专利名称：一种辅助鉴定翦股颖属植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定剪股颖属植物的方法。
背景技术：
草坪草是一种城市绿化植物，也广泛应用于体育场地、高速公路及河岸提坡防 护、消除污染等方面，体现了巨大的生态效益。草坪草种类繁多，生长环境迥异，按气候条 件分类可分为暖季型草坪草和冷季型草坪草，按不同科属分类可分为禾本科虎尾草亚科 Poaceae (Gramineae) (7 个属)、黍亚科 Panicoideae (6 个属)、早熟禾亚科 Pooideae (12 个 属)，以及莎草科Cyeraceae O个属)和豆科及旋花科的一些品种等。剪股颖属(Agrostis L)植物为禾本科早熟禾亚科多年生草本，是世界上最重要的冷季型草坪植物之一，喜冷凉 湿润气候，耐寒能力强，绿期长，观赏效果好，广泛用于庭院、公园等地的观赏性草坪，其优 良品种用于高尔夫球场果岭区绿化。在草坪草杂交育种工作中，为了提高杂交育种的效率和成功率，需要选用亲缘关 系较近且品质优良的两个品种进行杂交。因此杂交育种的前期工作，就是要明确每个品种 的亲缘关联、隶属关系等。长期以来，生物学家主要通过形态学和解剖学证据划分不同的物 种，但这些表型特征种类有限，且容易受到环境因素和发育阶段的影响，加之自然选择导致 的普遍趋同效应和平行进化因素等，使得物种系统发育关系的判断困难重重。草坪草对环 境的忍受力较强，可以在各种环境下生存，长期自然或人工选择的结果，使得自然界中产生 了各种各样的草坪草类型，包括各种各样的生态类型、丰富多彩的野生资源等。如果不能高 效准确的鉴别草坪草不同的基因型，确认它们之间的亲缘关系，杂交育种的亲本选择就存 在一定的盲目性，多样化草坪草基因资源的利用就会受到极大的限制。基因作为遗传信息的载体，保留了很多进化的痕迹，同一基因在不同物种中的序 列差异可以作为分类鉴定的分子标记，具有信息量大、能够稳定遗传等优点。2002年，Frits Goedegebuur利用简并引物于来自22个不同种属的真菌中分离了糖基水解酶12家族的15 个新成员，并结合SwissProt等蛋白质数据库中的氨基酸数据，分析了所有已知糖基水解 酶12家族的系统发育关系，发现该家族分为四个亚家族，同一亚家族的家族成员分布在同 一属中或近似属中。1990年，Woese利用16S rRNA基因构建的系统进化树，在分子水平上 将整个生物界分为三个域古细菌、真细菌和真核生物，有力的支持了三界学说，得到大多 数学者的赞同。2003年，刘占林等使用5S rRNA基因序列考察裸子植物的系统发育关系， 发现不同裸子植物样本间5S rRNA基因序列平均相似度高达94.4%，而包括小麦、水稻和 玉米在内的六种被子植物的5S rRNA基因序列相似度为97. 6%，裸子植物与被子植物之间 为88. 1%，作为原始被子植物的木兰属植物与裸子植物有90. 8%的相似性，由此推测出裸 子植物和被子植物的进化路径。杨玲玲(2000年)在研究拟诺卡氏菌系统发育关系时，分 析了拟诺卡氏菌属内不同种的看家基因gyrB和16SrRNA基因序列，并构建系统进化树，发 现gyrB基因的建树效果要优于16SrRNA基因，二者所建进化树拓扑结构相似，但gyrB基因 树的分歧度和各分支的自展值更高，说明利用编码蛋白质基因构建物种系统进化树具有较高的分辨率，效果更好。2009年，刘念等人研究南洋杉科系统发育关系时采用了多基因联合 建树的方法，利用核18S rRNA和^S rRNA、叶绿体16S rRNA、rbcL、matK和rps4以及线粒 体coxl和atpl等8个基因的DNA序列，构建了南洋杉科的分子系统树，确定瓦勒迈杉属与 贝壳杉属聚在一支，南洋杉属单独分为一支。 1993年，叶绿体DNA的限制性内切酶酶切图谱曾被用于研究草坪草及禾本科作 物的系统进化关系。M. Yaneshita等人采用PstI、BioI和BamH I三种酶构建了包括5 禾中冷季型草评草(Agrostis stolonifera、Lolium multiflorum、Festuca arundinacea、 Festuca rubra、Poa pratensis)、6 禾中暖季型草评草(Cynodon dactylon> Chlor is gay ana > Eragrostis eurvula> Zoysia japonica> Eremoehloa ophiuroides、PaspaIum notatum) 禾口 4 禾中(Triticum aestivum> Hordeum vulgate> Zea mays、Oryza sativa) 的禾本科14个种的酶切图谱，聚类结果显示，草坪草分为三大支，全部的冷季型草坪草聚 为一支，暖季型草坪草分为画眉草亚科(Eragrostoideae)和黍亚科(Panicoideae)两个 大支，除了黑麦草属和羊茅属外，其他聚类关系均与传统分类学相一致。羊茅属的高羊茅 (Festuca arundinacea)与多花黑麦草(Lolium multiflorum)聚为一支，而后才与紫羊茅 (Festuca rubra)聚为一个大支，这与传统分类学关系相悖。此后，很多叶绿体基因rbcL、 ndhF、rpoC2、rps4和核基因rDNA序列也被用来研究禾本科的系统发育关系。2000年，Sarah Mashews对禾本科51个种属的光敏色素B (phytochrome B, PHYB)的核DNA序列进行系统 发育分析，构建了禾本科物种的PHYB基因树，拓扑结构显示其基部主要分支结构与之前报 道的叶绿体基因树相符，且对于近缘种有更高的区分度，可以将rbcL基因无法区分的竹族 (Bambuseae)、稻族(Oryzeae)和早熟禾族(Poeae)内姐妹群的进化关系加以辨别。2007 年，Christopher Saski 全面考察了包括 Hordeum vulgare> Sorghum bicolor> Agrostis. Stolonifera> Oryza sativa>Oryza. nivara>Saccharum hybrids Saccharum officinarum> Triticum aestivum和ka Mays在内的九种重要禾本科植物叶绿体基因组，利用61个蛋 白质编码基因分别以最大简约法(maximum parsimony method)和最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树，拓扑结构基本一致。2006年，张道远采用4种分子标 记技术对包括匍茎剪股颖、巨序剪股颖及红顶草在内的7种剪股颖共58个个体的遗传分化 和系统关系进行研究，筛选出9个RAPD引物、2个SSR引物、5个ISSR引物及1个SCAR标 记，采用最大简约法和距离法对7种剪股颖植物进行系统树分析，其中匍茎剪股颖和红顶 草构成单系类群并得到100%的置信支持，红顶草显示了匍茎剪股颖特异性特征谱带，但同 时具有不同于匍茎剪股颖的遗传分化，认为红顶草为匍茎剪股颖一个变种。2009年，尚以顺 等采用ISSR标记技术，对贵州的4个匍匐剪股颖居群共285个个体进行了遗传变异分析， 9个引物共扩增出81条带，其中多态性条带66条，无论是在居群水平还是在物种水平，均 表明贵州野生匍匐剪股颖居群存在丰富的遗传变异。3个野生居群间遗传分化系数((ist) 为0. 4920，居群间基因流的估测值(Nm)为0. 5164，表明居群间存在较为严重的遗传分化； 亚居群间的遗传距离(⑶)为0.0877 0.5926，遗传距离(⑶)的聚类分析结果与居群地 理分布存在密切联系。利用SPSS 11. O软件对地理距离与亚居群间遗传距离相关性进行分 析，表明地理距离与遗传距离呈显著正相关(r = 0. 494)；用P0PGENE 1. 31软件对居群间 的遗传关系分析表明，各居群间的遗传一致度比较高，分布为0. 7003 0. 9409，但栽培居 群(KROMI)与其他3个野生居群存在明显的遗传差异。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定剪股颖属植物的方法。本发明提供了辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的引物对，由序列表的序列1所 示DNA(DNA区段)和序列表的序列2所示(DNA区段)区段组成。所述引物对可用于制备辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的试剂盒。所述引物对可用于辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物。本发明还保护一种辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的方法，包括如下步骤以 待测植物的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物，待测 植物为候选的剪股颖属植物。所述PCR扩增产物具体可为35!3bp。所述待测植物具体可为剪股颖属(Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属 (Festuca)植物、结缕草属(Zoysia)植物、黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon) 植物。所述剪股颖属植物具体可为A4(中英文名称均为PennA4)、Century、Putter、 hcbpendence、Declaration、L93、Shark、NTAS、FTAS 或 Backspin。所述早熟禾属植物具体 可为Nuglade (中文名称为新哥求德，英文名称为NuGlade)、America (中文名称为美洲王， 英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award) Joumei (中文名称为优 美,英文名称为Euromyth)、Carbenet, Freedom3 (中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3) ,Dayuejin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng (中文名称为珠 峰，英文名称为Everest)。所述羊茅属植物具体可为PicasscKQiangjin (中文名称为强劲， 英文名称为hferno)、Dynasty (中文名称为王朝，英文名称为Dyansty)、Starlet (中文名 称为新秀，英文名称为Marlet)、Day (中文名称为帝王，英文名称为Diva)、Arid3 (中文名 称为爱瑞3，英文名称为Arid 3)或Hoimdog (中文名称为猎狗5，英文名称为Hoimdog 5)。 所述结缕草属植物具体可为结缕草(英文名称为Lawngrass)或青岛结缕草(英文名称为 Qingdao Lawngrass)。所述黑麦草属植物具体可为LeishenIV(中文名称为雷神4号，英文 名称为Blazer 4) ,Cutter或Qi jian。所述狗牙根属植物具体可为狗牙根不脱壳包衣(中 文名称为狗亚根(不脱壳，包衣)，英文名称为Common Burmudagrass)或狗牙根脱壳(中文 名称为狗亚根(脱壳)，英文名称为Unhulled Burmudagrass)。本发明还保护辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的试剂盒，包括引物对甲；所述 引物对甲由序列表的序列1所示DNA(DNA区段)和序列表的序列2所示DNA(DNA区段)组 成。所述试剂盒还可包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA (DNA区 段)和序列表的序列4所示DNA(DNA区段)组成。所述试剂盒可用于辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物。本发明还保护辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的方法，包括如下步骤以待测 植物的基因组DNA为模板，分别用所述引物对甲和所述引物对乙进行PCR扩增；如果用所述 引物对甲能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到PCR扩增产物，待测植物为候选的 剪股颖属植物；如果用所述引物对甲不能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到PCR
5扩增产物，待测植物为候选的非剪股颖属植物。用所述引物对甲得到的PCR扩增产物具体可为35!3bp。用所述引物对乙得到的PCR扩增产物具体可为338bp。所述待测植物具体可为剪股颖属(Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属 (Festuca)植物、结缕草属(Zoysia)植物、黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon) 植物。所述剪股颖属植物具体可为A4(中英文名称均为PennA4)、Century、Putter、 hcbpendence、Declaration、L93、Shark、NTAS、FTAS 或 Backspin。所述早熟禾属植物具体 可为Nuglade (中文名称为新哥求德，英文名称为NuGlade)、America (中文名称为美洲王， 英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award) Joumei (中文名称为优 美,英文名称为Euromyth)、Carbenet, Freedom3 (中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3) >Dayuej in (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng (中文名称为珠 峰，英文名称为Everest)。所述羊茅属植物具体可为PicasscKQiangjin (中文名称为强劲， 英文名称为hferno)、Dynasty (中文名称为王朝，英文名称为Dyansty)、Starlet (中文名 称为新秀，英文名称为Marlet)、Day (中文名称为帝王，英文名称为Diva)、Arid3 (中文名 称为爱瑞3，英文名称为Arid 3)或Hoimdog (中文名称为猎狗5，英文名称为Hoimdog 5)。 所述结缕草属植物具体可为结缕草(英文名称为Lawngrass)或青岛结缕草(英文名称为 Qingdao Lawngrass)。所述黑麦草属植物具体可为LeishenIV (中文名称为雷神4号，英文 名称为Blazer 4)、Cutter或Qi jian。所述狗牙根属植物具体可为狗牙根不脱壳包衣(中 文名称为狗亚根(不脱壳，包衣)，英文名称为Common Burmudagrass)或狗牙根脱壳(中文 名称为狗亚根(脱壳)，英文名称为Unhulled Burmudagrass)。本发明通过对不同草坪草种属品种抗逆性基因AsEXPl的克隆，分析其序列位点 差异，了解该基因在不同种属间的变异规律，并通过种属间序列特征分析，筛选得到了剪股 颖属草坪草特异性分子标记，以及用于鉴定所述分子标记的特异引物对。本发明提供的特 异引物对(CAs3F/CAs3R)可以辅助鉴定剪股颖属品种，可以用于草坪草种属品种的鉴定、 亲缘关系分析及进化路径分析等，并为草坪草的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提 供理论基础和技术支持。
图1为利用cAslF/cAslR对不同草坪草品种基因组DNA的PCR扩增结果；泳道1_6 依次为 A4、Century、Carbenet、Award、Starlet、Arid3 ；Μ, DL2000 ladder。图2为基于AsEXPl基因片段序列多态性建立的草坪草不同种属间系统进化树。图3为3个属6个草坪草品种AsEXPl基因片段序列比对结果。图4为2种引物组合对草坪草3个属6个品种的PCR扩增结果；A 采用cAs3F和 cAs3R组成的引物对；B 采用cAs2F和cAs2R组成的引物对；泳道1_6依次为草坪草品种 A4、Century>Carbenent>Award>Starlet、Arid3。图5为2种引物组合对草坪草6个属32个品种的PCR扩增结果；A 采用cAs3F和 cAs3R组成的引物对；B 采用cAs2F和cAs2R组成的引物对；1 :A4 ；2 =Century ；3 =Putter ； 4 Independence ；5 !Declaration ；6 :Nuglade ；7 America ；8 Award ；9 Youmei ；10 结缕草；11 =Picasso ；12 =Qiangjin ；13 =Dynasty ；14 =Starlet ；15 =Day ；16 狗牙根不脱壳包 衣；17 :L93 ；18 =Shark ；19 =NTAS ；20 =FTAS ；21 =Backspin ；22 =Carbenet ；23 :Freedom3 ； 24 =Dayuejin ；25 =Zhufeng ；26 青岛结缕草；27 :Arid3 ；28 =Houndog ；29 =LeishenIV ；30 Cutter ；31 =Qijian ；32 狗牙根脱壳。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。实施例1、草坪草种属特异性分子标记的筛选和特异引物对的设计一、AsEXPl基因片段克隆及序列分析从草坪草剪股颖属、早熟禾属、羊茅属中随机选取各2个品种(A4、CentrUy为剪股 颖属，Carbenet, Award为早熟禾属，Marlet、Arid3为羊茅属)，以基因组DNA为模板，用 cAslF和cAslR组成的引物对进行AsEXPl基因的同源片段扩增(见图1)。结果显示，所有 检测品种在460bp左右均有一特异性条带，不同品种草坪草的同源片段大小相近，在1. 5% 的琼脂胶上无法分辨。二、AsEXPl基因片段的同源性比较分析将上述扩增的条带切割、回收并克隆，测序后去除内含子部分并进行序列比对。图 3为多重序列比对结果(所注碱基位置均以统一序列为准)，可以看出不同品种间序列呈现 多态性，并显示出很好的属间特异性。其中，剪股颖属的2个品种AsEXPl基因同源片段长 度为368bp，早熟禾属为359bp，羊茅属为371bp。与剪股颖属相比，早熟禾两个品种在261 到270bp处有9bp的缺失，羊茅属两品种在40到43bp处有一个!3bp的插入。在核苷酸替 换方面，剪股颖属的两个品种在30bp和31bp处为GG，而其它2个属的品种为CT ；在240bp 处，剪股颖属为G，其他属为C ；早熟禾在116、117、119bp处分别为G、T、G，而另外2个属的 品种皆为A、G、C ；在处，早熟禾属品种碱基分别为G、T、C，而其他属品种碱 基为C、Gλ G0表1为同源性比对结果，同属内不同品种间同源性很高，同为剪股颖属的Α4和 Century的同源性为99. 46%，同为早熟禾属的Carbenet和Award为99. 72%，同为羊茅属 的Marlet和和Arid3的同源性为97. 04%；不同属的品种间的差异相对较大，如Carbenet 和Century同源性仅为91. 92%。表1不同品种间AsEXPl基因片段序列两两同源率比较结果(DNAMAN比对结果)
权利要求
1.辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的引物对，由序列表的序列1所示DNA和序列表 的序列2所示DNA组成。
2.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述引物对在辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物中的应用。
4.一种辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的方法，包括如下步骤以待测植物的基因 组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物，待测植物 为候选的剪股颖属植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物为353bp；所述待测植 物为剪股颖属(Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属(Festuca)植物、结缕草属 (Zoysia)植物、黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon)植物。
6.辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的试剂盒，包括引物对甲；所述引物对甲由序列 表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括引物对乙；所述引物对 乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
8.权利要求6或7所述试剂盒在辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物中的应用。
9.一种用权利要求7所述试剂盒辅助鉴定剪股颖属(Agrostis)植物的方法，包括如 下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，分别用所述引物对甲和所述引物对乙进行PCR扩 增；如果用所述引物对甲能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到PCR扩增产物，待测 植物为候选的剪股颖属植物；如果用所述引物对甲不能得到PCR扩增产物且用所述引物对 乙能得到PCR扩增产物，待测植物为候选的非剪股颖属植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于用所述引物对甲得到的PCR扩增产 物为35!3bp ；用所述引物对乙得到的PCR扩增产物为338bp ；所述待测植物为剪股颖属 (Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属(Festuca)植物、结缕草属(Zoysia)植物、 黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon)植物。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定翦股颖属植物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物，待测植物为翦股颖属植物。本发明通过对不同草坪草种属品种抗逆性基因AsEXP1的克隆，分析其序列位点差异，了解该基因在不同种属间的变异规律，并通过种属间序列特征分析，筛选得到了翦股颖属草坪草特异性分子标记。本发明提供的特异引物对(cAs3F/cAs3R)可以辅助鉴定翦股颖属品种，可以用于草坪草种属品种的鉴定、亲缘关系分析及进化路径分析等，并为草坪草的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持。
文档编号C12Q1/68GK102146471SQ20111005125
公开日2011年8月10日 申请日期2011年3月3日 优先权日2011年3月3日
发明者徐倩, 徐吉臣, 徐筱, 白晨喜 申请人:北京林业大学