专利名称：一种长柄木霉及其在防治蔬菜病害中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种长柄木霉及其在防治蔬菜病害中的应用。
背景技术：
目前，我国蔬菜种植面积已经超过15，000万亩，其中大棚蔬菜和设施园艺植物已超过2010万亩。由于蔬菜温室栽培面积的扩大和重茬连作，为病虫害的发生提供了有利的生态条件。蔬菜枯萎病，灰霉病，立枯病等多种真菌病害在蔬菜种植中普遍发生，发生严重时，造成大幅度减产，是农民在育苗、种植过程中常遇到的棘手问题。枯萎病是一类幼苗期从根部侵染、维管束内寄生的全株性病害，但一般在幼苗期较少显症。枯萎病的病原是一类称为尖镰孢的真菌(Fusarium oxysporum Schlecht) 0病株茎基部表面所见粉红色霉层是病菌的菌丝体、分生孢子和厚壁孢子。它的分生孢子又分大小两型大型分生孢子似镰刀形或新月形，淡色，基部有足细胞，3 5个横隔膜，多数3 个分隔，大小30 60X3. 5 5微米；小型分生孢子长椭圆形，淡色、单胞或有一横隔，大小5 ^X2 4. 5微米。尖镰孢菌是一类土壤中常见的真菌，有的是腐生的，但很多是植物的维管束寄生菌，引起枯萎病。枯萎病菌主要以菌丝体和厚壁孢子在病残体和土壤中越冬，病菌在土壤中有顽强的生命力，可存活6 7年。在温湿度适宜的条件下，菌丝体可产生大量的分生孢子，通过灌溉水、土壤耕作、地下害虫或土壤线虫传播。孢子发芽后从根部伤口或自然裂口或根冠侵入。侵入后，开始时扩展缓慢，至进入维管束的导管后，扩展速度加快。病菌在导管内可分泌一些分解酶，致使导管内积累许多胶状物质而堵塞导管，同时病菌还能分泌毒素毒害寄主，因而使染病植株表现萎蔫、枯死的症状。枯萎病的特点是从侵染到发病(即所谓潜育期)的时间很长，一般在一个生长季只进行一次侵染，少有再侵染发生。枯萎病的发生与下列条件密切相关(1)同属同种瓜类连作发病较重，如黄瓜、甜瓜连作，冬瓜、节瓜连作；(2)酸性土壤(如酸碱度5. 5 6. 5)，土壤过于通气、施用未腐熟的有机粪肥等均有利于发病；C3)较高的土温和气温，植物蒸腾量大，加快病情发展(一般土温在15°C以上便开始发病，气温M 最适于发病，30°C以上的高温对病菌有一定的抑制作用)；(4)地下害虫多的瓜田发病也较重。灰霉病在我国北方菜区是一种危害性很大的病害。塑料大棚、温室、小拱棚等保护设施栽培的番茄、辣椒、黄瓜、菜豆等蔬菜常发生灰霉病的流行，严重时减产达20 30% 以上。番茄灰霉病的病原是灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)，属于半知菌的一种真菌。分生孢子梗细长，有分隔和分枝，灰至灰褐色，成丛从寄主表皮长出，大小为280 550X 12 M微米。分生孢子近球形或卵形，单细胞、淡色，大小为9 15X6. 5 10微米。病菌还可产生黑褐色、不规则形的菌核。病菌寄主范围较广，除侵染茄科蔬菜外，还可侵染瓜类、甘蓝、菜豆、莴苣、洋葱、苹果等作物。病菌主要以菌丝体或微菌核随病残体或遗留在土壤中越冬，成为下一个生长季初侵染的菌源。在我国南方的病菌也可以在保护栽培设施内终年存活。病菌的分生孢子可通过风雨、昆虫、甚至农事操作而传播，条件适宜时即萌发，多从伤口或衰老、坏死组织侵入。初侵染发病后又长出大量新的分生孢子，通过传播可不断进行再侵染。目前生产上多采用化学药剂防治，但是长期大量地使用农药致使病原菌产生抗性，且严重破坏农业生态系统，造成对环境的污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种长柄木霉及其在防治蔬菜病害中的应用。本发明提供的长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)，也可称为长枝木霉，名称为Gu 4-5，已于2011年3月观日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)，保藏号为 CGMCC No. 4708。长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)Gu 4-5CGMCC No. 4708 简称长柄木霉 Gu 4_5。长柄木霉Gu 4-5可用于防治蔬菜病害。所述蔬菜病害可为如下致病菌中的至少一种引起的病害瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporium cucumerinum)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜棒抱 ^ (Corynespora cassi icola)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、灰葡萄孢菌 (Botrytis Cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solanii)禾口菌核核盘菌(Sclerotinia sclerotiorumm)。本发明还保护一种防治植物病害的制剂，它的活性成分为长柄木霉Gu 4-5。所述制剂它还可包括载体，优选农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述制剂中，所述长柄木霉可以以被培养的活细胞、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述活细胞可为分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式，优选为分生孢子或厚垣孢子的形式。所述制剂可采用多种剂型，如液剂、 乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂，优选为适于喷洒施用的剂型。根据需要，所述制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、PH调节剂等。本发明的制剂中的菌株Gu 4-5的分生孢子数量随剂型和施用的方法而变化。固体制剂中，分生孢子的数量为(1XIO5)"(IXIO8)个孢子/克，优选(1 XIO6)-(IXIO7)个孢子/克。对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量可为O. OX IO4)-(5. OX IO7)个孢子/mL，优选IO7个孢子/mL。所述制剂可以与其它适合的化学农药配合使用，从而降低化学农药剂的用量，减少对环境的污染。所述制剂可用于防治蔬菜病害。所述蔬菜病害可为如下致病菌中的至少一种引起的病害瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporium cucumerinum)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜棒抱 ^ (Corynespora cassi icola)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、灰葡萄孢菌(Botrytis Cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solanii)禾口菌核核盘菌(Sclerotinia sclerotiorumm)。本发明的长柄木霉Gu 4-5(或以长柄木霉Gu 4_5为活性成分的制剂)对环境友好，可抑制病害病原的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对蔬菜作物安全。在土壤中引进拮抗微生物，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡，为走可持续发展道路提供强劲的后盾。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的黑星病致病菌为瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporium cucumerinum)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 36060。实施例中所用的枯萎病致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 36478。实施例中所用的褐斑病致病菌为瓜棒孢霉(Corynespora cassiicola)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC36068。实施例中所用的疫病致病菌为辣椒疫霉(Phytophthora capsici)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号 ACCC 37401。实施例中所用的灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌(Botrytis Cinerea)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 36041。实施例中所用的纹枯病致病菌为立枯丝核菌(lihizoctonia solanii)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 36457。实施例中所用的菌核病致病菌为菌核核盘菌(Sclerotinia scleroiorumm)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 30096。实施例1、长柄木霉 CTrichoderma longibrachiatum) Gu 4-5 的获得和保藏一、采样从北京、河北、新疆、山东、湖北等采集土样。二、菌株分离采用涂布法分离菌株。每个土样称取10g，分别倒入加有少许吐温80、玻璃珠以及 IOOml蒸馏水无菌的500ml三角瓶中，摇勻，标号，用摇床摇30分钟。然后用微量注射器吸 5ml 土壤悬浊液于加入到含45ml灭菌蒸馏水的250ml三角瓶中，摇勻，再从250ml三角瓶中吸Iml加入到含9ml灭菌蒸馏水的试管中，进行倍比稀释，将样品梯度稀释到10_4和10_5的每个样品吸0. Iml滴于PDA平板，涂布，28°C培养48-72小时，从中挑选出产绿色分生孢子的菌落，进行斜面接种，待菌落长出后，将转接于PDA平板上分离、纯化，直到获得纯培养。 置于冰箱4°C保存。三、菌株筛选1、平皿拮抗筛选在PDA平板中心接种木霉菌块，在半径2. 5cm左右的圆周上，等距离接种3点等量不同病原菌，将每三种不同的病原菌作为一组，共有三组，每组设三个重复。用记号笔做好标记菌株编号，以备观察记录。将接种好的培养皿放于的培养箱中培养7-10d左右。隔日对所做的实验进行拍照，测量病原菌指向木霉的半径R和r。记录木霉与病原菌之间的形态特征。病菌与木霉交接后，观察病原菌对木霉菌落的包围、抑制、侵入和占领其营养空间的过程。筛选木霉菌株，依据以下原则进行(1)生长速度明显高于病原菌的木霉，能够与病原菌争夺营养，从而显著抑制病原菌的生长；(2)与病原菌之间有0. 2cm左右空隙，即产生了抑菌带，说明木霉在代谢过程中产生了某种抗生物质。结果见表1。表1木霉菌株与9种病原菌之间平皿对峙记录
权利要求
1.长柄木霉CTrichoderma longibrachiatum)，其保藏编号为 CGMCC No. 4708。
2.权利要求1所述长柄木霉在防治蔬菜病害中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述蔬菜病害为如下致病菌中的至少一种引起的病害瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporium cucumerinum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜棒3 (Corynespora cassiicola) ^1 ^ (Phytophthora capsici) > 灰葡萄孢菌(Botrytis Cinerea)、立枯丝核菌(lihizoctonia solanii)和菌核核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorumm)。
4.一种防治植物病害的制剂，它的活性成分为权利要求1所述长柄木霉。
5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于它还包括载体；所述载体为固体载体或液体载体；所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、 高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。
6.如权利要求4或5所述的制剂，其特征在于所述制剂中，所述长柄木霉可以以被培养的活细胞、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于所述活细胞为分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式，优选为分生孢子或厚垣孢子的形式。
8.如权利要求4至7中任一所述的制剂，其特征在于所述制剂的剂型为液剂、乳剂、 悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
9.权利要求4至8中任一所述的制剂在防治蔬菜病害中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述蔬菜病害为如下致病菌中的至少一种引起的病害瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporium cucumerinum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜棒3 (Corynespora cassiicola) ^1 ^ (Phytophthora capsici) > 灰葡萄孢菌(Botrytis Cinerea)、立枯丝核菌(lihizoctonia solanii)和菌核核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorumm)。
全文摘要
本发明公开了一种长柄木霉及其在防治蔬菜病害中的应用。本发明提供的长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)，其保藏编号为CGMCC No.4708。所述长柄木霉在可用于防治蔬菜病害。本发明的长柄木霉Gu 4-5(或以长柄木霉Gu 4-5为活性成分的制剂)对环境友好，可抑制病害病原的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对蔬菜作物安全。在土壤中引进拮抗微生物，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡，为走可持续发展道路提供强劲的后盾。
文档编号C12R1/885GK102212485SQ20111011826
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者左学梅, 张晓霞, 张瑞颍, 李世贵, 王爱民, 阮志勇, 顾金刚, 马晓彤 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所