化合物在生物合成核酸以增加细菌培养物的产率中的应用的制作方法

专利名称：化合物在生物合成核酸以增加细菌培养物的产率中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物引子 培养物。更具体的，本发明提供了乳酸菌(LAB)引子培养物的制备方法，其中，乳酸菌被接种到含有至少一种产率增加剂的培养介质中培养，该产率增加剂是选自由一种或多种用于核酸的生物合成中的化合物或其一种或多种衍生物组成的组。该引子培养物可用于食品、饲料和医药制品的制造中。
背景技术：
微生物培养物被广泛用于食品、饲料和医药工业，用以生产发酵制品，包括绝大多数奶制品，例如奶酪、酸奶和黄油，以及还包括肉类、焙烤、酒或蔬菜制品中。另外，微生物培养物还被用于产生蛋白质，包括酶和多种有用的化合物。这些微生物培养物通常被称作引子培养物，并在工业化繁殖工厂中被生产和分发到发酵产业，如乳制品工厂中，其中，引子培养物被用于它们的生产过程。乳酸菌培养物尤其被广泛用作弓I子培养物。这里所用的术语“乳酸菌”(LAB)是指由革兰氏阳性、微嗜氧菌或厌氧菌，其对糖进行发酵，所产生的酸中包括乳酸(为主要产生的酸)、醋酸和丙酸。工业上最为有用的乳酸菌是属于乳球菌属(Lactococcus species (spp.))、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)和丙酸菌属(Propionibacterium spp.)中的乳酸菌。此外，属于严格厌氧菌群的产乳酸的菌中的双歧杆菌(bifidobacteria)，即双歧杆菌属，其常被单独用作食物引子培养物或与乳酸菌结合使用，通常被包括在乳酸菌组中。甚至是某些葡萄球菌(例如，肉葡萄球菌(S. carnosus)、马胃葡萄球菌(S. equorum)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、小牛葡萄球菌(S. vitulinus)、木糖葡萄球菌(S. xylosus))属中的细菌也被称为LAB (Mogensen等(2002)Bulletin of the IDF No. 377，10-19)。LAB引子培养物的生产涉及将适当数量的LAB细胞接种到特异性的发酵介质中，在适当的发酵条件下进行繁殖。在工业化生产中，需竭力做到在发酵过程结束时获得高浓度的繁殖的细胞。这就对支持细胞生长以获得期望的高的生物质量产率的发酵条件和发酵介质产生较高要求。液体介质在600nm的光学密度(0D_)是一种评价培养物样品中细菌细胞密度的精确方法。术语“高光学密度条件”是指在发酵过程结束时，繁殖的细胞浓度高达0D_为10或以上的发酵。为了降低生产成本，工业化的发酵通常使用复杂的不明确的发酵介质进行。这样的介质的主要成分可以是酵母提取物、玉米淀粉、乳清蛋白质或其它基于乳汁的介质，它们都具有复杂的成分。对于选择的发酵而言，是使用通常由纯的化学物质制成的化学成分来确定的介质。纯的化学物质，例如特异性的能量源或碳源，也通常被添加到复合发酵介质中用于特异性的用途。无论在哪种情况下，对微生物细胞的存活能力而言发酵介质的组合物可能是最优化的，但对于获得高的微生物的生物质量产率而言就不一定是最优化的。多数细胞生长所需的化合物，是需要消耗能量以提供细胞生产。这通常需要通过表达编码相应生物合成的酶的基因。这些酶的合成需要氨基酸和能量。由于必须合成相对更多的酶来生长，这样就对细胞施加了 “蛋白质负担”。由于形成细胞成分所需的前体必须从其它途径获得，这又给细胞带来了额外的负担。在核酸生物合成中所用到的一些化合物被发现是用于所谓的冷冻保护剂，以及减少冷冻和解冻过程中对活细胞的存活性带来的破坏性影响。W000/39281描述了在DNA的生物合成中，使用肌苷酸盐(MP)和其它化合物来稳定储存中的液体引子培养物的代谢活性。已知的是LAB具有复杂的生长因子需要，且在DNA和/或RNA的生物合成中涉及的化合物在具有确定了化学组成的介质中激发LAB的生长。但是，一些报道显示，尽管添加这些化合物产生了较短的停滞期或较高的初始生长速率，但却没有或仅略微提高产率(Klistrup(2005)FEMS Microbiol Rev. 29,555-590 ；Nygaard(1951) J Bact 61,497-505 ；Weinman (1964) J Bact 87，263_269)。添加涉及在DNA生物合成中的化合物甚至可能抑制产率(Weinman (1964) J Bact 87，263-269)。如在实施例3和4中所示，添加涉及在DNA生物合成中的化合物也没有增加达到了高光学密度条件的发酵的生物质量的产率。因此，需要提供一种新的方法来提高在高光学密度条件下进行的发酵的生物质量
的产率。

发明内容
本发明解决的问题可通过提供一种方法来制备LAB的微生物培养物，以在高光学密度条件下提高生物质量的产率。Richardson在1936年(Biochem J. 30, 2186)曾经报道，尿卩密唳对于葡萄球菌的厌氧生长至关重要，当对相同有机体的好氧生长无关紧要。因此，当将核酸生物合成中涉及的化合物添加到复杂的发酵介质中，而令人感到十分惊奇是发现LAB引子培养物在有氧培养或生广中有可能提闻生物质量的广率。因此，本发明的第一方面涉及在通气和高光学密度条件下发酵，获得增加的乳酸菌培养物的产率的方法，该方法包括以下步骤i)在培养介质中培育乳酸菌，并在一定条件下使得发酵进行到在600nm测量的光学密度(0D_)为10，其中，所述培养介质包含至少一种产率增加剂，其选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组，浓度为确保在发酵结束时培养介质含有至少I y M的所述至少一种产率增加剂；以及ii)收集所述乳酸菌以获得乳酸菌培养物，
其中，比起在相同条件下和相似介质中但在发酵结束时含有少于IuM的各产率增加剂来培养微生物的情况下，产率增加剂增加了收集到的乳酸菌的产率。优选的，所述培养介质含有至少5 ii M的至少一种产率增加剂，例如，至少IOiiM,如至少50 ii M的至少一种产率增加剂。特别的，所述培养介质含有至少5 ii M的选自MP、GMP、肌苷和鸟嘌呤的组的试剂。优选的，所述相似介质含有少于5 PM的各产率增加剂，例如少于I PM，如少于0. 5uM的各产率增加剂。特别的，所述相似介质含有少于5 ii M的选自IMP、GMP、肌苷和鸟嘌呤的组的试剂。本发明的第二方面涉及根据在此描述的本发明第一方面和其实施方式获得的引子培养物。本发明的第三方面涉及培养介质，其包含至少一种产率增加剂，该产率增加剂选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组。本发明的弟四方面涉及制备食品、词料制品、医药制品、奶味制品和奶酿味制品的 方法，所述方法包括向食物、饲料或医药制品的起始材料中加入根据本发明第二方面和其实施方式的有效量的微生物引子培养物，并使该接种的起始材料处于微生物体保持代谢活性的条件下。本发明的第五方面涉及由按此处描述的本发明第四方面和其实施方式获得的发酵的食物、饲料或医药制品。定义在对发明的详细实施方式作描述前，先对这里所用的特定术语提供进一步定义。这里，术语“嘌呤碱基”意在包括具有嘌呤核心结构的含环氮的碱基。因此，在本文中，术语“嘌呤碱基”意为任选取代的嘌呤。具体的嘌呤碱基的例子包括腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤。类似地，术语“嘧啶碱基”意在包括具有嘧啶核心结构的含环氮的碱基。因此，在本文中，术语“嘧啶碱基”意为任选取代的嘧啶。具体的嘧啶碱基的例子包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本文中，术语“核苷酸”意指2-脱氧核糖(DNA)单体或核糖(RNA)单体，其通过I号碳原子连接到嘌呤碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤上，或通过I号碳原子连接到嘧啶碱基，如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶上。另外，DNA或RNA单体通过其5号碳原子连接到磷酸基上。具体的核苷酸的例子包括腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、黄嘌呤单磷酸(XMP)，肌苷单磷酸(IMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧黄嘌呤单磷酸(dXMP)和脱氧肌苷单磷酸(dMP)。MP尤为优选。这里所用的术语“核苷”意指2-脱氧核糖(DNA)单体或核糖(RNA)单体，其通过I号碳原子连接到嘌呤碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤上，或通过I号碳原子连接到嘧啶碱基，如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶上。具体的核苷例子包括腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧肌苷。肌苷尤为优选。由以上对术语“核苷”和“核苷酸”的定义可以理解，核苷酸可被认为是包含通过糖单元的第5号碳原子连接的磷酸基的核苷。因此，这里描述的核苷酸也可认为是“核苷”-5'-单磷酸。例如，肌苷酸(IMP)可指肌苷-5'-单磷酸，脱氧肌苷酸(dIMP)可指脱氧肌苷-5'-单磷酸等。本文中，术语“衍生物”当与术语“核苷酸”或“核苷”连用时，意指那些在其糖(即2-脱氧核糖或核糖)单元发生了改性的核苷酸或核苷，或那些在其含环氮碱基发生了改性的核苷酸或核苷，或者是那些在其糖单元和其含环氮碱基都发生了改性的核苷酸或核苷。例如，脱氧核糖单元的2' -H基或核糖单元的2' -OH基可发生改性，例如，加入2' -F基、2，-0-甲基等。类似的，含环氮的碱基可含有一个或多个通常不出现在腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶上的取代基。具体的例子包括5-甲基胞嘧啶(MeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6— 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。这里使用的术语“发酵”是指在有氧或厌氧条件下繁殖或培育微生物细胞的过程。这里使用的术语“引子培养物”是指用于发酵的培养介质的含微生物细胞的配置物。在本文中，术语“产率”是指在给定体积的发酵中所产生的生物质量。产率可通过 多种途径计算；这里，采用两种不同方法来测量产率。I)为体积的每单位的生物质量(减去背景)，在发酵结束时通过Icm光程测量发酵介质的600nm的光学密度(OD6J，或者2)通过在实施例2 :发酵结束时的分析过程QAm-043中描述的Pearce测试中的具有“酸化活性”为4. 8-5. I的F-DVS培养物来测量其kg数。术语“F-DVS”是指在实施例I中描述的所谓的冷冻直投式培养物。术语卜啉化合物”是指环状四吡咯衍生物，这些衍生物的结构延伸自卟啉，由各种功能基团取代位于吡咯核心的顶点处的碳原子而得。它们也指所述衍生物的复合物，其中，由金属原子与卟啉环的四个氮原子中的两个形成配位键。该定义包括但不限于尿卟啉、粪卟啉、原卟啉和血卟啉，以及它们的盐和酯及与金属原子的复合物。特别优选的卟啉化合物是原卟啉IX和它与铁原子的复合物，特别是血红素和氯化血红素，以及叶绿素的衍生物,如叶绿酸。在本文中，词句“乳酸菌”(LAB)是指由革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动的、微嗜氧或厌氧菌组成的一组细菌，它们对糖进行发酵，所产生的酸中包括乳酸为主要产生的酸，并包括醋酸、甲酸和丙酸。工业上最为有用的乳酸菌是属于乳球菌属(Lactococcusspecies (spp.))、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)和丙酸菌属(Propionibacteriumspp.)中的乳酸菌。此外，属于严格厌氧菌群的产乳酸菌中的双歧杆菌(bifidobacteria),即双歧杆菌属，常被单独用作食物引子培养物或与乳酸菌结合使用，通常被包括在乳酸菌组中。甚至是某些葡萄球菌(例如，肉葡萄球菌(S. carnosus)、马胃葡萄球菌(S. equorum)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、小牛葡萄球菌(S. vitulinus)、木糖葡萄球菌(S. xylosus))属中的细菌也被称为 LAB(Mogensen 等(2002)Bulletin of the IDF No. 377，10-19)。通常用作LAB引子培养物菌株的乳酸菌被大致分为嗜温有机物，其最适宜的生长温度在约30°C，以及嗜热有机物，其最适宜的生长温度范围是在约40到约45°C之间。典型的属于嗜温性的有机物包括乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostocmesenteroides subsp. cremoris)、戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酸乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp. casei)和副干酿乳杆菌副干酿亚种(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)。嗜热性乳酸菌的菌种包括如，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。在介质中的产率增加剂的浓度可由于如进入到微生物细胞中的含量而随着时间而发生改变，因此有必要指明要进行测量或确定产率增加剂的浓度的特定的时间点。因此，用于描述介质中的产率增加剂的浓度的术语“起始”是指在介质中加入微生物细胞进行培养前的介质中的产率增加剂的浓度，或者是指在介质中刚加入微生物细胞进行培养后的介质中的产率增加剂的浓度。根据本发明的引子培养物的一个重要的应用是作为所谓的益生菌。在本文中，术语“益生菌”应被理解为那些以活细胞的形式而被人或动物摄食后，可提供改善的健康条 件，例如通过增强免疫系统或帮助消化营养物而抑制胃肠道中有害的微生物。这样的有益生作用的产物的一个典型例子是“甜酸奶”。以下仅通过实施例对本发明的实施方式进行描述。


图I示出了在厌氧条件下进行3个嗜热链球菌(S. thermophilus)的发酵的产率；附图示出了在发酵器中，测量的生物质量为非浓缩的发酵介质样品的0D600对时间(小时)的函数。实心三角表示加入了 0. 2%w/w IMP,实心圆表示加入了 0. 2% w/w的肌苷,实心方块表示没有加入产率增加剂。0. 2% w/w的肌苷大约为7mM的肌苷；图2在包含相对大量的嘌呤的富含复合物的介质中，在发酵过程中的多种核化合物和光学密度的水平；简言之，乳酸乳球菌(菌株CHCC2862)在包含酵母提取物和其它复合物成分的复合物介质中进行有氧生长。以PM表示的浓度(主轴)和0D600(次轴)对时间作图。缩写G，鸟嘌呤；A，腺嘌呤；Hx，次黄嘌呤；X，黄嘌呤；IR，肌苷；GR，鸟苷；GdR，脱氧鸟苷；AR，腺苷；图3在加入了 2g/L的肌苷的介质中的发酵过程中的嘌呤化合物的水平；简言之，除了向每升介质中加入了 2g的肌苷外，乳酸乳球菌(菌株CHCC2862)在与图2相同的复合物介质中进行有氧生长。以PM表示的浓度(主轴)和0D600X100(次轴)对时间作图。注意，肌苷的水平是由次轴表示。缩写G，鸟嘌呤；A，腺嘌呤；Hx，次黄嘌呤；X，黄嘌呤；IR，肌苷；GR,鸟苷；GdR,脱氧鸟苷；AR,腺苷,和IR,肌苷(注意以不同的轴表不肌苷)。
具体实施例方式根据本发明的解决问题的方案是提供制备LAB的微生物培养物的方法，以获得在高光学密度条件下增加的产率，该方法是在有氧条件下，在含有至少一种产率增加剂的介质中发酵培养物，该产率增加剂选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。
并不限于任何理论，可以认为产率的增加与至少一种产率增加剂在整个发酵的过程中一直存在于发酵介质中的情况有关。观察到当介质中的产率增加剂被耗尽时，导致了多种酶系统的重新合成(见实施例6)，并可以认为这种耗能的重新合成导致了产率的降低。这种至少一种产率增加剂在整个发酵的过程中一直存在于发酵介质中的情况可通过起始的含有足量的产率增加剂的介质中培育LAB，从而保证至少一种这样的试剂在整个发酵的过程中始终保留于介质中。这样的介质例如可以是起初含有至少ImM，优选至少3mM，更优选至少3mM的至少一种产率增加剂的培养介质，这些产率增加剂选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。这样的介质可通过使用那些特别是富含产率增加剂的成分来配置，这些产率增加剂选自由一种或多种涉及核酸的生物的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种 衍生物所组成的组。一种这样的成分可以是酵母提取物，特别是所谓的“富集的”或“增强的”酵母提取物制剂，其特别富含嘌呤和/或嘧啶。除了使用富含产率增加剂的制剂来配置介质外，也可向标准的介质配方中加入纯的制剂。例如，培养介质可以是复合发酵介质，向每升介质中加入至少0. 2g,优选为至少
0.8g，更优选为至少2g的至少一种产率增加剂。也可通过在发酵中一次或多次加入所述至少一种产率增加剂，从而保证在整个发酵的过程中至少有一种产率增加剂保留于介质中。本发明在许多工业界采用的高光学密度条件下尤为有用。在本发明的选择的实施方式中，所述高光学密度条件的特征是在发酵结束时，OD600高于15，优选高于20，更优选高于30，进一步优选高于40，最优选高于50。在优选的实施方式中，其中所述本发明第一方面方法中获得的微生物的产率增加至少I. 2倍，优选为增加至少I. 3倍，更优选为增加至少I. 4倍，进一步优选为增加至少I. 5倍，最优选为增加至少I. 6倍。根据本发明，微生物是在有氧条件下进行发酵。优选的，微生物培养物在通气和营养介质中进行发酵，介质中含有或加入了至少一种卟啉化合物。在优选的实施方式中，LAB在通气条件下于含B卜啉的营养介质中培育，这在W000/0542中有描述,其中，所述介质进一步含有至少一种产率增加剂，其选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。W000/0542作为参考附件。本领域的技术人员可用熟知的技艺进行通气，例如，通过摇动或搅拌培养介质，或通过向培养介质中通入含有氧的如空气的气体混合物。在优选的实施方式中，所述产率增加剂是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸，以及它们的衍生物组成的组。所述产率增加剂可以是嘌呤碱基，优选是选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤组成的组。所述产率增加剂可以是嘧啶碱基，优选是选自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的组。所述产率增加剂可以是核苷，优选的是，其中所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧肌苷组成的组。在优选的实施方式中，所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、胸苷和肌苷组成的组。最优选的是，其中所述的核苷是肌苷。所述产率增加剂可以是核苷酸，优选的，所述核苷酸是选自由腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、黄嘌呤单磷酸(XMP)、肌苷单磷酸(IMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸( dGMP)、胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧黄嘌呤单磷酸(dXMP)和脱氧肌苷单磷酸(dIMP)组成的组。在优选的实施方式中，所述核苷酸是选自由AMP、GMP、UMP、CMP、XMP和MP组成的组。最优选的，所述核苷酸是頂P。一优选的实施方式是，所述培养介质包含至少两种产率增加剂，优选是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组。优选的，所述培养介质包含至少两种产率增加剂，选自由核苷和核苷酸组成的组。最优选的是，其中所述核苷是肌苷，所述核苷酸是IMP。一优选的实施方式是，其中所述培养介质起始为包含l_70mM的各产率增加剂。更优选的，其中所述培养介质起始为包含l_60mM的各产率增加剂，例如
I.3-60mM,如 I. 5-50mM,优选为 2_40mM，如 2. 5-30mM,例如 3_20mM，更优选为 3_15mM，例如4-10mM,如约 7mM。令人吃惊的是，通过本发明的方法，有时可获得浓度足以用于生产F-DVS而无需浓缩培养物的LAB培养物。但是，即使采用本方法，但大多数培养物需经过浓缩而获得商用的弓I子培养物。这样的培养物可优选通过离心或超过滤而收集和浓缩。在一优选的实施方式中，微生物的培养是在高光学密度条件的工业相关条件下进行的。因此，一优选的实施方式是培养物的高光学密度(OD)在600nm的Icm光程介质中达到 OD600 = IO-OD600 = 200，更优选的是 OD600 = 15 -0D- = 100，进一步优选的是 OD600 =20-0D— = 90，最优选的是 OD600 = 25-0D— = 80。另外，优选的实施方式中，培养过程是在含有5L-100，000L，优选300L-20，000L的
培养介质的大式发酵器中进行。—优选的实施方式中，培养过程包括控制温度和/或pH。优选的，培养物包括一种或多种有机物,选自由双歧杆菌属(Bifidobacteriumspp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、丙酸菌属(Propionibacterium spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)(包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. cremoris,))、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)(包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus))、链球菌属(Streptococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcusspp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)和酒球菌属(Oenococcus spp.)。培养物可包含一种或多种最适宜的生长温度在约30°C的嗜温有机物，优选一种或多种选自由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp. cremoris)、肠膜明串珠菌乳月旨亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp. casei)和副干酪乳酸杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp. paracasei)组成的组中的嗜温有机物。培养物可包含一种或多种最适宜的生长温度在约40°C到约45°C的嗜热有机物，优选一种或多种选自由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp. lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusac i dophi Ius)组成的组中的嗜热性有机物。优选的培养物是LAB-培养物,其包含一种或多种选自由乳球菌属(Lactococcusspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcusspp.)和双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)组成的组中的有机物。培养物可以是LD-培养物，其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酸乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar. diacetylactis)和肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp. cremoris)组成的组中的有机物。培养物可以是0-培养物，其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp. cremoris)组成的组中的有机物。在优选的实施方式中，培养物中含有乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。商业的引子培养物通常可以冷冻的培养物的形式供给。在低温下，在这样的冷冻的培养物中，通常细胞的大部分代谢活动停止，但细胞可在该悬浮液中在一段延长的时间内维持其活力。由于浓缩的冷冻培养物可直接在生产容器中进行培养，从而在商业上非常吸引人。通过使用这样的浓缩的冷冻培养物，最终用户消除了费时费力的中间发酵步骤，在该步骤中，引子培养物经扩增，且最终用户还进一步减少了烈性污染的危险。这样的浓缩的培养液可被称为DVS-直投式 培养物。也可以制备FD-DVS ，浓缩的冻干的直投式 培养物来代替浓缩的冷冻培养物。这样的培养物具有额外的优势，它们的优点是可不用冷冻而进行运输。因此，在一优选的实施方式中，用于制备产率增加的微生物培养物的方法如下所述并进一步包括iii)冷冻所述收集的微生物以获得冷冻的微生物细胞。所述方法可进一步包括iv)从所述冷冻的细胞中使水分升华以获得冻干的细胞。换句话说，其中所收集的微生物培养物转化为冻干的细胞培养物。该方法可进一步包含V)包装由上述步骤iii)或iv)中获得的细胞。、
通常观察到冷冻和解冻对活的细胞的存活能力会产生破坏性影响。这些影响一般被描述为细胞脱水和在冷冻过程中在细胞溶质中形成冰晶。然而，可使用若干冷冻保护剂来保证在可控的和造成最低伤害的形式下进行冷冻，例如保证在冷冻过程中细胞溶质中不发生冰晶化或将冰晶化抑制到最小。优选的，向收集的微生物中加入至少一种冷冻保护剂。优选的，冷冻保护剂是选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。优选的适合于加入到收集的微生物中的优选的冷冻保护剂的例子基本上对应于在此描述的优选的产率增加剂。向收集的微生物中加入冷冻保护剂在早先提出的专利申请PCT/DK2004/000477中有过描述。在PCT/DK2004/000477中描述的优选的冷冻保护剂也是本发明中的优选的冷冻保护剂。PCT/DK2004/000477的全部内容在此并入作为参考。
本发明的另外的实施方式是在此描述的制备产率增加的微生物培养物的方法，并进一步包含通过喷雾干燥、真空干燥、空气干燥或任何适用于干燥细菌培养物的干燥方法来干燥收集的微生物。优选的本发明的第二方面的引子培养物是以弓I子培养物浓缩物的形式提供，例如含有至少IO8CFU的引子培养物有机物。本发明的第三方面涉及一种培养介质，其包含至少一种产率增加剂，选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸以及它们的衍生物组成的组。尽管在发酵过程中大量的产率增加剂被消耗，仍有足够量的保留于培养物的上清液中以确保浓缩的培养物可被确认为本方法得出的介质(见实施例5或6)。优选的本发明的第四方面的食物制品是选自由奶制品、蔬菜制品、肉制品、饮料、果汁、酒和焙烤制品组成的组。优选的奶制品是选自由奶酪、酸奶、黄油和接种的甜奶和液体发酵乳制品组成的组。在一有趣的方面，本发明提供了获得产率增加的由微生物产生的化合物的方法，所述方法包含以下步骤i)在含有至少一种选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或任何这样的化合物的一种或多种衍生物组成的组中的产率增加剂的培养介质中培养微生物；以及iii)获得所述由微生物产生的化合物，其中，与在相同介质中当没有可测量的产率增加剂条件下培养微生物的情况相t匕，产率增加剂导致了由微生物产生的化合物的产率的增加。由所述的微生物产生的化合物包括但不限于酶、蛋白质、代谢物、糖脂类、抗生素、细菌素、氨基酸、味素、挥发物。这些化合物可通过重组DNA技术或其它传统方法生产。本发明进一步通过以下的非限制性实施例和附图加以说明。实施例实施例I :在三种不同类型的培养介质中进行发酵的产率为了说明向已经富集的并优化的介质中加入额外的含嘌呤的化合物的作用，比较了三种类型的工业级规模的培养物。所有的三种类型的培养物菌株营养介质中进行通气培育，在该介质中，至少有一种卟啉化合物存在，或如在国际专利申请WO 00/05342 (EMIL方法)那样被添加，并且，在所有的情况下，这种培养物是所谓的“0-培养物”，其包含乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp. lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. cremoris)。0-培养物通常被用于制作无孔奶酪(Cheddar, Cheshire, Feta)。具体的培养物可通过商业渠道获得，商品名为 R 604,由 Hansen A/S, Hoersholm, Denmark (目录号:200113)提供。三种介质不于表I中。
基拙培养 指定的培养物加入的酶提取物其它添加物
介质
^旧的EMIL1.7 %w/w标准酵母提
BD-5-ex3*
(Old EMIL)取物林
~新的EMIL1.7 %w/w新的酵母■!是
BD-5-ex3*
(NewEMIL)取物 **
~超级 EMIL1.7 %w/w 新的酵母提 0.2 %w/w IMP***
BD-5-ex3*
(Super EMIL)取物林0.2 %w/w 肌苷 00*BD-5-ex3是根据WO 00/05342和WO 01/52668的优化的含卟啉的培养介质。#标准酵母提取物和新的酵母提取物是两种可通过商业渠道获得的酵母提取物。***IMP 是肌苷-5'-单磷酸(IMP) (Alsiano A/S, Birkeroed, DK)。00 月几苷是肌苷(Alsiano A/S, Birkeroed, DK)。培养过程是在550L或10，000L的工业发酵槽中在30°C下，使用0. 5% (w/w)的上述作为接种体的培养物进行的。发酵是按WO 00/05342中所描述那样在有氧条件下进行。发酵物可酸化到pH为6. 2。然后，通过可控地添加13. 4N NH4OH而将pH维持在6. 2。当没有进一步的碱的消耗被检测出时，冷却相应的培养物到约10°C。冷却后，培养介质中的细菌通过离心被浓缩到6-18倍，然后在液氮中I个大气压下冷冻成小球，制成所谓的冷冻直投式培养物(F-DVS)。F-DVS小球被储存在_50°C待进一步分析。通过两种不同方式来确定发酵的产率，I)通过以在600nm测量的光学密度(0D_)表示的获得的生物质量，或者2)通过在实施例2 :分析过程QAm-043中描述的Pearce测试中的具有“酸化活性”为4. 8-5. I的F-DVS培养物的kg数。结果示于下表2中。表2.以0D_测量的发酵产率
权利要求
1.通气和高光学密度条件下发酵，获得增加产率的乳酸菌培养物的方法，该方法包括以下步骤 i)在培养介质中于一定条件下培育乳酸菌，使得发酵进行到在600nm测定的光学密度(OD6J为10，其中所述培养介质包含至少一种卟啉化合物和至少一种产率增加剂，所述产率增加剂选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组，其浓度为确保在发酵结束时培养介质含有至少I U M的所述至少一种产率增加剂，其中所述衍生物选自5-甲基胞嘧啶CfeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤；以及 ii)收集所述乳酸菌以获得乳酸菌培养物， 其中，与在相同条件下和在含有少于IuM的各产率增加剂的相似介质中来培养微生物相比，在发酵结束时产率增加剂增加了收集到的乳酸菌的产率。
2.根据权利要求I的方法，其中，所述培养介质最初含有至少ImM的至少一种产率增加剂，其选自由一种或多种用于核酸的生物合成中的化合物或者由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组，其中所述衍生物选自5-甲基胞嘧啶(sfeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
3.根据前述任意一项权利要求的方法，其中，所述培养介质是复合物发酵介质，向每升该介质中加入至少0. 2g的至少一种产率增加剂。
4.根据权利要求I的方法，其中，所述至少一种产率增加剂是在发酵过程中加入的。
5.根据权利要求I的方法，其中，所述高光学密度的条件的特征是在发酵结束时0D_闻于15。
6.根据权利要求I的方法，其中，所述产率增加至少I.2倍。
7.根据权利要求I的方法，其中，所述产率增加剂是嘌呤碱基，该嘌呤碱基选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤组成的组。
8.根据权利要求I的方法，其中，所述产率增加剂是嘧啶碱基。
9.根据权利要求8的方法，其中，所述嘧啶碱基是选自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的组。
10.根据权利要求I的方法,其中,所述产率增加剂是核苷。
11.根据权利要求10的方法，其中，所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧肌苷组成的组。
12.根据权利要求11的方法，其中，所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和肌苷组成的组。
13.根据权利要求12的方法，其中，所述核苷是肌苷。
14.根据权利要求I的方法，其中，所述产率增加剂是核苷酸。
15.根据权利要求14的方法，其中，所述核苷酸是选自由腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、黄嘌呤单磷酸(XMP)、肌苷单磷酸(IMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧黄嘌呤单磷酸(dXMP)和脱氧肌苷单磷酸(dIMP)组成的组。
16.根据权利要求15的方法，其中，所述核苷酸是选自由AMP、GMP、UMP、CMP、XMP和IMP组成的组。
17.根据权利要求16的方法，其中，所述核苷酸是IMP。
18.根据权利要求I的方法，其中，所述培养介质包含至少两种产率增加剂，选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组，其中所述衍生物选自5-甲基胞嘧啶CfeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
19.根据权利要求18的方法，其中，所述培养介质包含至少两种产率增加剂，选自由核苷和核苷酸组成的组。
20.根据权利要求19的方法，其中，所述核苷是肌苷，所述核苷酸是IMP。
21.根据权利要求I的方法，其中，所述培养介质起始包含l_70mM的各产率增加剂。
22.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含l_60mM的各产率增加剂。
23.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含I.3-60mM的各产率增加剂。
24.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含I.5-50mM的各产率增加剂。
25.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含2-40mM的各产率增加剂。
26.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含2.5-30mM的各产率增加剂。
27.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含3-20mM的各产率增加剂。
28.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含3-15mM的各产率增加剂。
29.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含4-10mM的各产率增加剂。
30.根据权利要求21的方法，其中，所述培养介质起始包含7mM的各产率增加剂。
31.根据权利要求I的方法，其中，培养介质的OD_达到一光学密度为OD_=10-0D_=200。
32.根据权利要求I的方法，其中，培养介质的OD_达到一光学密度为OD_= 15-OD_=100。
33.根据权利要求I的方法，其中，培养介质的OD_达到一光学密度为OD_= 20-0D_=80。
34.根据权利要求I的方法，其中，培养过程是在含有5L-100，000L的培养介质的大式发酵器中进行。
35.根据权利要求I的方法，其中，培养过程是在含有300L-20，000L的培养介质的大式发酵器中进行。
36.根据权利要求I的方法，其中，培养过程包括控制温度和/或pH。
37.根据权利要求I的方法，其中，培养物包括一种或多种有机物，选自由双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸菌属、包括乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的乳球菌属、包括嗜酸乳杆菌的乳酸杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳酸片球菌属、明串珠菌属和酒球菌属组成的组。
38.根据权利要求I的方法，其中，培养物包含一种或多种具有最适宜的生长温度在30°C的嗜温有机物。
39.根据权利要求I的方法，其中，培养物包含一种或多种选自由乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种、干酪乳杆菌干酪亚种和副干酪乳杆菌副干酪亚种组成的组中的嗜温有机物。
40.根据权利要求I的方法，其中，培养物包含一种或多种具有最适宜的生长温度在40 V到45 V的嗜热有机物。
41.根据权利要求I的方法，其中，培养物包含一种或多种选自由嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸性乳杆菌组成的组中的嗜热有机物。
42.根据权利要求I的方法，其中，培养物是LD-培养物，其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种和肠膜明串珠菌乳脂亚种组成的组中的有机物。
43.根据权利要求I的方法，其中，培养物是O-培养物，其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种组成的组中的有机物。
44.根据权利要求I的方法，其中，培养物包含乳酸乳球菌。
45.根据权利要求I的方法，所述方法进一步还包括 iii)冷冻所述收集的微生物以获得冷冻的微生物细胞。
46.根据权利要求45的方法，所述方法进一步还包括 iv)从所述冷冻的细胞中使水分升华以获得冻干的细胞。
47.根据权利要求45或46的方法，所述方法进一步还包括 V)包装由上述步骤iii)或iv)中获得的细胞。
48.根据权利要求44-46中任意一项的方法，其中，向收集的微生物中加入至少一种冷冻保护剂。
49.根据权利要求47的方法，其中，向收集的微生物中加入至少一种冷冻保护剂。
50.一种培养介质，其包含至少一种产率增加剂和至少一种卟啉化合物，所述产率增加剂选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸以及它们的衍生物组成的组。
51.根据权利要求50的培养介质，其中，所述介质如权利要求I所定义。
全文摘要
本发明涉及一种化合物在生物合成核酸以增加细菌培养物的产率中的应用。微生物引子培养物。更具体的，制备微生物发酵剂培养物的方法，其中，微生物在包含至少一种产率增加剂的培养介质中被接种，该产率增加剂是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸以及它们的衍生物组成的组。该微生物引子培养物可用于生产食物制品、饲料制品和医药制品。
文档编号C12N1/38GK102747026SQ201210207738
公开日2012年10月24日 申请日期2006年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者克里斯蒂·加里格斯, 尼尔斯·马丁·索罗森, 罗格·温德尔·克林格拉姆, 苏珊娜·格恩, 马丁·B.·皮德森 申请人:科·汉森有限公司