专利名称：一种哈氏弧菌dna疫苗及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌DNA疫苗及其构建方法和应用。
背景技术：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性细菌，广泛分布于海洋环境中，能侵染甲壳类动物和多种鱼类，引发出血性败血症并导致死亡，是水产养殖动物的重要致病菌。目前对哈氏弧菌病的防治以抗生素和化学药物为主，尚无有效的疫苗。DNA疫苗是一种分子疫苗，其构建原理是将疫苗抗原基因借助于真核表达载体在机体内表达，进而引发细胞和体液免疫反应，产生抗体，诱发一系列保护性免疫应答，从而达到防治疾病的目的。研究表明，DNA疫苗既能诱发体液免疫也能诱发细胞免疫，并且其免疫效应时间很长。另外，DNA疫苗具有稳定、制备简单、可长期储存和安全性高等优点，因而是一种具有良好应用和发展前景的疫苗形式。
发明内容
本发明目的在于提供一种哈氏弧菌DNA疫苗及其构建方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种哈氏弧菌DNA疫苗所述疫苗抗原为哈氏弧菌degQ和vhpl碱基序列所示。所述疫苗为经修饰的重组质粒pDQ和质粒pID2连接后转化入大肠杆菌所得重组菌株。所述重组质粒pDQ为1)质粒pBSQ的构建以哈氏弧菌为模板，采用QFl和QRl为引物进行PCR扩增， PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌 DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal)和My g/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18 小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒PBSQ，待用；2)质粒pBSV的构建以哈氏弧菌为模板，采用VFl和VRl为引物进行PCR扩增， PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌 DH5a 后在含有Ap (100 μ g/ml))、40 μ g/ml X-gal 和 24 μ g/ml IPTG 的 LB 固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSV，待用；3)将质粒pBSQ用SmaI酶切回收1.31Λ片段，同时将质粒PID2用EcoRV酶切回收6. 11Λ片段；将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5ci后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养24小时，挑取转化子，提取质粒，即为pDQ。所述经修饰的重组质粒pDQ和质粒pID2连接后转化入大肠杆菌所得重组菌株；即为将所述质粒pDQ再用SmaI酶切后回收7. 4kb片段，同时将pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子， 提取质粒即为重组菌株PDV。哈氏弧菌DNA疫苗的构建方法1)质粒pID2的构建质粒pIRES用EcoRI酶切，回收6. Ikb片段，使其与Linker 1用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，命名为PlDl ；再将质粒pIDl用SmaI酶切回收6. 11Λ片段，回收片段与Linker 2用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，即为PID2 ；2)质粒pBSQ的构建以哈氏弧菌为模板，采用QFl和QRl为引物进行PCR扩增， PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌 DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal)和My g/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18 小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒PBSQ，待用；3)质粒pBSV的构建以哈氏弧菌为模板，采用VFl和VRl为引物进行PCR扩增， PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌 DH5 α后在含有100 μ g/ml Ap、40 μ g/mlX-gal和24 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上培养 18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSV，待用；4)将质粒pBSQ用SmaI酶切回收1. 3kb片段，同时将质粒pID2用EcoRV酶切回收6. 11Λ片段；将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5ci后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养24小时，挑取转化子，提取质粒，即为pDQ;5)将质粒pDQ再用SmaI酶切后回收7. 4kb片段，同时将pBSV用EcoRV酶切回收 1. ^lcb片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒即为重组菌株PDV。所述Linker 1 为 5' -AATTCGATATCCATCATCACCATCACCATTGAG-3‘ ；Linker 2 为 5 ‘ -GGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTGA-3‘。所述引物序列为QFl 5' -CCCGGGCCACCATGGCGCTTCCACTCAGTGT-3'；QRl 5' -GGTCCCGGGGCGGATAACGAGGTAAACCGT-3'；VFl 5' -GATATCACCACCATGCAATCGACAGAACTCCCAAA-3'；VRl 5' -GATATCGTAACTCGCTTGGATGCTTACAC-3'。所述DNA疫苗作为对哈氏弧菌和/或副溶血弧菌免疫保护的疫苗。本发明具有如下优点1.高保护率。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达84%以上。2.交叉保护。本发明的疫苗同时还对副溶血弧菌(Vibriop parahaemolyticus有高达66%的免疫保护效率。
2.长效。本发明的疫苗在免疫后两个月的保护效率仍然可达84%。3.安全。本发明的疫苗没有任何细胞毒性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。实施例1本发明的DNA疫苗基于两个哈氏弧菌基因，S卩degQ (见Zhang Wff, Sun K，Cheng S， Sun L. Characterization of DegQVh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008 ；74 6254-62.)禾口 vhpl (见 Cheng S, Zhang WW, Zhang M, Sun L. Evaluation of the vaccine potential of a cytotoxic protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Vaccine.2010 ；28 :1041-1047.)哈氏弧菌DNA疫苗的构建方法步骤1)质粒pID2构建方法质粒pIRES (购于美国Clontech公司)用EcoRI酶切，回收6. 11Λ片段，回收片段与 Linker 1(5' -AATTCGATATCCATCATCACCATCACCATTGAG-3 ‘)用 T4DNA 连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，命名为PlDl。质粒pIDl再用SmaI酶切回收 6. Ikb 片段，回收片段与 Linker 2(5' -GGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTGA-3 ‘)用 T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的 LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，命名为pID2。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水。步骤2)质粒pDV构建方法以哈氏弧菌T4为模板，采用QFl和QRl为引物进行PCR扩增基因degQ，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 56°C 60s, 72°C 90s，5个循环后改为94°C 40s, 65°C 60s, 72°C 90s，20个循环后再在72°C延伸反应lOmin，PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于“天根生化科技有限公司，，，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、 40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal)和24 μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒PBSQ0以哈氏弧菌T4为模板，采用VFl和VRl为引物进行PCR扩增基因vhpl，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 90s，5个循环后改为94°C 40s, 63°C 60s, 72°C 90s，20个循环后再在72°C延伸反应lOmin，PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌 DH5a 后在含有六？(10(^8/1111))、4(^8/1111 Χ-gal 和 24 μ g/ml IPTG 的 LB 固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSV。将质粒pBSQ用SmaI酶切回收1. 3kb片段，同时将质粒pID2用EcoRV酶切回收6. Ikb片段；将上述回收的两片段用 T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的 LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，命名为pDQ。质粒pDQ再用SmaI酶切后回收7. 41Λ片段，同时将pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb 片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌 DH5a后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，命名为PDV，即为哈氏弧菌DNA疫苗菌株。所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC， 保藏编号为=CGMCC No. 1985，分类命名为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。所述引物序列为QFl 5' -CCCGGGCCACCATGGCGCTTCCACTCAGTGT-3'；QRl 5' -GGTCCCGGGGCGGATAACGAGGTAAACCGT-3'；VFl 5' -GATATCACCACCATGCAATCGACAGAACTCCCAAA-3'；VRl 5' -GATATCGTAACTCGCTTGGATGCTTACAC-3'；实施例2哈氏弧菌DNA疫苗的应用步骤1)疫苗制备液的制备。将上述所得质粒PDV悬浮于PBS中至终浓度为 200 μ g/ml,即为DNA疫苗制备液。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO40步骤2)疫苗的免疫注射。将100条牙鲆(每条重约9g)随机分为4组Q5条/ 组)，分别命名为A、B、C和D。将A和C组(免疫组)的每条鱼肌肉注射100 μ 1上述步骤 1)的DNA疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼肌肉注射100 μ 1 PBS。步骤幻哈氏弧菌和副溶血弧菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养哈氏弧菌Τ4 和副溶血弧菌至OD6tltl为0. 7，然后以5000g，4°C离心lOmin。收集哈氏弧菌菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为hl07cfu/ml，即为哈氏弧菌悬液；收集副溶血弧菌菌体，将其悬浮于 PBS中至终浓度为^lO8CfuAil，即为副溶血弧菌悬液。所述副溶血弧菌购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，编号为1. 2164，分类名为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤幻免疫注射后的第60天，用上述步骤 3)的哈氏弧菌悬液腹腔注射步骤幻的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100 μ 1;用上述步骤3)的副溶血弧菌悬腹腔注射步骤幻的C和D组鱼，每条鱼的注射量为100μ1。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组， 3条；B组，19条；C组，6条；D组，18条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)据此算出DNA疫苗针对哈氏弧菌的免疫保护效率为84.2%，针对副溶血弧菌的免疫保护效率为 66. 7%。故本发明的DNA疫苗能够高效并较长期性地保护牙鲆抵御哈氏弧菌感染，并对副溶血弧菌也具有较好的保护效应。
权利要求
1.一种哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述疫苗抗原为哈氏弧菌degQ和vhpl碱基序列所示。
2.按权利要求1所述的哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述疫苗为经修饰的重组质粒pDQ和质粒pID2连接后转化入大肠杆菌所得重组菌株。
3.按权利要求2所述的哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述重组质粒pDQ为1)质粒pBSQ的构建以哈氏弧菌为模板，采用QFl和QRl为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal) 和M μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒PBSQ，待用；2)质粒pBSV的构建以哈氏弧菌为模板，采用VFl和VRl为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml) ),40 μ g/mlX-gal和24 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒PBSV，待用；3)将质粒pBSQ用SmaI酶切回收1.31Λ片段，同时将质粒pID2用EcoRV酶切回收 6. Ikb片段；将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5ci后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒， 即为pDQ。
4.按权利要求2所述的哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述经修饰的重组质粒pDQ和质粒PID2连接后转化入大肠杆菌所得重组菌株；即为将所述质粒PDQ再用SmaI酶切后回收7. 4kb片段，同时将pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒即为重组菌株pDV。
5.一种权利要求1所述的哈氏弧菌DNA疫苗的构建方法，其特征在于1)质粒pID2的构建质粒pIRES用EcoRI酶切，回收6.Ikb片段，使其与Linker 1用 T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，命名为PlDl ；再将质粒PlDl用SmaI酶切回收6. Ikb片段，回收片段与Linker 2用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒，即为PID2 ；2)质粒pBSQ的构建以哈氏弧菌为模板，采用QFl和QRl为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal) 禾口 24 μ μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒PBSQ，待用；3)质粒pBSV的构建以哈氏弧菌为模板，采用VFl和VRl为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α 后在含有100 μ g/ml Ap、40 μ g/mlX-gal和24 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒PBSV，待用；4)将质粒pBSQ用SmaI酶切回收1.31Λ片段，同时将质粒pID2用EcoRV酶切回收 6. Ikb片段；将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5ci后在含有Ap(100yg/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒， 即为PDQ ；5)将质粒pDQ再用SmaI酶切后回收7.41Λ片段，同时将pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb 片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌 DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养M小时，挑取转化子，提取质粒即为重组菌株PDV。
6.权利要求4所述的哈氏弧菌DNA疫苗的构建方法，其特征在于所述Linker1为 5' -AATTCGATATCCATCATCACCATCACCATTGAG-3' ；Linker 2 为 5' -GGGGAACAAAAACTCATCTC AGAAGAGGATCTGTGA-3‘。
7.权利要求4所述的哈氏弧菌DNA疫苗的构建方法，其特征在于所述引物序列为QFl 5' -CCCGGGCCACCATGGCGCTTCCACTCAGTGT-3'；QRl 5' -GGTCCCGGGGCGGATAACGAGGTAAACCGT-3'；VFl 5' -GATATCACCACCATGCAATCGACAGAACTCCCAAA-3'；VRl 5' -GATATCGTAACTCGCTTGGATGCTTACAC-3'。
8.权利要求5所述的哈氏弧菌DNA疫苗的构建方法，其特征在于所述DNA疫苗作为对哈氏弧菌和/或副溶血弧菌免疫保护的疫苗。
全文摘要
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌DNA疫苗及其构建和应用。其构建方法利用真核表达载体pID2构建质粒pDV，将后者悬浮于PBS中即为哈氏弧菌DNA疫苗。本发明所得哈氏弧菌DNA疫苗应用简单，一次免疫即可达到高效和长期的免疫保护效果。除了对哈氏弧菌有高效免疫保护效应外，本发明的DNA疫苗对副溶血弧菌也有较好的免疫保护效应。
文档编号C12R1/63GK102240404SQ201110093149
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者孙黎, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所