调节细胞之肌动蛋白细胞骨架的聚合，包括产生局部复合体，质膜、粘附纤维、应力纤维、片状伪足及丝足处的局部复合体(如参见Nobesand Hall，Cell 8153-62，1995；Symons et al.，Cell 84723-734)。可使用常规试剂，在向靶细胞内导入Chp或其编码核酸后观察细胞骨架以常规检测这种活性(也参见下列实施例)。
术语“Chp特异性免疫原活性”是指Chp多肽引发对Chp有选择性的免疫学反应。这种反应可以是细胞的或体液的。因此，选自哺乳动物Chp多肽，如图1中所示的人Chp氨基酸序列对抗体、T细胞、巨噬细胞、B细胞、树状细胞等的刺激作用为特异性免疫原活性。可用常规方法检测这些反应。例如参见下文所述的抗结合KLH之C末端肽的Chp特异性抗体。
哺乳动物Chp如人Chp是具有可得自天然来源的氨基酸序列并具有上述一种或多种活性的哺乳动物多肽。其可以是全长度的(即如图1中所示，具有以起始密码子开始并以终止密码子结束的氨基酸序列)，或者是小于全长度并有生物学活性的。因此其包括天然存在的正常、突变、多态等序列。天然来源包括如得自组织或整个生物体、培养的细胞系(包括原代和无限增殖化细胞系、活体解剖组织等)的活细胞。
本发明还涉及全长度哺乳动物Chp的片段。该片段最好是有“生物活性”的。“生物活性”是指多肽片段在活系统中具有活性或有活系统的成分。生物学活性包括上面提到的那些，例如，PAK调节区域结合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性，GTP酶活性，GTP结合活性，细胞骨架再组织活性，或Chp特异性免疫原活性。可以按照任何适宜的方法制备片段，包括化学合成、遗传工程、切割产物等(见下文)。Chp的生物学片段包括已在蛋白质的羧基或氨基末端除去或修饰了氨基酸序列，例如从其前体形式加工成“成熟”形式的Chp。
本发明还涉及具有如图1所示推测的氨基酸1至236之序列的人Chp。236氨基酸多肽具有大约36kDa的分子量。其包括以下区域大约在氨基酸1-32处的独特Chp区域；在氨基酸32-211处的与CDC42和Rac GTP酶有关的GTP酶区域；在大约氨基酸211-236处的PAK调节结合区域活性(包括直接结合或构象效应)。
可以用已知方法分析本发明的如具有图1中所示氨基酸序列的Chp多肽，以鉴定多肽中包括跨膜区、疏水区等的其它结构和/或功能区。例如，可利用Kyte和Doolittle(J.Mol.Biol.157105，1982；EMBL Protein Predict)、Rost和Sander(Proteins，1955-72，1994)公开的方法分析Chp多肽。
可按照各种方法制得哺乳动物和非哺乳动物来源的其它Chp同系物。例如，可以按例如Sambrook等人(Molecular Cloning，1989，第11章)所述的方法，与选自人Chp之核苷酸序列的寡核苷酸杂交，以从其它种生物体中选择同系物。这些同系物可以与Chp有不同量的核苷酸和氨基酸序列相同性和相似性。哺乳动物生物体包括，例如，啮齿动物小鼠、大鼠、仓鼠，以及猴、猪、牛等。非哺乳动物生物体包括，例如，脊椎动物、无脊椎动物、斑马鱼、鸡、果蝇、雅致酵母，非洲爪蟾、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母、线虫、原核生物、植物、拟南芥、病毒等。
本发明还涉及Chp特异性氨基酸序列，如图1所示的见于人体的但非Chp多肽的其它氨基酸序列中没有的特定氨基酸序列。可以比较相关的蛋白质以选择对Chp特异的序列(也参见图2)。可使用计算机程序BLAST系统检索基因/蛋白质数据库，以常规发现特异性氨基酸序列。可利用Chp特异性氨基酸序列制得抗原肽，以产生对其特异的免疫反应。可用如此免疫得到的抗体作为哺乳动物Chp蛋白的探针，用于诊断或研究目的。Chp特异性氨基酸序列如包括图1中列出的氨基酸4-32、216-234、216-224和229-234。
如上所述，本发明的多肽可包括Chp的完整氨基酸序列(即根据带有起始和终止密码子的核苷酸序列确定的全长度)、成熟氨基酸序列(即作为前体产生的Chp多肽被加工成成熟多肽，类似于对Ras进行的肽加工(如参见Gelb，Science 2751750-1751，1997)，或其片段。有用的片段包括含有任一上述区域及Chp特异性氨基酸序列或基本上由其组成的片段。
可以选择具有特异性生物学活性，如PAK调节区结合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、GTP酶活性、GTP结合活性、细胞骨架再组织活性，或Chp特异性免疫原活性的Chp多肽片段。可以试验这些片段的所需活性以常规鉴定有用的片段。下文和实施例中描述了这些活性的检测。也可按EP 496162中所述方法鉴定并制备这些肽。有用的片段可包括图1所示的大约9个连续的氨基酸，优选约10个、15个、20个或30个连续的氨基酸或基本上由这些氨基酸组成。
本发明的多肽也可以有100％或不足100％氨基酸序列相同于图1中列出的氨基酸序列。为了便于以下的讨论序列相同性是指在被比较序列的相应位置上发现有如图1中所示序列中的相同核苷酸或氨基酸。与图1所示氨基酸序列有小于100％序列相同性的多肽可能含有对天然存在序列的各种不同的取代，包括同源和非同源氨基酸取代。例如参见下示的同源氨基酸取代。将相同和同源残基的总和除以被比较的Chp多肽序列中残基的总数等于百分序列相似性。为了计算序列相同性和相似性，可按照任何所需的方法，算法，例如，包括使用FASTA、BLASTA计算机程序等对比并计算被比较的序列。与图1的氨基酸序列具有小于100％氨基酸序列相同性的多肽可能有大约99％、98％、97％、95％、90％、70％，甚至低至大约53％的序列相同性。优选百分率的氨基酸序列相同性为大约87％或更多，例如88％，89％(详见下文关于突变或突变蛋白的讨论)。
本发明还涉及Chp多肽突变蛋白，即氨基酸序列不同于得自天然来源之氨基酸序列的任何多肽(哺乳动物Chp的片段在其氨基酸序列上不同于天源存在的Chp)。因此，Chp突变蛋白包括氨基酸取代、插入和缺失，其中还有非天然存在的氨基酸。
也可按照从基因数据库(如Genbank，EMBL)检索的同源性制备本发明Chp氨基酸序列的突变蛋白。可使用计算机程序BLAST家族中所述的算法、Smith-Waterman算法等多种方法进行序列同源性检索。可以鉴定并对比在多肽间有相同和/或同源序列的区域内的氨基酸，然后基于这种序列对比修饰氨基酸，以在序列中引入突变蛋白。例如，图2中显示了人Chp、Cdc42和Rac1之间的序列比较。这些序列对比揭示出彼此相同和不同的氨基酸位置，提供了关于可望降低、减小或消除Chp之生物学活性的氨基酸取代的信息。例如，当序列对比揭示在两个或多个区域之间保守的相同氨基酸时，去除或取代氨基酸预计将会对其生物学活性造成不利影响。
可用另一个氨基酸取代一个同源的氨基酸以造成氨基酸取代。可以基于侧链的大小和极性化程度来限定同源的氨基酸，其中包括小的非极性氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苏氨酸；小的极性氨基酸丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；大的极性氨基酸谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸；中等极性氨基酸酪氨酸、组氨酸、色氨酸；大的非极性氨基酸苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。也可以对同源氨基酸进行如下分组不带电荷的极性R组甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(带负电荷的)天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸(带正电荷的)赖氨酸、精氨酸、组氨酸。同源氨基酸还包括Dayhoff(Atlas ofProtein Sequence and Structure 5(1978)，和Argos(EMBO J.，8，779-785，1989)所述的那些。
本发明的突变蛋白包括Chp序列中的残基被Cdc42或Rac1之相应区域的同源残基取代所形成的氨基酸序列(如参见图2)。
因此，本发明涉及图1的Chp核苷酸序列，其中所说的核酸编码其中一个或多个氨基酸位置被取代或缺失或有这两种情况的多肽，并且由该核酸编码的多肽具有PAK调节区结合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、GTP酶活性、CTP结合活性、细胞骨架再组织活性，或Chp特异性免疫原活性。例如，Chp多肽突变蛋白及其相应的核苷酸编码序列，可具有如图1所示的氨基酸序列，不同的是可有一个或多个位置被同源氨基酸取代，例如可有1、5、10、15或20处取代。本发明还涉及突变蛋白多肽和编码这些多肽的突变蛋白核酸。可按上述的，下述的和本领域技术人员已知的方法检测修饰作用对上述活性的影响程度。
如上所述，也可基于与相关蛋白质如Cdc42和Rac1的相似之处来造成氨基酸取代。例如，用缬氨酸取代40位上的甘氨酸(G40V)，产生组成上有活性的或激活形式的Chp。术语“激活形式的人Chp多肽，或其生物学活性片段”是指具有天然可获得之序列的人Chp多肽，其可以是天然存在的具有组成活性或天然序列(其已经被修饰而产生组成上有活性的多肽)的突变体。经修饰的多肽例如可以是上述的G40V突变体多肽。术语“组成上有活性的”或“激活的”是指多肽序列及其处于“开启”状态的修饰形式。上下文中所提到的JNK刺激活性、激活形式的人Chp多肽或其片段，应是可刺激JNK激酶途径的多肽。G40V突变即是这样的一个例子。可修饰或诱变Chp，并按下述方法和实施例检测激酶活性以选择那些刺激JNK途径的突变。
可用天冬酰胺取代45位上的丝氨酸(S45D)，以制备另一个突变体。该突变产生显性失活等位基因，锁定GDP结合的无活性形式。与G40V突变相比，这种突变所得到的是无活性的Chp。基于与Cdc42和其它Rho GTP酶的同源性而导入这些及其它取代。因此，可以基于这些同源性制成突变；可以按下列方法和实施例中所述常规选择所需的活性，如增强的、激活的、降低的活性、无活性等。
哺乳动物Chp全长度多肽、其片段或取代的多肽还可包括各种修饰，这些修饰可以是脂质修饰、甲基化、磷酸化、糖基化、共价修饰(如氨基酸R基团的修饰)、氨基酸取代、氨基酸缺失，或氨基酸加入。可以按照重组、合成、化学等各种方法对多肽进行修饰。
本发明的多肽(如人Chp，其片段或突变体)可以各种方式使用例如，作为免疫原用于检测抗体(如下所述)，或作为生物学活性剂(如具有与Chp有关的一种或多种活性)。
编码Chp、其衍生物或其片段的核苷酸可以按一种自然界中并不存在的，即不是天然存在的排布，例如，作为人Chp基因，作为从活生物体如动物，优选人、小鼠等哺乳动物体内或其细胞系的基因组中制备的基因片段，与一个或多个结构区、功能区、可检测区、抗原区和/或所需的有用多肽相结合。包括这些特征的多肽为嵌合或融合多肽。可用化学、合成、准合成和/或重组方法等各种方法制备这种嵌合多肽。编码嵌合多肽的嵌合核酸可在连续的(如有多重N末端区域，用以稳定或增强活性)或间断的可读框(如含有内含子、剪接位点、增强子等)中含有各种区域或所需的多肽。可按照各种方法生产嵌合核酸(如参见美国专利5,439,819号)。一个区域或所需的多肽可具有任何所需的性质，其中包括信号转导、生长促进、细胞导向(如信号序列、导向序列，如导向高尔基体或内质纲)等生物学功能，如疏水、亲水、跨膜等结构功能，受体—配体功能，和/或可检测的功能，如与酶、萤光多肽、绿色萤光蛋白相结合(Chalfie et al.，1994，Science 263802；Cheng et al.，1996，Nature Biotechnology 14606；Levyet al.，1996，Nature Biotechnology 14610等)。此外，可在导入宿主细胞时，使用多肽或其部分作为可选择标志。例如，可使编码本发明的氨基酸序列的核酸与所需的编码序列进行符合读框的融合及为了纯化、选择或标记目的而用作为标记物。融合的区域可编码有利于表达、分离及纯化等的切割位点。
可按照本发明，在表达系统中，于体内或体外利用无细胞体系、重组体、细胞融合体等生产本发明的多肽。这些系统可提供的对多肽修饰包括糖基化、氨基酸取代(例如借助不同的密码子使用)、多肽加工如消化、切割、内肽酶或外肽酶活性，以及与化学部分(包括脂质和磷酸等)结合。
可按照常规方法从天然来源，被转化的宿主细胞(培养基或细胞)中回收本发明的多肽。所说的方法包括去污剂提取(如CHAPS、辛基糖苷)、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析及凝集素层析。为了完成成熟蛋白质的构型，必要时可使用蛋白质重折叠步骤。最后，纯化步骤中可利用高效液相层析(HPLC)。也可按本领域已知的分离GTP酶的方法分离Chp多肽。
哺乳动物Chp核酸或其片段是具有得自天然来源之核苷酸序列的核酸(如前所述)。因此其包括天然存在的，正常的、突变的、多态的等位基因等。天然来源包括例如得自组织和整个生物体及培养的细胞系(包括原化和无限增殖化细胞系)的活细胞。
人Chp是作为约1.5Kb的单一mRNA表达的。其在脑和睾丸中最为丰富，同时在脾和肺中表达量较低。因此，可使用Chp作为组织切片中(使用Chp特异性抗体或Chp特异性核酸探针)，在进行活组织检查的样品等中存在脑和睾丸的标志。
图1中显示哺乳动物Chp的人等位基因的核酸序列。其含有236个氨基酸的可读框。如图1中所示，其含有5′未翻译序列和3′未翻译序列。本发明的核酸序列可含有从氨基酸1至氨基酸236的完全编码序列、其简并序列及其片段。本发明的核酸也可包括与上文和下文中提到的任何核苷酸序列100％互补的核苷酸序列，如反义序列。
本发明核酸可得自各种不同的来源。其可得自，例如从组织、细胞或整个生物体分离的DNA或RNA，如聚腺苷酸化的mRNA。核酸可直接得自DNA或RNA，或得自cDNA库。核酸可得自处于特定发育阶段的，有预期基因型和表型的细胞(如胚胎或成人心脏细胞或组织)等。
就上面提到的Chp多肽来说，包括编码本发明之多肽的核苷酸序列的核酸可以只包括编码序列；包括编码序列和附加编码序列(如编码前导、分泌、导向、酶促、荧光或其它诊断肽的序列)、编码序列和非编码序列(如位于5′或3′末端或分散于编码序列中的未翻译序列，如内含子)。包括不间断地编码多肽的核苷酸序列的核酸是指含有Chp的氨基酸编码序列，同时没有干扰或破坏该编码序列的非编码核苷酸，即没有内含子的核苷酸序列。这样的核苷酸序列也可以说是无隔的可以常规制得编码人或其它哺乳动物Chp的基因组DNA。
本发明的核酸也可包括与上述核酸可操作地连接的表达控制序列。“表达控制序列”是指与表达多肽的核酸可操作地连接的控制表达的核酸序列。可在mRNA或多肽水平上调节表达。因此，表达控制序列包括mRNA相关元件和蛋白质相关元件。这样的元件包括启动子、增强子(病毒或细胞的)、核糖体结合序列、转录终止子等。表达控制序列可操作地连接到核苷酸编码序列上，当以这种方式定位表达控制序列时，即可进行或实现编码序列的表达。例如，当启动子被可操作地连接到编码序列的5′端时，启动子即驱动编码序列的表达。对于正常基因，表达控制序列可以是异源(外源)的或内源的。
可以基于核酸杂交来选择本发明的核酸。可根据两条单链核酸制品杂交在一起的能力，如核苷酸A-T、G-C等之间的碱基配对能力，确定它们核苷酸序列互补性。因此本发明还涉及与包括图1中所示核苷酸序列的核酸杂交的核酸，及其互补序列。与后者杂交的核苷酸序列将具有互补核酸链，或者可在聚合酶(即适当的核酸合成酶)存在下用作模板。本发明包括核酸的两条链，如有意义链和反义链。
可以选择使用杂交条件，以筛选与图1所示的核苷酸序列有一定量核苷酸互补性的核酸。能够与这样的序列杂交的核酸序列间具有，例如约85％，优选约90％、92％，更优选约95％、97％或100％互补性。本发明特别涉及在低或高度严格条件下与图1所示核苷酸序列杂交的核酸序列。
可以用各种方法选择与Chp序列杂交的核酸。例如可在预杂交溶液(6×SSC、0.5％SDS、100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA、5×Denhardt’s溶液和50％甲酰胺)中，将印迹(即含有核酸的基质)、芯片陈列及其它含有用核酸的基质30℃保温过夜，然后在杂交溶液(如6×SSC、0.5％SDS、100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺)中，按照已知方法于42℃下与可检测的Chp探针(见下文)杂交过夜。在允许小于5％bp错配，即选择有95％或更高序列相同性的高度严格条件下洗印迹(例如，65℃在0.1％SSC和0.1％SDS中洗两次，计30分钟)。高度严格条件的其它非限制性例子包括最后于65℃在含有30mM NaCl和0.5％SDS的含水缓冲液中洗涤。高度严格条件的另一个例子是在7％SDS、0.5M NaPO4，pH7，1mM EDTA中50℃杂交过夜，然后于42℃用1％SDS溶液洗一次或多次。本文所述的激活的Chp和显性失活Chp序列，在前述高度严格条件下与图1所示的野生型核酸序列及其寡核苷酸探针杂交。高度严格洗涤可允许小于5％的错配，但松弛或低严格洗涤条件(例如在0.2％SSC和0.5％SDS中37℃洗两次，30分钟)则允许达到20％的错配。低严格条件的另一个非限制性实例包括最后在含有30mM NaCl和0.5％SDS的缓冲液中42℃洗涤。
也可以按照Sambrook等人(Molecular Cloning，1989，第9章)所述的方法进行洗涤和杂交。按照Sambrook等人上述文献中所述，也可基于计算探针和其靶之间形成之杂合体的熔解温度(Tm)进行杂交。可选择严格条件，以分离探针(如Chp的寡核苷酸)和靶核酸(Chp突变蛋白或同系物)之间具有，例如至少大约95％，优选97％核苷酸互补性的序列，及其互补序列。
根据本发明，核酸或多肽可以包括与图1中列出的核苷酸或氨基酸序列有一处或多处差异。可用任何已知方法，如定点或随机诱变方法对核苷酸和/或氨基酸进行改变或修饰。
编码本发明的人Chp的核酸可包括在天然存在的Chp基因中出现的核苷酸，如天然存在的多态性、正常或突变的等位基因(核苷酸或氨基酸)、见于天然哺乳动物群体(如人、猴、猪、小鼠、大鼠或兔)中的突变。术语“天然存在”是指可从天然来源如动物组织和细胞、体液、组织培养细胞和法医学样品得到的核酸。天然存在的突变可包括核苷酸序列的缺失(如截短的氨基或羧基末端)、取代、倒置或加入。可按照本领域技术人员已知的核酸杂交法检测并分离这些基因。编码本发明的人Chp多肽的核苷酸序列可含有见于天然存在的基因、转录物或cDNA，如图1所示序列中的密码子，或者其可含有编码同样氨基酸序列的简并密码子。例如，可望改变序列中的密码子，以使序列更适于在预期宿主中表达。
本发明的核酸可包括，例如DNA、RNA、合成的核酸、肽核酸、修饰的核苷酸或它们的混合物。DNA可以是双链或单链的。根据不同的目的，如提高抗核酸酶(如RNA酶H)抗性，改善体内稳定性等，包括核酸的核苷酸可通过各种已知的键，如酯、氨基磺酸酯、硫酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等连接(如参见美国专利5,378,825)。
可对核酸进行各种修饰，如连接可检测标志(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、用于改善杂交、检测或稳定性的部分等。也可按照已知方法(如参见美国专利5,470,967、5,476,925和5,478,893)，使核酸附着在固相载体如硝酸纤维素、磁性或顺磁性微球(如参见美国专利5,411,863、5,543,289；例如包括铁磁、超磁、顺磁、超顺磁、氧化铁及多糖)、尼龙、琼脂糖、重氮化纤维素、乳胶固体微球、聚丙烯酰胺等上。
本发明的另一个方面涉及寡核苷酸或核酸探针。例如，可使用这样的寡核苷酸或核酸探针检测、定量分析或分离试验样品中的哺乳动物Chp核酸，或鉴定Chp同系物。在优选的实施方案中，可利用核酸作为寡核苷酸探针，例如用于PCR、差异展示、与cDNA库、表达库等组合。可为各种不同的目的，如研究、诊断、法医学等目的进行检测。为诊断目的，其可用于鉴定得自组织、细胞、体液等的样品中核酸序列的存在和含量。在优选的方法中，本发明涉及检测核酸的方法，包括在有效地实现靶和寡核苷酸间杂交的条件下，使试验样品中的靶核酸与寡核苷酸接触，并检测杂交情况。根据本发明的寡核苷酸也可用于扩增合成的核酸如PCR(例如参见Saiki et al.，1988，Science24153；美国专利4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications，Innis et al.，eds.，Academic Press，New York，1990)或差式展示(例如参见Liang et al.，Nucl.Acid.Res.，213269-3275，1993；美国专利5,599,672；WO 97/18454)。可联合其它基因如参予应力纤维形成、信号转导、生长、肿瘤发生的基因及本文提到的基因等的寡核苷酸来完成这种检测。例如，也可使用美国专利5,683,877、5,656,430及Wu等人(Proc.Natl.Acod.Sci.，898779-8783，1992)所述的错配DNA修复技术，利用寡核苷酸检测突变。
本发明的寡核苷酸可包括图1所示的任何连续核苷酸序列或其互补序列。本发明的寡核苷酸(核酸)可以有任何所需的大小，例如大约10-200、12-100、优选12-50、12-25、14-16，至少约15，至少约20个等核苷酸。寡核苷酸可具有非天然存在的核苷酸，如肌苷、AZT、3TC等。寡核苷酸与图1的序列可以有100％同一性或互补性，或者其可具有错配或核苷酸取代，如1、2、3、4或5个取代。根据本发明，寡核苷酸可以包括试剂盒，其中试剂盒包括所需的缓冲液(如磷酸盐或Tris缓冲液等)、检测组合物等。寡核苷酸可以是用本领域已知的放射性或非放射性标记物标记的或未标记的。
本发明的另一个方面是人Chp所特有的核苷酸序列。Chp的特有序列是指出现于Chp中如图1之核苷酸序列中，但很少或不常见于其它核酸，特别是哺乳动物如人、大鼠、小鼠等的核酸中没有的确定次序的核苷酸。独特的核苷酸序列包括编码氨基酸4-32、216-224和29-34的序列或其互补序列。这样的序列可作为探针用于本文或参考文献所述的方法中。其中包括有意义和反义核苷酸序列。可常规测定本发明的独特核酸序列。可使用包含这种独特序列的核酸作为杂交探针，以基于Northern印迹鉴定含核酸混合物的样品中人或小鼠Chp的存在。可在高度严格条件下(详见上述)进行杂交，以选择与探针至少有95％相同性(即互补性)的核酸，但也可以使用次严格条件。独特的Chp核苷酸序列也可在其5′或3′末端，与本发明中提到的各种核苷酸序列，包括Chp之其它部分或GFP酶等的编码序列，以及表达控制序列等符合读框的融合。
如已经讨论的，可如Sambrook等人(Molecular Cloning，1989)所述，依据所需的选择性不同，在不同的条件下进行杂交。例如，为了特异地检测人或小鼠Chp，可在寡核苷酸只与靶有100％互补性时才与之杂交的条件下，使寡核苷酸与靶核酸杂交。如果希望选择具有小于100％，例如至少约99％、97％、95％、90％、70％、67％核苷酸互补性的靶核酸；则可使用不同的杂交条件。
也可以从本发明的核酸制备反义核酸，优选是图1之编码序列的反义核酸。可以各种方式使用反义核酸，如调节或调制Chp的表达，如抑制Chp，以检测其表达，或进行原位杂交。可与美国专利5,576,208所述的方法类似使用这些寡核苷酸。为了调节或调制Chp的表达，可将反义寡核苷酸可操作地连接到表达控制序列上。
可按照任何已知方法标记本发明的核酸。可使用32P、35S、125I、3H或14C等一些常用放射性示踪物标记核酸。可使用放射标记的核苷酸、多核苷酸激酶(有或没有用磷酸酶去磷酸化)或连接酶(依据待标记的末端而异)，按照在3′或5′末端进行末端标记等已知方法，进行放射性标记。也可以使用非放射性标记，将本发明的核酸与具有免疫学性质的残基(如抗原、半抗原)、对某些试剂有特异亲合性(配体)、能够完成可检测的酶反应(酶或辅酶、酶底物或参与酶促反应的其它物质)，或具有特征性物理性质如萤光或发射或吸收预定波长光等的物质结合使用。
可使用本发明的核酸(包括寡核苷酸、反义核酸等)，以Northern印迹、PCR、原位杂交等各种技术检测完整器官、组织、细胞等中的Chp表达。这样的核酸特别适用于检测失调的表达，如Chp的细胞特异性和/或亚细胞改变。可以单独检测Chp水平，或者可与其它基因产物特别是脑和睾丸特异性基因产物，或参与细胞信号传导及调节的其它基因产物如PAK、PAK2、JNK、Ras、Rho等联合检测。
根据预期的目的，可以在体外和体内以各种不同的系统表达本发明的核酸。例如，可将核酸插入表达载体中，然后再导入适当的宿主内，并在适于实现由核酸编码之多肽的表达的条件下培养该宿主。有效表达的条件包括任何适于由宿主细胞生产多肽的培养条件，包括有效的温度、pH、培养基、加入到培养宿主细胞之培养基中的添加剂(如放大或诱导表达的添加剂，例如环己酰亚胺、丁酸酯，或编码核酸与dhfr基因相邻时加入氨甲蝶呤)、细胞密度、培养皿等。可用任何有效的方法，如裸DNA、磷酸钙沉淀、电穿孔、注射、DEAE-Dextran介导的转染、与脂质体融合、与提高其摄入细胞能力的药剂结合、病毒转染等方法将核酸导入细胞内。其中已导入了本发明之核酸的细胞为被转化的宿主细胞。核酸可以是染色体外的或整合到宿主细胞染色体内的。其可以是稳定的或瞬时的。选择与宿主细胞有相容性的表达载体。宿主细胞包括哺乳动物细胞(如COS-7、CV1、BHK、GHO、Hela、LTK、NIH3T3、293、PAE、人成纤维细胞、人原代肿瘤细胞、睾丸细胞)、昆虫细胞如Sf9(草地夜蛾、S.frugipeda)和果蝇、细菌如大肠杆菌、链球菌、杆菌、酵母如酿酒酵母(如cdc突变体、cdc25、细胞周期和分裂突变体，如ATCC Nos.42563、46572、46573、44822、44823、46590、46605、42414、44824、42029、44825、44826、42413、200626、28199、200238、74155、44827、74154、74099、201204、48894、42564、201487、48893、28199、38598、201391、201392)、真菌细胞、植物细胞、胚胎干细胞(如小鼠或人等哺乳动物)、成纤维细胞、肌肉细胞、神经元细胞等。表达控制序列同样是根据宿主相容性和所需目的，如高拷贝数、高含量、诱导、扩增、受控表达等因素选择的。可利用的其它序列包括如得自SV40、CMV、RSV的增强子、可诱导的启动子、细胞类型特异性元件，或允许选择性或特异性细胞表达的序列。可用于驱动其表达的启动子例如包括内源性启动子、细胞信号转导途径中其它基因的启动子、细菌细胞的MMTV、SV40、trp、lac、tac或T7启动子等；或者是酵母的α因子、醇氧化酶，或PGH启动子。
例如为调制Chp功能目的，可以在同一宿主中引入另一个有用的基因。其可以是正常的基因或发生变异，例如突变、嵌合或多态性等。这样的基因包括下列基因或信号传导途径相关的基因，如Ras家族、Cdc42Hs、Racs、Rhos、RAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、ROR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich综合征蛋白、FT酶、STE14、p53、Rb、Mt酶、GTP酶亚单位、Dbl、lbc、Ost、Lsc、STATS、Raf、src、Jun、fos、elk、MEK、Stell、Ste7等。
在核酸或蛋白质电泳或层析中，可使用本发明的核酸或多肽作为大小标志。可扫描序列的限制性位点、计算其大小并进行相应的限制性消化，以确定特定的限制性片段。可使用图1中所示的Chp cDNA作为核酸电泳中的分子量标志。
本发明的另一个方面涉及调节Chp基因参与的生物学途径，特别是癌症、过度增殖性疾病、肿瘤、神经元代谢(如神经元传递、轴突转运)、细胞周期疾病、生殖疾病(如涉及精子、卵、受精卵产生的疾病)，以及对细胞分裂素和生长因子的反应等病理学状态。一般说来，本发明涉及调节有Chp或其同系物参与的生物反应的方法，例如，Chp或其同系物参与最终导致细胞反应的生物化学途径。例如，本发明的一个方面涉及调制有Chp参与的信号转导的方法。因为这种信号转导可导致包括某些基因的转录激活在内的各种生物反应，所以本发明涉及通过调制Chp活性控制这些基因表达的方法。本发明中，可按照美国专利5,767,075、5,753,446、5,728,536、5,667,314和5,459,036中所述的任何方法，例如使用Chp、其生物学活性片段或其同系物。可施用抗Chp抗体、显性失活Chp基因(参见实施例)、PakR等各种药剂，调制由Chp介导的信号转导。
本发明还涉及鉴定用于调制哺乳动物Chp多肽或其生物学活性片段之PAK激酶刺激活性或JNK激酶刺激活性之化合物的方法，包括在试验化合物存在下，使Chp多肽或其活化的生物学活性多肽片段与JNK或PAK多肽或其生物学活性片段，在Chp多肽或其生物学活性片段可有效地刺激JNK或PAK的激酶活性的条件下接触，检测激酶活性并在有和没有试验化合物存在下比较激酶活性水平，以鉴定试验化合物是否可调制Chp多肽的刺激活性。可按任何次序完成这些步骤，必要时也可省略一个或多个步骤。也可利用附加步骤。
可按任何所需的方式进行激酶活性的检测。例如，可在接触步骤后分离JNK或PAK并检测激酶活性。可使用抗JNK或PAK抗体，或抗与JNK或PAK符合读框的融合之多肽表位的抗体，常规完成分离步骤。可使用适当的底物，32P-ATP，pH，缓冲液等，按照Bagrodia等人(J.Biol.Chem.27027995-27998，1995)或Coso等人(Cell 811137-1146，1995)所述的方法进行激酶测定。可使用c-Jun、GST-c-Jun(79)、GST-ATF2(96)等底物进行JNK激酶活性测定。当使用放射性ATP时，可用放射自显影等方法完成检测。
本发明还涉及分离能够调制哺乳动物Chp和PAK之调节区域间，或与Chp正常结合或相互作用之其它多肽间的结合之化合物的方法。在一个实施方案中，鉴定了用于调制Chp和PakR调节区域间结合的化合物。一种方法包括以下步骤在试验化合物可有效地调制Chp多肽与PakR调节区域间结合的条件下，使人Chp多肽，活化形式的Chp或其生物学上有活性的多肽片段(统称“多肽”)接触；并检测有和没有试验化合物存在时Chp多肽与RakR调节区域间的结合。可以按任何次序完成这些步骤，必要时，也可省去一个或多个步骤。也可利用其它附加步骤。
这些试验化合物可以是任何预计有调制活性的药剂。例如，这样的化合物可包括Chp的多肽衍生物或模拟物，其包括一个作为拮抗剂的Chp区域，干扰或竞争Chp与PakR结合区或与参予这种结合的效应物之间的正常相互作用。其它药剂例如包括天然存在的化合物、以组合化学方法合成的化学药品、核酸(如aptamers)、反义核酸、抗Chp区域抗体、刺激Chp、TPA及其衍生物的天然配体等。另外，可利用GTP交换因子(如GEFs)、GAPs，以及调节G蛋白信号传导家族的其它因子和多肽作为试验化合物，如p115 RhoGEF、Lsc、DRhoGEF2或其片段等(例如参见Kozasa et al.，Science 2802109-2111，26 Jun.1998)。
一般地说，这些方法、测定或试验可在便于检测的环境中进行以达到预期目的，即实现并调制激酶刺激作用或实现并调制结合。优选使试验化合物在可发生激酶刺激作用或结合的环境中与Chp多肽接触。所说的环境可以是体外或体内的。这样的环境包括有效的条件。可在没有试验化合物的情况下确定这些条件以确立基线活性，例如，象在对照中的情况一样。可以使用适当的盐、缓冲液、还原和/或氧化剂及pH值等常规选择有效的反应条件。
术语“调制”是指增强、提高、激发(作为激动剂)、促进、降低、减小、阻断或拮抗(作为拮抗剂)刺激活性。调制作用可使活性比基线值增加1、2、3、10倍等以上调制可使其活性降至基线值以下。
其活性可被调制的哺乳动物Chp多肽或其生物学活性片段(统称“多肽”)优选的是人Chp多肽或其生物学活性片段。Chp多肽可具有如图1所示的天然存在的序列、活化的序列(见上文，“活化的形式”，例如其中40位甘氨酸被缬氨酸取代的“活化形式”)；或其具有激酶刺激或结合活性的其它变体。哺乳动物Chp也可包括一个或多个其上述的区域，或与其它蛋白质区域的组合。也可鉴定无活性的Chp多肽(如参见有关显性失活等位基因的说明)，目的在于鉴定用于恢复其活性的化合物。
可使用在试验样品中、细胞溶解物中或全细胞中加入了各成分的混合物完成这些方法。例如，可在由Chp多肽、JNK或PAK多肽及其它成分组合成的反应混合物中检测激酶刺激活性或结合活性。在该方法中，可作为细胞成分或可溶性提取物，加入基本上纯化的Chp多肽。在各种情况下，Chp多肽可从天然来源、重组来源(即以基因工程技术生产“重组”多肽，例如，对质粒、载体、裸DNA等将其基因导入细胞系中，并在细胞中表达之)，或生产得到。可作为融合或非融合蛋白在哺乳动物细胞、昆虫细胞系或细菌中表达Chp多肽。
优选在由Chp编码序列(如cDNA、基因、基因组片段等)转化的细胞系中表达Chp。在后一种情况下，Chp是作为细胞的异源成分存在的；术语“异源”是指例如由转染、转化等过程被人工导入到细胞内的编码序列编码的Chp。Chp优选以高水平在细胞(细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等)中表达。可使用任何一种细胞系，包括正常的、突变的、温度敏感性突变的细胞系等。人Chp编码序列是优选的编码序列(参见图1)。
在优选的实施方案中，例如按照实施例中所述的方法检测激酶刺激活性。其中用可在细胞中表达的核酸转染宿主细胞，以将Chp和PAK或JNK编码序列导入所说的细胞(如酵母细胞)中。可将编码序列可操作地连接到在细胞内有功能的任何所需的启动子(如可诱导的和构成性启动子)上。PAK和JNK多肽优选包括一个作为“手柄”的标志，其在细胞中表达并受Chp刺激后可被重新得到用于激酶测定。该“标志”一般为多肽序列，如myc或已经产生抗体的血凝素。因此，“标志”可以是多肽表位，即可以产生抗体的任何多肽序列。如前所述，可使用野生型的、活化的Chp，或其生物学活性片段。一旦用编码序列转染了细胞，并在适当条件下保温一定时间后，即可溶解细胞并测定其激酶活性。“标志”有利于借助免疫沉淀重新得到JNK或PNK用于激酶测定。也可以使用原位技术对完整细胞进行激酶测定。可在转染前、转染后及启动子诱导后等任何时间将试验化合物加到细胞中。
如所讨论的，可以按照任何方法进行结合试验，例如可以使用标记的结合配体(如PakR)，在固相或液相中完成竞争结合试验。在优选实施方案中，可在完整细胞中完成鉴定调制Chp结合之化合物的方法。作为例证，在实施例中，利用在限定的温度下不能存活的温度敏感性酵母细胞系(如cdc25-2)。使Ras补充到质膜中，将使致死性表型得以恢复。为了利用这一优点，可以在构建Chp序列时使之含有符合读框的质膜导向序列，如v-src豆蔻酰化序列。用含有质膜导向序列的Chp多肽和含有Ras及能够结合Chp之区域的融合蛋白转化细胞系，可补救温度敏感性缺陷。Chp融合多肽俘获Ras融合蛋白，使之能够到达质膜。因此，通过在限定的温度下培养细胞，只有Chp结合到Ras融合蛋白上的细胞才能存活。除了Ras的生物学活性部分外，Ras融合蛋白可包括具有结合Chp能力的任何多肽，例如PakR，特别是PakR-Ras(61)δF(“饵”)。根据本发明，可以用编码Chp膜定向多肽和“饵”的核酸转化细胞。可以在任何时间向细胞中加入试验化合物。如果该化合物干扰Chp和其配体(如PakR)之间的相互作用，细胞将不能存活。按这种方法，可以鉴定拮抗剂及减少或降低结合的其它化合物。还可利用该方法鉴定那些调节结合的化合物(包括使用一系列不同浓度的试验化合物进行实验并计算LD50)。后者允许鉴定那些增强或降低Chp与其结合配体(饵)之间结合的化合物。
本发明还涉及鉴定可用于调制Chp多肽或其生物学活性多肽片段之细胞骨架再组织活性的化合物。在本方法的一个实施方案中，将有效地刺激细胞骨架再组织的Chp多肽或其生物学活性多肽片段导入细胞内。该方法包括在试验化合物足以有效调制多肽在刺激所说的细胞骨架再组织中的作用的条件下，使该细胞与试验化合物接触。可以用各种方法检测对细胞骨架的作用，其中包括使用可与细胞骨架的肌动蛋白或其它成分(如粘着斑蛋白)结合的药剂进行肉眼观察。这样的药剂包括标记的鬼笔环肽(如罗丹明、荧光素)、抗肌动蛋白或粘着斑蛋白的抗体，或识别Chp或其一部分(例如，在实施例中，它与可使用抗体检测的多肽融合)的抗体。可在有和没有试验化合物时看到细胞骨架(如参见Symons et al.，Cell 84723-734，1996；Nobes and Hall，Cell 8153-62，1995)。
调制Chp功能的另一种方法是调节参与其表达的途径，如调制其转录、mRNA稳定性、翻译、转录后修饰、加工(如在内部切割位点上切割)等。可使用不同的药剂如反义核酸、核酶、aptamer、合成的化合物，或天然存在的化合物等调节表达。
本发明还涉及鉴定其转录受Chp调制的基因的方法。例如，可将活化的Chp导入细胞中，并于Chp存在和不存在下分析其表达/转录模式。可进行常规的表达分析。例如，可以设计高密度寡核苷酸芯片排列，以监测表达。这样的芯片可含有人基因组的全部或其亚组(如参见Anderson et al.，Topics in Current Chemistry，Vol.194，pages117-129，1998；Southern，Current Biology 785-88，1996；Marshall and Hodgson，Nature Biotechnology 1627-31，1998)。
本发明还涉及鉴定可调制Chp之天然配体和信号的方法。例如，可使表达Chp的细胞与各种细胞产物接触，然后测定对其中有Chp参与之信号途径的激活。在一个实施方案中，在细胞中表达异源Chp；使这样的细胞与已用cDNA文库转化的细胞或其产物接触。按照本文所述的方法(如激酶活性、细胞骨架再排列等)常规检测Chp活化作用。如果被转化的细胞或其产物导致Chp活化，然后即可分离并鉴定这些被转化细胞中表达的cDNA。
可使用按上述任何测定方法鉴定的化合物于细胞、组织、整个生物体内、原位、体外(试管、固相载体等)、体内或在任何所需的环境中调制Chp活性。一般说来，具有这种体外活性的化合物可用于体内调制与Chp有关的生物学途径，如细胞周期障碍、应力反应、细胞凋亡、有丝分裂、分化、酵母感染(例如当调制酵母Chp同系物时)、致育疾病、神经学病变、癌症、肿瘤转移、肿瘤发生等。
为了治疗疾病，可将化合物或混合物配制成包含药用载体及技术人员已知的其它赋形剂的药物组合物(如参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，1990)。这样的组合物中可另外含有有效量的其它化合物。
本发明还涉及特异性识别Chp的抗体。Chp特异性抗体是指识别Chp内或包括Chp的限定的氨基酸序列，如图1所示之人序列的抗体。一般特异性抗体与见于图1的氨基酸序列，即，表位结合比与不同的表位结合的亲合力要高，例如，经免疫印迹测定或其它常规免疫测定所检测到的和/或测得的。因此，可使用对人Chp的表位特异的抗体检测样品中，例如含有人Chp基因产物的组织样品中该表位的存在，以将其与没有该表位的样品区分开。如Santa Cruz Biotechnology Inc.，Research Product Catalog中所述这些抗体是有用的，可相应地进行配制，例如配制成100μg/ml。可按照任何所需的方法制备重组的、嵌合的、人源化的多克隆或单克隆抗体。另外可参见已知的重组免疫球蛋白库筛选(Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，863833-3837，1989；Huse et al.，Science 2561275-1281，1989)和淋巴细胞群体的体外刺激(Winter and Milstein，Nature 349293-299，1991)等方法。例如，为了生产单克隆抗体，可给小鼠、山羊或兔皮下和/或腹腔内施用可有效地引发免疫反应量的，加有或不加有佐剂的具有图1所示序列的多肽。该抗体也可以是单链的，或者是FAb片段。抗体可以是IgG、亚型IgG2a、IgG1等。也可以施用裸DNA以产生抗体和免疫反应(如参见美国专利5,703,055、5,589,466和5,580,859号)。
用于诱导抗体的Chp或其片段本身或与载体组合不一定具有生物学活性，但必须具有免疫原活性。用于诱导Chp特异性抗体的肽可具有由至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。Chp氨基酸的缺片段，例如5个氨基酸的片段可以与另一种蛋白质如KLH，或另一种有用的载体，及用于生产抗体的嵌合分子相融合。
可利用几种不同的方法制备Chp特异性抗体。例如，一种方法包括从纯化的Chp(例如以反相HPLC分离法纯化的)得到多达75mg量的变性的Chp。可使用此变性的蛋白质采用标准程序免疫小鼠或免；其中用于免疫小鼠的适用量为大约100μg，而免疫兔则可能使用多达1mg。为了鉴定小鼠杂交瘤，可以放射性碘化变性的蛋白质，并根据其产生抗体的能力用于筛选潜在的小鼠B细胞杂交瘤。这种方法只需要小量的蛋白质，20mg即足以标记并筛选几千个克隆。
在另一种方法中，分析由cDNA推测的Chp氨基酸序列，以确定高免疫原性的区域。合成包括这些区域的多肽，并将其用于适当的免疫程序以产生抗体。按照Ausubel FM等人(1989，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.2，John Wiley & Sons)所述的方法进行分析以选择适当的表位。用于免疫的最佳氨基酸序列通常是在多肽的C末端、N末端和那些间插的，亲水性区域，当蛋白质处于其天然构象时这些区域很可能暴露于外部环境。一般是使用AppliedBiosystems 431A型肽合成仪，以fmoc化学保护法合成长度约15个残基的选定的肽，并使之与马来酰亚氨苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS；参见Ausubel FM等人，上述文献)反应，以偶联到匙孔血蓝蛋白(KLH，Sigma)上。必要时，可在肽的N末端导入半胱氨酸以与KLH偶联。用肽-KLH复合物加弗氏完全佐剂免疫兔。将肽结合到塑料固相上，用1％BSA封闭后再与抗血清反应，洗涤后再与标记的(放射性或荧光标记的)、亲和纯化的特异性山羊抗兔IgG反应，以检验所得到的抗血清的抗肽活性。
也可使用标准技术制备并筛选杂交瘤。用标记的Chp筛选，以鉴定能产生有预期特异性之单克隆抗体的融合体，从而检测所需的杂交瘤。在典型方法中，用亲和纯化的特异性兔抗小鼠(或适当的抗Ig)抗体(10mg/ml)包被平板(FAST，Becton-Dickinson，Palo Alto，Calif.)的各小孔。用1％BSA封闭包被的小孔，洗涤并暴露于杂交瘤的上清液。保温后再与标记的Chp(1mg/ml)接触。产生抗体的克隆将与一定量标记的Chp结合。扩展该克隆并以有限稀释(1细胞/3孔)对其进行2轮克隆。将克隆化的杂交瘤注入原始的小鼠体内以产生腹水，并以蛋白A柱亲和层析法从小鼠腹水液中纯化单克隆抗体。按照Harlow和Lane(1988，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory)，或Goding(1986，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，2nd Ed.Academic PressN.Y.)所述的标准方法制备具有至少108M、优选109-1010或更强的亲合性的单克隆抗体。
产生抗体的有用序列包括KLNAKGVRTLSRCRWKK(氨基酸215-231)、RELSEAEPPPLPASTPPPRRRSAPPELG及其片段。
特定的Chp抗体可用于诊断以Chp的量或分布上的差异为特征的前病理学状态、及慢性或急性疾病。Chp的诊断检验包括利用抗体和标记物检测人(或小鼠等)体液、组织或其提取物中的Chp。
可以使用经过修饰或没修饰的本发明的多肽和抗体。通常可将多肽和抗体与提供可检测信号的物质共价或非共价连接进行标记。科技文献和专利文献中均已广泛报导过各种标记物和连接技术。适用的标记包括放射核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁性颗粒等。美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中提供了使用这些标记的技术教导。另外如美国专利4,816,567(并入本文作为参考)中所述，可以生产重组免疫球蛋白。
使用Chp特异性多克隆或单克隆抗体，检测可溶性或膜结合的Chp的多种方法是本领域中已知的。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选法(FACS)。优选使用可与EC上两个非干扰性表位反应的单克隆抗体进行以两位点单克隆为基础的免疫测定，但也可以利用竞争性结合测定法(如参见Maddox，Del.etal.(1983)J.Exp.Med.1581211)。
可以多种方式使用与Chp结合的抗体和其它配体，包括作为治疗、诊断及研究工具，例如用Western印迹法、ELISA、RIA或免疫沉淀法定量动物、组织或细胞内Chp多肽的水平、鉴定其细胞定位和/或分布、纯化Chp多肽或其部分、调节其功能等。本发明涉及这样的测定方法，进行该方法所用的组合物和试剂盒。可使用本发明的抗体，按照上述和其它方法检测组织、细胞、体液、血液、尿液、脑脊液等各种样品中的Chp多肽或其片段。本发明的方法包括a)在本领域已知可有效地实现结合的条件下，使配体与图1所示的肽接触，b)检测配体和肽之间的特异性结合。“特异性结合”是指配体连接到如图1所包括的特定氨基酸序列或其衍生物上。
可以使用Chp特异性抗体以免疫亲和层析法纯化天然的或重组的Chp。一般说来，可将抗Chp抗体共价偶联到活化的层析树脂上，以构成免疫亲和柱。
以硫酸铵沉淀法或固相化蛋白A(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)纯化法从免疫血清中制备多克隆免疫球蛋白，并用同样的方法从小鼠腹水液中制备单克隆抗体。将部分纯化的Ig共价连接到层析树脂例如CnBr活化的Sepharose(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上。按照制造商推荐的方法将抗体偶联到树脂上，封闭树脂，然后洗涤衍生的树脂。
利用免疫亲和柱从细胞中制备含Chp部分，以纯化Chp。可以溶解全细胞或经加入去污剂进行差速离心或按其它本领域熟知的方法制得的亚细胞部分，以得到该制剂。另外，含有信号序列的可溶性Chp可以有用的量被分泌到培养细胞的生长培养基中。
使含有可溶性Chp的制剂通过免疫亲和柱，并在含去污剂的高离子强度缓冲液条件下洗柱，以优先吸附Chp。然后在破坏抗体/Chp结合的条件(如pH2-3或有高浓度离液剂如尿素或硫氰酸离子存在的缓冲液)下洗脱柱，并收集Chp。
另外，也可使用合成肽库或aptamers制备可与本发明的Chp多肽或其衍生物结合的配体(如参见Pitrung et al.，美国专利5,143,854；Geysen et al.，1987，J.Immunol.Methods 102259-274；Scott et al.，1990，Science 249386；Blackwell etal.，1990，Science 2501104；Tuerk et al.，1990，Science 249505)。
也可使用抗体或其衍生物抑制Chp或其片段的表达。可以单独或与其它基因产物一起检测Chp多肽的水平。具体地说，可以将Chp多肽的量(例如其表达水平)与同一或不同样品中其它多肽(如肌动蛋白)的量进行比较(例如求出两者间的比例)。一般说来，可按照例如美国专利5,397,712、5,434,050、5,429,947中所述的方法将Chp特异性试剂用于诊断和/或法医学研究。
本发明还涉及如按照美国专利5,434,050中公开的方法制备的Chp多肽。例如可在结合试验中，于体内、体外或原位系统等中使用标记的多肽鉴定与Chp结合或连接的物质，示踪Chp在细胞中的运动。
可以分离本发明的核酸、多肽、抗体、Chp、配体等。术语“分离的”是指物质以一种在其原有环境中见不到的形式存在，例如更浓缩、更纯，并与其它成分分开等。分离的核酸可包括具有从活体动物染色体DNA中分离之Chp序列的核酸。该核酸可以是载体的一个部分，或被插入到染色体中(借助特异性基因导向，或在其正常位置以外的位置上发生随机整合)，并且以其在天然环境中见不到的形式存在时仍是被分离的。本发明的核酸或多肽也可以是基本上纯化的。“基本上纯化的”是指核酸或多肽是分离的并且基本上没有其它核酸或多肽，即该核酸或多肽是原始的和有活性的成分。
本发明还涉及转基因动物，如含有Chp的非人哺乳动物，例如小鼠。可以按照已知的方法制备转基因动物，这些方法包括将重组基因注射到1细胞胚胎的前核中、在胚胎干细胞中掺入人工酵母染色体、基因导向方法、胚胎干细胞技术等(如参见美国专利4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.777380-7384，1980；Palmiter et al.，Cell 41343-345，1985；Palmiter et al.，Ann.Rev.Genet.，20465-499，1986；Askew et al.，Mol.Cell Biol.134115-4124，1993；Games et al.，Nature 373523-527，1995；Valancius andSmithies，Mol.Cell.Biol.111402-1408，1991；Stacey et al.，Mol.Cell.Biol.141009-1016，1994；Hasty et al.，Nature350243-246，1995；Rubinstein et al.，Nucl.Acid Res.212613-2617，1993)。可将本发明的核酸导入小鼠(Hogan et al.，1986，Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)、猪(Hammer et al.，Nature 315343-345，1985)、羊(Hammer et al.，Nature 315343-345，1985)、牛、大鼠或灵长类等非人哺乳动物体内。也可参见，例如Church，1987，Trends in Biotech.513-19；Clark et al.，1987，Trends in Biotech.520-24；和DePamphilis et al.，1988，Bio Techniques，6662-680。另外，市场上可委托生产转基因大鼠和小鼠。可使用这些转基因动物作测试Chp功能的动物模型，作为蛇的食物，作为检测株系来源的遗传标记(即，其中已插入了Chp或其片段)等。可按照美国专利申请08/866,058和09/000,846中所述方法制备和使用这样的转基因动物(如Chp剔除的动物)。含有Chp突变体(如活化的Chp)或Chp剔除的转基因动物可合并有其它基因突变，如参予同样或相似信号传导途径之基因的剔除或突变。这样的基因包括Ras、Cdc42Hs、Racs、Rhos、PAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、POR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich综合征蛋白、FT酶、STE14、p53、Rb、Mt酶、GTP酶亚单位、Dbl、lbc、Ost、Lsc，以及上述、下述、或本文所引文献中提到的任何基因。根据使用目的和所需表型的不同，动物可以是纯合的或杂合的。
一般地说，可以按照美国专利5,501,969、5,506,133、5,441,870；WO 90/00607和WO 91/15582中所述方法制备和使用本发明的核酸、多肽、抗体等。
有关本发明的核酸、多肽、抗体等的其它方面可参见分子生物学、蛋白质科学及免疫学的教科书(如参见Davis et al.，Basic Methodsin Molecular Biology，Elsevir Sciences Publishing，Inc.，N.Y.1986；Hames et al.，Nucleic Acid Hybridization，IL Press，1985；Sambrook et al.，Molecular Cloning，1989；FM.Ausubelet al.(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.；Nicholas C.Dracopoli et al.(编)，CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley & Sons，Inc.；JohnE.Coligan et al.(编)，Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons，Inc.)。
实施例与PAK特异性相互作用的新的Cdc42Hs同系蛋白质(chp)的分离。我们使用了改进的Sos补充系统(SRS)(Aronheim et al.，Mol.Cell Biol.173094-3102，1997)鉴定与PAK65相互作用的蛋白质。这个新的二杂合系统有助于检测质膜内表面上的蛋白质—蛋白质相互作用。SRS系统是基于将Ras交换因子Sos导向质膜即足以拯救酵母中的温度敏感性cdc25等位基因这一发现而建立的。利用这一发现，我们通过将膜定向的哺乳动物cDNA库转化到带有与Ras融合的饵的cdc25-2温度敏感性酵母菌株中构建了新的二杂合酵母筛选系统(Aronheim et al.，Mol.Cell Biol.173094-3102，1997)。饵与膜上展示的蛋白质之间的相互作用将导致Ras向质膜中的补充，进而增加细胞存活性。
将PAK2调节区(PakR)融合在缺少CAAX盒之RasL61的N末端，并亚克隆到pADNS质粒中，定名为PakR-Ras(61)F。将大鼠脑垂体cDNA文库构建到含有如前所述的V-src豆蔻酰化序列(Aronheim et al.，Mol.Cell Biol.173094-3102，1997)的pYES载体中。文库的表达处于GAL1、半乳糖可诱导启动子的控制之下。用文库和PakR-Ras(61)F融合体转化细胞，使大约0.5×106转化体于24℃生长4天，然后铺敷在36℃半乳糖平板上。分离5个以半乳糖依赖方式生长的克隆，然后检查相互作用的特异性。1、2、5和6号克隆只有当用PakR-Ras(61)F饵共转化时才能够于36℃生长，而用无关的饵Ras(61)F-JDP2共转化时则不能生长，这一结果提示其相互作用依赖于饵PAK65。相反，用两种饵共转化时，8号克隆能够于36℃下生长。此后，核苷酸序列揭示了8号克隆是Sos的同系物，后者本身被导向膜时，能够激活酵母Ras并使之在有限制的温度下生长。1、2和5号克隆完全相同，并与GTP酶、Cdc49Hs和Rac1表现有序列同源性。因为该cDNA在我们的筛选中独自出现3次，所以我们决定对该克隆作进一步的分析。下文将描述6号克隆的表征。该克隆与Cdc42Hs表现有大约52％的序列相同性，因此将其定名为Cdc42Hs同系蛋白质—Chp，其编码约36kDa的蛋白质。令人感兴趣的是，除了同源于Cdc42Hs外，Chp在N和C末端还含有与Cdc42Hs无关的序列。在Chp的N末端发现了Chc42Hs中所没有的另外28个氨基酸。该附加序列包括SH3结合区所特有的聚脯氨酸。Chp的C末端并不含有所有Ras相关GTP酶均保留的经典的CAAX盒(Didsbury et al.，J.Biol.Chem.26416378-16382，1989)。CAAX区负责脂质修饰和Rho家族中所有小GTP酶的膜附着。相反，Chp则含有与数据库中已知蛋白质没有任何序列同源性的32个附加氨基酸。
Chp转录。为了检测Chp的组织分布，我们使用Northern印迹分析法(Clontech)，使相当于Chp之GTP酶区域(相应于氨基酸102-151)的特异性探针与大鼠多种组织的mRNA杂交。该区域与家族的其它成员只有62％相同性。测知大约1.5Kb的单一种类mRNA在脑和睾丸中以高水平存在，而在脾和肺组织中则含量较低。令人感兴趣的是，有人报导了Rac相关蛋白质的小尺寸mRNA(1.0和1.4Kb)(Didsburyet al.，J.Biol.Chem.26416378-16382，1989)。与相当于C和N末端及全长度Chp的探针杂交得到相似的结果。
Chp表达。为了确定Chp的大小和Chp在293细胞系中的表达，产生抗相当于位于C末端的Chp独特区域的肽(氨基酸216KLNAKGVRTLSRCRWKK232)的多克隆抗体。为了比较内源性Chp与克隆的cDNA的大小，我们将Chp cDNA融合到myc表位标志序列上，并使用该质粒在293细胞中过表达Chp。在SDS-PAGE上分离被转染或未被转染之293细胞的全细胞提取物，然后用抗myc抗体进行Western印迹分析，并将硝酸纤维素滤膜与亲和纯化的抗Chp抗体一起保温。结果表明，被转染细胞产生的Chp的大小相同于使用抗Chp抗体在未被转染之293细胞系中测得的蛋白质。
PAK与活化的Chp突变体的相互作用。Pak调节区(PakR)与活化形式的Rac和Cdc42相互作用。我们选择试验PakR与Chp的结合。基于与Cdc42及其它Rho GTP酶的序列同源性，我们制得了预期在其GDP/GTP结合状态下不同的各种Chp突变体。为了制得组成上有活性的Chp，我们用缬氨酸取代甘氨酸40。在Rac和Cdc42Hs中第12位(G12V)上等同氨基酸的取代产生了GTP酶水解作用有缺陷的活性等位基因。另外，我们对Chp上的等同位置进行了突变并将氨基酸45取代为天冬酰胺。将其它Rho GTP酶中相应第17位的氨基酸取代为天冬酰胺，产生了锁定为GDP结合无活性形式的显性失活等位基因(Erickson et al.，J.Biol.Chem.27126850-26854，1996)。用编码融合有豆蔻酰化序列之不同Chp突变体的质粒连同PakR-Ras(61)F饵共转染cdc25-2酵母菌株。组成上有活性的Chp(Chp Ac.)和野生型Chp(WT Chp)与PakR相互作用，而与显性失活形式的Chp不发生这种相互作用。同样，组成上有活性的和野生型的Cdc42Hs与PakR，但不与显性失活Chp相互作用。特别是在同样测定条件下，只有活化的突变体Rac1与PakR，但不与野生型或显性失活RacN17相互作用。这一数据提示，Chp与PakR之间的特异性相互作用取决于GTP酶的活化状态。野生型Chp与Cdc42Hs，但不与Rac1相互作用，可能是由于这些GTP酶对酵母核苷酸交换因子Cdc24有不同的敏感性。然后Cdc42Hs和Chp与推测的交换因子相互作用将给GTP酶装上GTP，从而产生活性形式的Cdc42Hs和Chp。
Chp C末端区对Pak65结合的作用。为了研究Chp氨基和羧基末端序列的作用，我们进一步删除C和/或N末端以使Chp Ac突变。将Chp突变体连同PakR饵一起转化到cdc25-2酵母菌株中。缺少其C末端区域的Chp不能结合PakR，而删除N末端则对PakR结合没有显著的影响。这一结果提示延长的C末端直接参与结合RakR，或者丢失该区域将导致阻止RakR结合的Chp构象改变。
Chp选择性激活JNK MAP激酶途径。我们和其它组的研究显示，组成上有活性的Cdc42HsV12和RacV12刺激JNK和p38MAP激酶级联(Minden et al.，Cell 811147-1157，1195；Coso et al.，Cell811137-1146，1995)。为了试验是否Chp也对JNK级联具有相似作用，我们用各种不同形式的Chp连同编码血凝素表位(HA)并带有JNK2、ERK2或p38标记的表达载体共转染293细胞。从被转染细胞的提取物中免疫沉淀出JNK、ERK和p38，然后使用常规底物进行体外激酶测定。野生型和活化的Chp均可刺激JNK激酶。相反，显性失活形式的Chp并不激活HeLa细胞中的JNK途径。如Cdc42和Rac GTP酶的情况一样，Chp并不显著地激活ERK2。另外，令人惊奇的是，Chp并不诱导激活p38激酶。这些数据提示，与Rac和Cdc42Hs相反，Chp是JNK-MAP激酶级联的，而不是ERK或p38途径的选择性激活剂。
Chp与COP共定位在高尔基氏器上。为了确定Chp的细胞定位，我们将连接到哺乳动物表达载体上的Myc标记的Chp微量注入PAE细胞中，并用抗myc抗体着染细胞以显示Chp的表达。Chp无例外地浓集到核附近组装高原基氏器的部位。用识别高尔基蛋白的抗体-COP对所注射的细胞进行共染色，可见Chp与外被体蛋白-COP共定位于高尔基氏器处。另外，最近证明内源性Cdc42Hs与COP共定位于高尔基氏器上(Erickson et al.，J.Biol.Chem.27126850-26854，1996)。
Chp参与诱导片状伪足。为了试验Chp是否在控制肌动蛋白细胞骨架中起作用，我们将编码活化的Chp突变体的质粒微量注射到细胞中，并染色显示Chp表达或聚合的肌动蛋白。Chp浓集在高尔基氏器核附近的一侧，并且被注射的细胞出现了形态学改变诱导了片状伪足。另外，可见注射Chp的细胞中缺少应力纤维。有关各种Chp突变体介导的特异性形态学改变的充分表征，尚有待进一步研究。
材料和方法质粒和构建体Chp表达载体将Chp cDNA与myc表位标记符合读框的融合到pCan哺乳动物表达载体中，以产生哺乳动物细胞表达载体。将ChpcDNA与Src豆蔻酰化信号符合读框的融合到pYes2表达载体(Invitrogen Ins)中，以产生酵母表达载体。按常规方法将编码不同的Cdc42突变体的质粒亚克隆到pYes2表达载体中。
Chp诱变按照制造商的说明使用Chameleon诱变试剂盒(Stratagene Inc.)进行Chp诱变。
Northern印迹分析使用购自Clontech公司的试剂盒并按生产商提供的使用说明进行Northern印迹分析。用随机引物标记试剂盒(Stratagene Inc.)产生特异性探针。将探针与滤膜于68℃保温2小时。室温下用含有0.1％SDS的2×SSC将滤膜洗3次，然后再于55℃用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗两次。
Western印迹分析在十二烷基硫酸钠(SDS)-12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分辨蛋白质提取物(50g/泳道)，转印到硝酸纤维素膜上后；用抗myc抗体或亲和纯化的Chp抗体探查之。在第二次保温过程中，使用结合到辣根过氧化物酶上的抗小鼠抗体或蛋白A。使用SuperSignal化学发光反应试剂盒(Promega Inc.)显现硝酸纤维素膜印迹。针对连接到KLH上的C末端肽215KLNAKGVRTLSRCRWKK 213产生Chp抗体。将10mg肽偶联到10ml琼脂糖凝胶上进行抗体纯化。用PBS平衡凝胶后将粗血清过凝胶柱，洗涤后用甘氨酸缓冲液(pH2.0)洗脱抗体。
酵母遗传操作使用已知方法(参见Aronheim et al.，Mol.CellBiol.173094-3102，1997)进行常规酵母转染和遗传操作。
转染和体外激酶测定用CaPO4沉淀法转染293细胞。用驱使不同的Chp突变体(5g)表达的pCan表达质粒及驱使不同的HA表位标记的激酶(5g)表达的Sr表达载体共转染细胞。转染后48小时，提取蛋白质并按已知方法(Hibi et al.，Genes Dev.172135-2148，1993)进行体外激酶测定。用于HA-ERK2、HA-JNK2和HA-p38的下列质粒和下列纯化的底物(5g/测定)分别是髓鞘碱性蛋白(MBP)、GST-c-Jun1-79和GST-ATF2。
微量注射和免疫荧光显微镜检在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养PAE细胞并铺板在盖玻片上。将使用注射缓冲液(5mM谷氨酰胺、130mM KCL)稀释到50ng/ml浓度的编码Chp的表达载体微量注射到约100个亚汇合PAE细胞的核中。将被注射的细胞37℃保温16-20小时并在4％甲醛中固定。用含有0.1％Triton X-100的PBS透化细胞并于原始抗Myc或抗COP单克隆抗体(Dr.Richard Khan提供)存在下保温60分钟。用含有0.1％Triton X-100的PBS洗盖玻片并与第二抗体(德克萨斯红缀合的抗小鼠抗体)保温30分钟。为了看到F肌动蛋白，再次洗细胞并与FITC缀合的鬼笔环肽一起保温。在配有适于荧光检测的滤光片的显微镜(Zeiss Axiophot)上进行荧光显微照相。
权利要求
1.分离的全长度人Chp多肽，或其生物学活性多肽片段。
2.权利要求1的分离的Chp多肽，其中所说的多肽具有PAK调节区结合活性，PAK激酶刺激活性，JNK激酶刺激活性，细胞骨架再组织活性，或Chp特异性免疫原活性。
3.权利要求1的分离的人Chp多肽，其包括图1中列出的氨基酸1至氨基酸236。
4.权利要求1的分离的人Chp多肽，其包括图1中列示的氨基酸1至氨基酸236并具有图1中列出的DNA序列。
5.权利要求1的分离的人Chp的生物学活性片段，其中所说的片段包括如图1所列示的氨基酸1-32、32-211、211-236和215-231。
6.权利要求1的分离的人Chp的生物学活性片段，其中所说的片段基本上是由图1所列示的氨基酸1-32、32-211、211-236和215-231组成的。
7.分离的全长度Chp，或其生物学活性片段，其由在高度严格条件下与图1所示DNA序列杂交的，并且与所说的DNA序列具有至少95％序列相同性的核苷酸序列的互补序列所编码。
8.权利要求7的分离的全长度Chp或其生物学活性片段，其可得自天然来源。
9.权利要求7的分离的全长度Chp，除了氨基酸40为缬氨酸或氨基酸45为天冬酰胺以外，其氨基酸序列如图1所示。
10.权利要求7的分离的全长度Chp或其生物学活性片段，其具有PAK调节区结合活性，PAK激酶刺激活性，JNK激酶刺激活性，细胞骨架再组织活性，或Chp特异性免疫原活性。
11.包括编码全长度人Chp多肽或其生物学活性多肽片段之核苷酸序列的分离的核酸。
12.权利要求11的分离的核酸，其中所说的编码的多肽具有PAK调节区结合活性，PAK激酶刺激活性，JNK激酶刺激活性，细胞骨架再组织活性，或Chp特异性免疫原活性。
13.权利要求11的分离的核酸，其中核苷酸序列编码如图1所示的氨基酸1至氨基酸236。
14.权利要求11的分离的核酸，其具有图1中所示的核苷酸序列。
15.权利要求11的分离的核酸，其中核苷酸序列被可操纵地连接到表达控制序列上。
16.权利要求11的分离的核酸，其中核酸不中断地编码所说的多肽。
17.权利要求11的分离的核酸，其中核酸进一步包括可检测的标记。
18.在被转化的宿主细胞中表达由核酸编码的人Chp多肽的方法，包括在有效地表达所说多肽的条件下培养包含权利要求11之核酸的被转化的宿主细胞。
19.权利要求18的方法，其中所说的宿主细胞是哺乳动物细胞。
20.权利要求18的方法，其中所说的宿主细胞是酵母。
21.权利要求18的方法，其进一步包括分离含有所说多肽之所说宿主细胞的膜部分。
22.用权利要求18的方法生产的分离的人Chp多肽。
23.含有权利要求11的核酸的被转化的宿主细胞。
24.包含权利要求11之核酸的载体。
25.在高度严格条件下与图1所示的核酸序列或其互补序列杂交的，并且与所说的核酸有至少95％序列相同性的分离的核酸或其互补序列。
26.权利要求25的分离的核酸，其序列编码具有PAK调节区结合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、细胞骨架再组织活性、或Chp特异性免疫原活性的多肽。
27.基本上由选自图1所示核苷酸序列之12-100个碱基对的任何连续序列或其互补序列组成的分离的核酸。
28.权利要求27的分离的核酸序列，其进一步包括可检测的标记。
29.权利要求27的分离的核酸，在所说的序列中至少有1个但不超过5个核苷酸取代，并且在高度严格条件下与之或其互补序列杂交。
30.鉴定能够调节人Chp多肽或其生物学活性多肽片段之JNK激酶刺激活性或PAK激酶刺激活性的化合物的方法，其包括在试验化合物存在下，使人Chp多肽或其生物学活性多肽片段，在使所说的Chp多肽可有效地刺激JNK或PNK之激酶活性的条件下，与JNK或PAK多肽或其生物学活性片段接触，检测所说的激酶活性，并且比较有和没有试验化合物存在时的激酶活性量，以鉴定试验化合物是否调节所说的Chp多肽的所说刺激活性。
31.权利要求30的方法，其中所说的接触是在其中已导入并表达了编码所说Chp多肽和所说JNK或PAK多肽之核酸的细胞中进行的。
32.权利要求31的方法，其中所说的JNK或PAK多肽进一步包括多肽表位。
33.权利要求32的方法，其进一步包括溶解含有所说的已表达的Chp多肽和JNK或PAK多肽的所说细胞；在使所说的抗体有效地结合所说的表位以形成复合物的条件下，使所说的溶胞产物与抗多肽表位的抗体接触；分离所说的复合物，并且检测所说的分离的复合物中的激酶活性。
34.权利要求33的方法，其中所说的多肽表位是读框内与所说的JNK或PAK多肽融合的myc或血凝素多肽序列。
35.权利要求30的方法，其中所说的人Chp是经用缬氨酸取代40位氨基酸即甘氨酸而修饰的。
36.分离用于调节人Chp与PakR调节区之间结合的化合物的方法，其包括在使所说的分子有效地调节所说的Chp多肽与所说的PakR调节区域之间结合的条件下，使人Chp多肽或其生物学活性多肽片段与试验化合物接触；并且在有和没有所说的试验化合物存在下，检测所说的Chp多肽与所说的PakR调节区域之间的结合。
37.权利要求36的方法，其中所说的接触是在其中已导入并表达了编码所说的Chp多肽和PakR调节区域之核酸的酵母细胞系中进行的。
38.权利要求37的方法，其中所说的Chp多肽是在读框内与N末端V-src豆蔻酰化序列融合的，并且所说的PakR调节区是读框内与Ras融合的。
39.权利要求38的方法，其中所说的酵母细胞系是cdc25-2。
40.权利要求36的方法，其中所说的接触是在其中已导入并表达了编码所说的Chp多肽和PakR调节区域的核酸的酵母细胞系中进行的；其中所说的Chp多肽可操纵地连接到可诱导启动子上并在读框内与N末端V-src豆蔻酰化序列融合，所说的PakR调节区在读框内与Ras融合。
41.鉴定可调节人Chp多肽或其生物学活性片段之细胞骨架再组织活性的化合物的方法，其包括在细胞内导入可有效地刺激所说细胞的细胞骨架再组织的活化形式的人Chp多肽，或其生物学活性片段；在使试验化合物有效地调节所说多肽在刺激所说细胞之细胞骨架再组织中的作用，从而可观察所说的细胞骨架以检测这种作用的条件下，使所说的细胞与所说的试验化合物接触；并且在有和没有所说的试验化合物存在下观察所说的细胞骨架。
42.对人Chp的多肽序列特异的分离的抗体。
43.权利要求42的分离的抗体，其与选自图1的氨基酸序列结合。
44.权利要求42的分离的抗体，其中所说的多肽序列是KLNAKGVRTLSRCRWKK。
全文摘要
本发明涉及分离的全长度Chp多肽,其生物学活性多肽片段,及编码该多肽或其片段的核酸。该多肽在调节细胞信号传导和信号转导途径中具有各种不同的活性,如包括PAK调节区域结合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、细胞骨架识别活性,或Chp特异性免疫原活性。本发明涉及Chp或其同系物的所有方面,包括调制剂、激活剂、配体等的测定法。
文档编号C12N5/10GK1367836SQ99816445
公开日2002年9月4日 申请日期1999年8月9日 优先权日1998年8月7日
发明者A·阿博, A·阿诺希姆 申请人:昂尼克斯药物公司