专利名称：细菌致病基因的全局调控物;作为抗病性工程化的靶的细菌自体诱导物失活蛋白的制作方法
相关申请的交叉参考不适用。联邦资助研究或开发的声明不适用发明背景1.发明领域本发明涉及细菌致病基因的全局调控物及其赋予疾病抗性的用途。
2.相关现有技术的描述本申请详细说明之后附有参考文献目录，所列参考文献均引入本文作参考。
细胞之间经小信号分子的通讯不仅对于多细胞活生物体如动物和植物是至关重要的，其在单细胞生物体如细菌的家族成员之间的功能协调方面也起重要作用。近几年来的飞速进展已清楚表明，已知为自体诱导物(autoinducers，AIs)的N-酰基-高丝氨酸内酯是革兰氏阴性细菌中广泛保守的信号分子。AIs首先在海洋细菌菌种弧菌的生物发光性调控中被发现(Eberhard等，1981；Cao and Meighen，1989)。近年来，已在许多革兰氏阴性细菌中鉴别了AIs。已发现AIs参与一系列生物学功能的调控，包括根癌农杆菌的Ti质粒接合转移(Zhang等，1993)，胡萝卜软腐欧文氏菌、铜绿假单胞菌、斯氏欧文氏菌、嗜线虫致病杆菌、菊欧文氏菌、青枯假单胞菌和野油菜黄单胞菌的毒力基因的诱导(Jones等，1993；Passador等，1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman and Farrand，1995；Barber等，1997；Clough等，1997；Costa and Loper，1997；Dunphy等，1997；Nasser等，1998)，致金色假单胞菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中抗生素产生的调控(Pierson等，1994；Costa and Loper，1997)，液化沙雷氏菌的游动性的调控(Eberl等，1996)，以及荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成(Allison等，1998；Davies等，1998)。已知有更多的细菌菌种产生AIs，但是相关的生物学功能尚不清楚(Bassler等，1997；Dumenyo等，1998；Cha等，1998)。
不同的细菌菌种可产生不同的AIs。所有的AI衍生物均具有相同的高丝氨酸内酯基元，但是可以在其酰基长度和结构上不同。AI介导的基因调控系统中的关键组分上LuxI和LuxR型蛋白质。现已证明LuxI型蛋白质是以酰基-ACP和AdoMet(S-腺苷甲硫氨酸)为底物的自体诱导物合酶(More等，1996；Schaefer等，1996)。LuxR型蛋白质推测同时是AIs的受体以及与lux启动子紧邻上游的DNA结合的AI依赖性转录调控物(Meighen，1994；Sitnikov等，1995)。已鉴别了一20个核苷酸的反向重复序列，其中心位于发光操纵子的转录起始位点上游44个核苷酸处，这一序列称为lux盒，其是LuxR转录激活所需的并且可能是LuxR结合位点(Fuqua等，1994)。在至少三个TraR调控的启动子的上游发现了类似的18bp tra盒，破坏这些元件会破坏TraR的转录激活(Fuqua and Winans)。
LuxR型蛋白质似乎由两个模序组成(Choi and Greenberg，1991；Hanzelka and Greenberg，1995)。它们的羧基末端区含有19个氨基酸的保守短序列，其是推断的探针型螺旋—转角—螺旋基序，预测参与与靶启动子的结合。已推测了激活的一般机制，通过该机制LuxR型蛋白质的N-末端结构域负性作用以防止其C-末端结构域与靶DNA结合位点之间的相互作用。这一抑制可通过自体诱导物配体的作用而解除。一强有力的证据是LuxR的N-末端结构域的缺失导致产生luxR的组成型激活等位基因，而除去了部分预测的DNA结合结构域的更大的缺失破坏了转录激活(Choi and Greenberg，1991)。但是，其它的成员可能使用不同的机制。最近的遗传学研究表明EsaR和ExpR可能是其靶基因的阻遏物而非激活物。由EsaR和ExpR阻遏的基因的表达通过自体诱导物而增加(Beckvon Bodman and Farrand1995；Throup等，1995)。看起来这些蛋白质与它们在启动子区的靶位点的结合导致阻遏，因此自体诱导物配体可发挥作用降低结合亲和性。
目前已有自体诱导物结合位点位于LuxR蛋白的氨基末端结构域证据(Hanzelka and Greenberg，1995)。具有突变的氨基末端区的luxR等位基因比野生型需要更高水平的这一信号，从而表明这一区域是配体相互作用所需的(Slock等，1990；Shadel等，1990)。这一区域(aa 79-127)以及DNA结合结构域内的一区域(aa 180-230)在LuxR及其同系物(ca 50％相同性)中比这些多肽的其它部分具有更高程度的保守性。但是，LuxR和自体诱导物之间的预测的蛋白质—配体相互作用尚未被证明。对含有野生型和突变的LuxR等位基因的部分二倍体大肠杆菌的分析提示LuxR以同源多聚体起作用，并且多聚化所需的区域位于氨基酸残基116和161之间(Choi andGreenberg，1992)。
发明简述在一个方面，本发明涉及编码细菌自体诱导物失活蛋白的分离的核酸分子。
在另一方面，本发明涉及表达载体，其包含编码细菌自体诱导物失活蛋白的核酸分子，其中所述表达载体在原核或真核细胞中繁殖。
本发明再一方面涉及用本发明的表达载体转化或转染的原核或真核细胞。
本发明又一方面涉及具有细菌自体诱导物失活活性的分离的蛋白质，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
本发明还涉及增加植物或动物的抗病性的方法，该方法包括在这种植物或动物的细胞中导入编码细菌自体诱导物失活蛋白的核酸序列，使所述细胞表达所述核酸序列。
本发明还涉及防止或降低植物或动物的细菌性损害的方法，所述方法包括将有效量的细菌自体诱导物失活蛋白给予需要这种防止或降低的植物或动物。
本发明还涉及降低植物或动物的细菌性损害的组合物，其包括a)有效量的细菌自体诱导物失活蛋白；和b)合适的载体。
附图简述
图1示出来自芽孢杆菌菌株240BI的细胞提取物对AIs失活的时程。将含有100微克总蛋白的于0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)中的细胞提取物加入到含有终浓度为20μM的OHHL的相同缓冲液中。反应以200微升终体积在1.5ml Eppendorf离心管中进行，并于28℃保温。在磷酸缓冲液中的相同浓度的OHHL用作对照。以10分钟间隔取样直至60分钟，煮沸3分钟终止反应。在台式离心机中以最高速离心样品5分钟，随后如所述(Zhang，1993)分析AIs活性。蓝色菌落表明存在激活lacZ报道基因的AI，而白色菌落表明不存在AI。从左至右为1，不含蛋白质提取物的OHHL对照；2-7，在10、20、30、40、50、60分钟酶反应后的样品。
图2示出AIs失活酶的分子量的估计。将600微升细胞提取物加入到Centricon 30(Amicon)中并在4℃以5000×g的速度离心30分钟。通过部分(550微升)和未通过部分(50微升)分别通过加入0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)而使终体积为600微升。为进行生物分析，向含有终浓度为20μM的OHHL的管中加入不同量的蛋白质样品。从列1至6，所加入的蛋白质样品分别为2、4、6、8、10和0微升，每一反应的终反应体积为20微升。板A通过部分，板B未通过部分。
图3示出芽孢杆菌菌株240B1 AI失活区的克隆和缺失分析。粘粒克隆E7-R3含有由重叠粘粒克隆的限制分析鉴别的4.3kb EcoRI片段。为进行缺失分析，将同一片段克隆进克隆载体pGEM-7Zf(+)，产生克隆E7-7。通过用限制酶消化和Dnase I处理克隆E7-7产生缺失亚克隆。在粘粒和pGEM-7Zf(+)克隆中的Ptac启动子的位置和方向用箭头表示。这些克隆的AI失活活性在第2栏示出+，具有AI失活活性；-，无AI失活活性。限制酶E，EcoRI；H，HindIII；Ev，EcoRV；St，StyI。AiiA ORF的转录的位置和方向由空箭头指示。
图4A示出aiiA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。潜在的核糖体结合序列和-10启动子元件分别以下划线和双下划线指示。编码部分在起自碱基1。推断的因子不依赖性终止位点用重下划线标出。图4B示出aiiA基因产物的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。类似于天冬氨酸蛋白酶活性位点共有基序的短肽序列以下划线标出。
图5示出aiiA基因产物(AiiA)的氨基酸序列与共有天冬氨酸蛋白酶活性位点基序(Asp)的最佳匹配。符号X代表任意氨基酸。垂直线表示完全匹配。
图6示出芽孢杆菌菌株240B1，大肠杆菌克隆的AIs失活活性及胡萝卜软腐欧文氏菌株的AIs产生活性的生物分析。列1，OHHL对照；列2芽孢杆菌菌株240B1；列3，大肠杆菌DH5α；列4，大肠杆菌DH5α(pE7-R3)；列5，大肠杆菌DH5α(pF41)；列6，胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1(pE7R3)；列7，胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1(pLAFR3)；列8，胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1。在生物分析中，将OHHL以20μM的终浓度加入到1-5道的样品中。6-8列样品中没有加入外源AIs。
图7示出在胡萝卜软腐欧文氏菌中的aiiA基因表达对(A)马铃薯；(B)茄子；(C)大白菜；(D)胡萝卜和(E)芹菜的致病性的影响。上部植物组织用胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1接种；下部植物组织用胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1(pE7-R3)接种。以3000×g离心活性生长的细菌1分钟，用YEB液体培养基重悬至OD600＝1.3(2×109cfu/ml)，其被标为100接种物。分别将100接种物稀释5和10倍，以制备10-1/2和10-1稀释液。通过将4微升细菌接种物施加至新切的表面或由移液器尖刺穿的伤口位点而接种植物组织。从左至右板的接种物浓度分别为100，10-1/2和10-1。将接种的植物组织置于塑料皿中并在28℃保温。在接种后48小时拍照。
发明的详细描述本发明基于如下发现，SEQ ID NO2蛋白质具有降低或消除细菌自体诱导物(AIs)的活性的作用。因此，该蛋白质和编码该蛋白质的任何核酸可用于各种需要降低或消除这种细菌的作用的环境。
在一个优选的方面，本发明提供了选自如下一组的核酸分子，所述的组为a)具有SEQ ID NO1的序列的核酸；b)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸；c)与上述a)或b)杂交的核酸，其中在用1×SSC和0.1％SDS于55℃洗涤1小时后观察到阳性杂交信号。所述核酸任选地还包括任何序列的信号肽编码区。
所述核酸序列可用于赋予植物或动物的细菌抗性。编码细菌自体诱导物失活蛋白的核酸可被导入细胞，从而由植物或动物表达失活蛋白。当致病基因的表达由自体诱导物调控时，所述核酸序列可用于赋予对这种疾病的抗性，如由铜绿假单胞菌、斯氏欧文氏菌、嗜线虫致病杆菌、菊欧文氏菌、青枯假单胞菌、野油菜黄单胞菌导致的疾病(Passador等，1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman和Farrand，1995；Barber等，1997；Clough等，1997；Costa和Loper，1997；Dunphy等，1997；Nasser等，1998)。优选地，在农业中，所述序列可用于赋予易感植物如马铃薯、茄子、大白菜、胡萝卜和芹菜的抗软腐病抗性。
所述序列可通过熟知的方法导入植物或动物中。用外源核酸序列转化或转染真核细胞的方法包括转染、发射轰击、电穿孔或用根癌农杆菌感染。这些方法是分子生物学和生物工程领域熟练技术人员很熟悉的，本文无需详细解释。由于致病细菌细胞限于植物组织的胞间区域，希望将AiiA蛋白导向胞间空间，这可通过将分泌信号肽与AiiA蛋白融合而完成(Sato等，1995；Firek等，1993；Conrad和Fiedler，1998；Borisjuk等，1999)。或者，可将植物膜附着基序掺入AiiA的肽序列以将AiiA酶固定在植物细胞膜的外表面。
本发明提供了工程化抗病性的新策略。具体地，这一策略定向N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物，该诱导物在阈值浓度诱导许多细菌病原体的致病基因的表达。这一策略适用于细菌病原体的致病基因的表达受N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物诱导的所有的植物、动物或哺乳动物疾病。
本发明还涉及细菌自体诱导物失活蛋白直接治疗或预防细菌损害的应用。例如，可将蛋白直接施加于需要这种治疗或预防的植物。在一个优选的实施方案中，将蛋白质以组合物的形式应用，所述组合物包括有效量的蛋白质和合适的载体。组合物可采用各种形式，包括溶液、粉末、乳液、分散液、糊剂、气雾剂等。
细菌自体诱导物失活蛋白也可用于治疗动物包括人中的细菌感染。在这项应用中，将有效量的活性成分给予需要这种治疗的动物。
为了治疗，可将活性成分配成药物组合物，该组合物除包括有效量的活性成分外还可包括药物可接受的载体、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。如果需要或希望，组合物还可包括一或多种其它活性成分。
本领域普通技术人员很清楚本发明的药物组合物可通过各种方式给予，例如可局部、口服、吸入或肠道外给予。
局部配方可包括软膏、洗剂、乳液、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。口服配方例如包括粉末、颗粒、在水或非水介质中的悬液或溶液，胶囊或片剂。如果需要可使用增稠剂、香味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。
非肠道配方可包括无菌水溶液，其也可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适添加剂。
剂量方案取决于可容易确定的一系列因素，如待处理症状的严重性和应答性。
以下参照非限制性实施例描述本发明的各方面。实施例1基于其失活N-β-氧基己酰基-L-高丝氨酸内酯(OHHL)、N-β-氧基辛酰基-L-高丝氨酸内酯(OOHL)和N-β-氧基癸酰基-L-高丝氨酸内酯(ODHL)的功能而从土壤悬液中分离细菌分离物240B1(Zhang等，1993)。除非另有说明，用OHHL进大白菜叶中分离。行常规生物分析。胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1从显示软腐症状的已经证实菌株SCG1产生AIs并引发马铃薯和大白菜中软腐病。大肠杆菌菌株DH5α用作宿主进行DNA克隆和亚克隆。根癌农杆菌菌株NT1(traR；tra∷lacZ749)在AIs活性生物分析中用作指示剂(Piper等，1993)。大肠杆菌菌株在37℃于Luria-Bertani(LB)培养基中培养，其它菌株在28℃于LB(Miller，1972)或YEB培养基(每升含有酪蛋白水解物10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O0.5g，琼脂15g，pH7.2)中培养。OHHL的生物分析使用具有甘露糖醇和(NH4)2SO4作为碳源和氮源的最小盐培养基(Petit和Tempe，1978)。合适的抗生素以下述浓度加入氨苄青霉素100μg/ml；四环素20μg/ml；卡那霉素50μg/ml。AIs活性的生物分析现有技术已有测定AI活性的定性和定量生物分析方法(Zhang，1993)。为测定野生型和遗传修饰的欧文氏菌菌株的AIs产生活性，使用相同的生物分析程序，指示在细菌培养物中不加入OHHL。AiiA基因的克隆和测序用EcoRI部分消化240B1的基因组DNA，将DNA片段与粘粒载体pLAFR3(Staskawicz等，1987)的去磷酸化EcoRI位点连接。连接的DNA用Gigapack III XL包装提取物(Stratagene)包装并转染进大肠杆菌DH5α。具有OHHL失活活性的粘粒克隆用如上所述的生物分析方法鉴别。用常规技术(Sambrook等，1989)进行亚克隆进测序载体pGEM-7ZF(+)。用Lin等(1985)所述DNaseI方法进行缺失分析。用ABI PRISMTMdRhodamine终止循环测序反应试剂盒(PE Applied Biosystems)在两条链上均进行测序。用DNASTARTM序列分析软件包(DNASTAR Inc.)分析核酸序列数据和推导的氨基酸序列，用BLASTA检索算法(Altschul等，1990)进行数据库检索。欧文氏菌菌株SCG1的遗传修饰通过与辅助菌株RK2013(Ditta等，1980)进行三亲本交配将在粘粒载体pLAFR3中携带aiiA基因的E7-R3质粒转染进欧文氏菌菌株SCG1。在含有具四环素的最小培养基的平板上选择接合子，并用特异于aiiA基因的引物经PCR证实。毒力测试通过接种评价野生型胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1和aiiA基因转化子SCG1(E7-R3)的毒力。将4微升早期静止期细菌悬液(含有约2×109细胞/ml)或稀释的细菌加至切割表面或植物组织的创伤部位。接种的植物组织在28℃于Petri皿中培养过夜。培养48小时后检查软腐的严重性。结果筛选失活AIs的细菌筛选来自植物和土壤样品的细菌分离物的AIs酶失活作用。选择显示消除AIs活性的强能力的细菌分离物240B1进行进一步研究。来自分离物240B1的总蛋白提取物在1小时培养期间完全消除AIs活性(图1)，用蛋白酶K处理1小时或煮沸5分钟会破坏该蛋白质失活AIs的能力。这些观察表明细菌分离物240B1的酶失活AI的作用。由于如下特征，该分离物经分类学鉴定为芽孢杆菌菌种革兰氏阳性，杆状，过氧化氢酶阳性，兼性厌氧，与其它芽孢杆菌具有16rRNA序列同源性(数据未示出)。
失活AIs的酶的分子量看起来大于30kDa，其活性在将蛋白质提取物通过Centricon 30(Amicon)后丧失，但是在不能通过Centricon30的重悬部分中活性得以恢复(图2)。AIs失活区的克隆和定位为鉴别编码AIs失活的基因，用Listera菌株240B1的基因组DNA构建一粘粒文库。筛选了1200个克隆的AIs失活活性，鉴别了3个显示AIs失活功能的克隆。限制分析显示这3个克隆均有一条由EcoRI消化产生的4.3kb条带。用含有这一4.3kb EcoRI片段的亚克隆E7-7进行的生物分析证实这一片段编码AIs失活功能(图3)。为鉴别AIs失活基因(aiiA)的最小大小和位置，通过用DNaseI方法(Lin等，1985)从这一4.3kb片段的两端缺失而产生一系列缺失克隆。结果表明aiiA基因包含在克隆F41的1.2kb片段中(图3)。aiiA基因编码一新蛋白完全测序克隆F41的1.2kb DNA插入序列的两条链，aiiA的核苷酸序列和推导的氨基酸序列示于图4。该DNA插入物的完整序列含有1222bp，并且具有分别起自第1、42、156和228位核苷酸的4个潜在符合读框的开放读框(ORF)(图4)。缺失分析表明仅最长的ORF编码AIs失活功能，因为尽管剩余的DNA插入物置于有功能的Ptac启动子的控制下，但缺失了最长ORF的48bp启动子区和1-13位核苷酸的克隆R34完全丧失了AI失活功能(图3)。这一点通过将最长ORF与谷胱甘肽-S-转移酶在同一ORF中融合并测试纯化的融合蛋白的AI失活活性而证实(数据未示出)。这一ORF含有750bp核苷酸并编码250个氨基酸的蛋白质，该蛋白质预计分子量为28036道尔顿，等电点为4.7，因为有19个强碱性氨基酸残基和39个强酸性氨基酸残基。推断的起始密码子之前7bp为一潜在的核糖体结合序列(AAGGTGG)，其与大肠杆菌16S rRNA的3’末端互补。与共有-10启动子元件(TATAAT)的最佳序列匹配(TATTGT)在起始密码子上游的35bp。代表潜在的因子不依赖性终止位点的TCTT盒和随后的富T区域在终止密码子下游发现(Brendel，1986)。aiiA基因的总GC含量为37％，密码子的第3位的GC含量为27.2％。
数据库检索显示通过FASTA和BLAST分析在核苷酸序列水平或肽序列水平，aiiA基因与主要数据库(GenBank，欧洲分子生物学实验室，蛋白质信息来源，和Swiss-Prot)中的已知序列无显著相似性，提示AiiA是一新蛋白质。用遗传学计算机公司(Madison，WI)MOTIF程序进行的共有蛋白质基序检索显示从AiiA的47-58位的短肽序列“ILVDTGMPESAV”与天冬氨酸蛋白酶活性位点代表模式(Rawlings和Barrett，1995)相似但不相同(图5)。aiiA基因在胡萝卜软腐欧文氏菌中的表达降低了AIs释放并弱化的毒力通过三亲本交配将粘粒克隆E7-R3转移进胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1。pLAFR3载体已在胡萝卜软腐欧文氏菌中无需选择压力而安全保持。生物分析表明由胡萝卜软腐欧文氏菌(E7-R3)释放的AIs显著降低(图6，第6道)，而粘粒载体pLAFR3单独在胡萝卜软腐欧文氏菌中的存在不影响AIs产生(图6，第7道)。数据提示胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1产生的大多数AIs由aiiA基因产物失活。
表达AiiA蛋白的胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1(E7-R3)在马铃薯、茄子、大白菜、胡萝卜和芹菜中不导致或仅导致微弱的软腐病症状，而其亲本菌株导致严重症状(图7A，B，C，D，E)。为防止由遗传变异导致的实验误差，随机选择分别来自胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1及其aiiA基因转化子的4个菌落，以测试AIs产生和对马铃薯的毒力。在两个实验中活动类似的结果。仅含有粘粒载体的胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1(pLAFR3)仅导致与其亲本菌株胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1相同水平的疾病严重性(图7F)。讨论鉴别为芽孢杆菌的细菌分离物240B1产生能有效失活所测试的三种AIs，即N-β-氧基己酰基-L-高丝氨酸内酯、N-β-氧基辛酰基-L-高丝氨酸内酯和N-β-氧基癸酰基-L-高丝氨酸内酯的酶。编码AI失活酶的基因(aiiA)已被克隆和完全测序。aiiA基因在转化的大肠杆菌和致病细菌胡萝卜软腐欧文氏菌中的表达赋予AI失活的能力，并显著降低胡萝卜软腐欧文氏菌释放的AIs。我们知道，这是第一次鉴别的能酶失活各种细菌菌种中的全局基因调控自体诱导物N-酰基高丝氨酸内酯的蛋白质。
AiiA是一种新蛋白质，其与主要数据库中的已知蛋白质无明显同源性。其与天冬氨酸蛋白酶活性位点的共有模式具有相似性(Rawlings and Barret，1995)。天冬氨酸蛋白酶也称为酸性蛋白酶，其在脊椎动物、真菌、植物、反转录病毒和某些植物病毒中广泛分布。大多数反转录病毒和一些植物病毒的天冬氨酸蛋白酶是同源二聚体。AiiA蛋白的分子量大约为28kDa，但其不能通过截留值为30kDa的分子筛，表明AiiA蛋白在天然条件下可能以同源二聚体或同源多聚体形式存在。但是，也有一种可能性，即AiiA单体具有不规则三维结构，使得其不能通过分子筛。天冬氨酸蛋白酶是内切肽酶，其水解蛋白质的酰胺键。晶体学研究表明天冬氨酸蛋白酶家族的酶是双圆形突出状分子，在圆形突出之间有活性位点裂缝，每一圆形突出贡献负责催化活性的天冬氨酸残基对中的一个残基(Sielecki等，1991)。
胡萝卜软腐欧文氏菌是一种植物病原体，其产生和分泌胞外酶以作为导致各种植物包括马铃薯、甘蓝、番茄、辣椒、胡萝卜、芹菜、洋葱和莴苣的软腐病的毒力决定簇(Kotoujansky，1987)。
不能产生N-3-(氧基己酰基)-L-高丝氨酸内酯的突变体也不能合成果胶酶、纤维素酶和蛋白酶胞外酶。这些突变体不能在马铃薯块茎中诱导软腐病(Jones等，1993)。已发现与费氏弧菌的luxI基因同源的expI基因编码胡萝卜软腐欧文氏菌中的自体诱导物产生。当expI突变体导入烟草叶中时，其是无毒的，但是通过外部加入自体诱导物毒力得以恢复(Pirhonen等，1993)。很显然，自体诱导物是植物软腐病抗性基因工程的潜在靶。作为临时试验及概念证实途径，将含有aiiA基因的粘粒克隆导入胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1中。AiiA酶在胡萝卜软腐欧文氏菌中的表达明显降低了自体诱导物的释放，且表达AiiA的遗传修饰的胡萝卜软腐欧文氏菌在所有测试的植物包括马铃薯、茄子、大白菜、胡萝卜和芹菜中不能诱导或仅诱导微弱的软腐病症状。我们的结果进一步支持了自体诱导物在胡萝卜软腐欧文氏菌毒力基因表达的调控中的重要作用，以及aiiA基因赋予软腐病和自体诱导物参与致病基因表达调控的其它疾病的抗性的潜力。
本发明提供了工程化抗病性的新策略，具体地，这一策略靶向以阈值浓度诱导许多细菌病原体的致病基因的表达的N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物。通过使用上述概念证实途径，本发明证实通过自体诱导物失活酶降低或消除由致病细菌产生的自体诱导物明显弱化毒性细菌病原体的致病性。由于致病细菌中致病基因的表达需要阈值浓度，因此这一AJ失活策略适用于其中细菌病原体的致病基因的表达由N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物诱导的所有植物、动物或哺乳动物疾病。
aiiA基因也可以是研究AIs在AIs调节的生物学功能尚未确定的细菌中的作用的有用工具。近年来，更多的细菌菌种已示出产生AIs(Bassler等，1997；Dumenyo等，1998；Cha等，1998；Surette等，1999)，它们中的一些是重要的植物病原体如假单胞菌和黄单胞菌菌种。基于序列同源性的基因敲除途径可能是困难的，来自不同属的AIs合酶和相关调控蛋白的序列相似性整体水平非常低，LuxI型蛋白之间的相同性经常不超过28-35％，LuxR型蛋白之间的相同性经常不超过18-25％(Fuqua等，1996)。但是将aiiA基因导入这些细菌以探查由AIs调控的生物学功能是可行和简便的。
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权利要求
1.一种分离的核酸分子，其编码细菌自体诱导物失活蛋白。
2.权利要求1的分子，其中所述核酸分子选自如下一组a)具有SEQ ID NO1的编码部分的序列的核酸；b)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸；和c)与上述a)或b)的核酸杂交的核酸，其中阳性杂交信号在用1×SSC和0.1％SDS在55℃洗涤1小时后观察到。
3.权利要求1的分子，其进一步包括任何序列的信号肽编码区。
4.包含权利要求1的核酸分子的表达载体，其中所述表达载体在原核或真核细胞中繁殖。
5.用权利要求4的表达载体转化或转染的原核或真核细胞。
6.具有细菌自体诱导失活活性的分离的蛋白质，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
7.增加植物或动物的抗病性的方法，所述方法包括向这种植物或动物细胞中导入一种核酸序列，所述核酸序列编码细菌自体诱导物失活蛋白，使所述细胞表达所述核酸序列。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸序列选自如下一组a)具有SEQ ID NO1的编码部分的序列的核酸；b)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸。
9.权利要求7或8的方法，其中所述核酸序列进一步包含任何序列的信号肽编码区。
10.权利要求7或8的方法，其中所述核酸序列进一步包含任何来源的膜附着结构域编码区。
11.权利要求7的方法，其中所述植物易感细菌软腐病。
12.权利要求11的方法，其中所述植物选自马铃薯、茄子、大白菜、胡萝卜和芹菜。
13.权利要求7的方法，其中所述植物易感其中毒力基因的表达由N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物调控的细菌软腐病。
14.预防或降低植物或动物的细菌损害的方法，所述方法包括给予需要这种预防或降低的植物或动物有效量的细菌自体诱导物失活蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述蛋白包括SEQ ID NO2。
16.预防或降低植物或动物的细菌损害的组合物，所述组合物包括a)有效量的细菌自体诱导物失活蛋白；和b)合适的载体。
17.权利要求16的组合物，其中所述蛋白包括SEQ ID NO2。
18.筛选细菌分离物的自体诱导物失活活性的方法，包括a)从土壤或植物样品中分离单菌落细菌培养物；b)筛选培养物的自体诱导物失活活性；c)从所述培养物制备粗蛋白提取物；和d)证实粗蛋白提取物的酶失活自体诱导物活性的作用。
19.分离权利要求1或2的核酸的方法，包括如下步骤a)在一合适宿主生物体中制备来自含有编码具有自体诱导物失活活性的蛋白质的核酸序列的供体生物体的基因库；b)筛选基因库的克隆；和c)分离含有编码具有自体诱导物失活活性的蛋白质的合适的克隆。
20.权利要求19的方法，其中用大肠杆菌作为宿主生物体。
21.权利要求19的方法，其中制备基因库、筛选克隆和分离克隆的步骤在不失活自体诱导物的大肠杆菌菌株中进行。
22.一种方法，包括a)将权利要求1或2的核酸序列导入细菌细胞；和b)筛选得自步骤a)的细菌细胞的改变的生物学功能。
23.权利要求22的方法，其中所述改变的生物学功能是由于步骤a)而丧失的功能。
24.权利要求22的方法，其中所述改变的生物学功能是由于步骤a)而被抑制的功能。
25.权利要求22的方法，其中所述改变的生物学功能是由于步骤a)而被增强的功能。
全文摘要
本发明公开了编码细菌自体诱导物失活蛋白的分离的核酸分子,所编码的蛋白质及其抗菌用途。
文档编号C12N5/10GK1361823SQ99816789
公开日2002年7月31日 申请日期1999年11月17日 优先权日1999年7月2日
发明者张炼辉, 董义虎, 徐金玲 申请人:分子农业生物学院