专利名称：基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌核酸指纹图谱制备的方法，以及使用该方法，对细菌进行分类与鉴定的方法。
背景技术：
早期的细菌学分类主要是采用以形态培养特征和生理生化特征为依据的传统细菌学分类方法。但是由于细菌的这种表面特征往往受很多人为因素的影响与限制，特别是人们主观判断的差异反而难以反映出细菌的自然亲缘关系，这就体现了只建立在形态特征和生理生化特征基础上的传统分类学的局限性。因此，Colweel提出了一个新的细菌分类学术语“多相分类(Polyphasictaxonomy)”，它是指综合利用微生物多种不同信息，包括表型和基因型的信息进行分类的方法。分子分类和系统发育信息丰富了多相分类的内容，共同推动细菌分类向着自然分类系统靠近。应用于分类的分子指标主要为DNA和RNA，而DNA同源性分析是确定正确的分类地位，建立自然分类系统的最直接的方法。此类方法简便易行，分辨率高，在细菌系统分类学研究中起着越来越重要的作用。使用质谱技术进行细菌分类和鉴定的原理在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，对细菌基因组DNA上某个或某几个片段进行PCR和酶切后，将产生分子量和丰度各异的片段，使用质谱检测可产生核酸指纹图谱，不同细菌之间基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，建立数据库后，可以实验结果与数据库进行比对，即可完成对细菌的鉴定。已有一些公开文献使 用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A、“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALD1-T0F鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALD1-T0F鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALD1-T0F鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐、适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。中国专利申请200910157210、“一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法”公开了一种利用气相色谱质谱(GC-MS)分析法针对细菌脂肪酸进行分类的方法，包括李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。虽然该方法打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，但该法仍然属于利用质谱法进行细胞化学分析分类，并未针对核酸进行检测。国际专利申请 W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公开了一种使用MALD1-MS (基质辅助激光解吸和电离质谱)用于识别生物材料的方法和装置，包括准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。但该方法目的在于如何改善MALD1-MS检测生物物质的灵敏度，并不涉及质谱鉴定和分类任意微生物，因此也不能解决上述技术问题。
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朱健等人(“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年03期)报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ES1-MSn)对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理，并对各种化合物进行了准确分类，但并不涉及针对细菌特定物质进行检测从而对细菌进行分类的方法。刘海洪(“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年02期)报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进行细菌分类的新的报道。作为最接近的现有技术，中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。研究证明，细菌rRNA区域。rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量达80%，并存在于所有细菌中，rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。其中，16S rDNA序列由于分子大小适中(约1. 5kb)，突变率极低，已经成为细菌分类和种属鉴定的重要标记(Olsen GJ, Pace NR, Nuell M, et al. Nucleic Acids Res, 1991, 19 ( supp I):2017-2021.)。虽然目前16S rDNA序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，大约2500个种的16S rDNA全序列已经被报道，根据它们的序列同源性，已经构建了各种属的系统发育树。但由于16S rDNA序列在原核生物中的高度保守性,对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差。另外，目前以16S rDNA进行细菌分类和鉴定的方法主要是采用PCR产物直接测序，结果与数据库进行比对的方法。测序法应用于临床检测，目前存在如下问题(1)成本高；(2)耗时；(3)对于混合样本，测序易产生套峰，难以进行有效区分；(4) 16S rDNA全长1. 5kb以上，一般需要经过两次测序并将结果进行拼接，在这个过程中易引入误差。如前所述，16S rDNA对细菌分类鉴定具有重要的意义，但是传统测序等方法检测成本高、耗时长；对于混合感染的样品，测序法将得到混合的序列峰图，难以进行有效的区分，并且利用质谱进行待测物分析，需要选择合适的待测物和优化质谱参数，因此目前需要新的细菌分类技术(如质谱法)来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。因此，目前需要一种既能针对细菌中16S rDNA某特定区域进行质谱检测，同时该方法又能普遍用于绝大多数细菌的质谱分类和鉴定中。
发明内容
本发明原理在于发明人经过大量摸索和比对，针对841种细菌的研究，发现选用通用引物对细菌DNA保守DNA区域进行PCR扩增后，使用特殊酶对扩增产物处理后，进行质谱检测可以得到各种细菌核酸指纹特征图谱。本发明所述的细菌DNA基因组上一个区域，优选是具有高度保守同时又具有一定多态性的区域。由于细菌属于低等生物，各种细菌的基因组中普遍呈现为一定同源性的保守性，因此针对细菌基因组中任一相对保守的区域，使用通用引物即可扩增出各种细菌彼此对应的核酸区域。不同微生物的DNA片段酶切，具有不同的特征图谱，因而将实际核酸质谱图谱进行生物信息学分析，即可实现细菌的分类与鉴定。 因此，本发明第一目的是提供一种基于酶切的细菌核酸指纹图谱制备方法。其特征在于，它至少包括如下步骤(I)PCR反应使用针对细菌16S rDNA的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；(2) SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物；(3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤
(2)得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；(4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物；(5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同细菌的特征核酸指纹谱图。在一个实施方案中，PCR反应所扩增的细菌核酸序列，包括但不限定于细菌16SrDNA上一个区域。在另一个具体实施方案中，所述细菌16S rDNA区域选自SEQ ID N0:3所示的区域，或者与SEQ ID N0:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的优选实施方案中，优选该序列具有 62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。在一个实施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一 实施方案中，步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。上述任一方案中，其中所述细菌包括如表1所列的836种细菌。[LZOO]
权利要求
1.一种基于细菌16S DNA的核酸指纹图谱制备方法，其特征在于，它至少包括如下步骤 (1)PCR反应使用针对细菌16S rDNA的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2)SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物； (3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤(2)得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物； (5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同细菌的特征核酸指纹谱图。
2.根据权利要求1的方法，其中细菌16SrDNA区域选自SEQ ID N0:3所示的区域，或者与SEQ ID N0:3所示序列具有至少60%同源性的序列，在其中的优选实施方案中，优选该序列具有 62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列；通用引物包括但不限于SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟；所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细菌包括如表I所列的836种细菌。
5.在上述任一方案中，其中所述细菌还包括布鲁氏菌(5rwce77a)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis、,以及幽门螺杆菌pylori, Ηρ)。
6.利用权利要求1的方法用于建立细菌核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括上述步骤1-5，和； (6)将步骤5得到的各种细菌16SrDNA的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的细菌核酸指纹特征图谱库。
7.权利要求7的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879 号、登记号 2009SR10700。
8.利用权利要求5或6的方法所建立的细菌核酸指纹特征图谱，用于细菌鉴定或分类的方法，包括 (I )PCR反应使用针对细菌的PCR通用引物，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2)SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物； (3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物； (5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱； (6)将所得核酸指纹特征图谱与细菌核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测细菌的类别或种属。
9.权利要求7的方法,其中步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。
10.提供能用于细菌分类和鉴定、耐药筛选用途的试剂盒，包括 (1)用于扩增细菌16SrDNA的通用引物对及其缓冲液； (2)SAP酶及其缓冲液； (3)RNAase及其缓冲液； (4)用于纯化酶切产物的树脂； (5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。
11.权利要求9的试剂盒，其中所述引物是SEQID NO: 1-2，所述软件是BioExplore软件，所述细菌16S rDNA区域选自SEQ ID N0:3所示的区域。
全文摘要
本发明公开了一种用于细菌16S rDNA核酸指纹图谱制备的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，建立常见细菌的核酸指纹图谱数据库。根据实验产生的质谱峰图，可对待检细菌进行分类与鉴定，结果可广泛运用于细菌分类和鉴定、遗传进化分析、耐药筛选用途以及进出口检验等领域。
文档编号C12Q1/68GK103060431SQ20121027332
公开日2013年4月24日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者马庆伟, 赵洪斌, 张海燕, 赵艳梅 申请人:向华