专利名称：食品级异源分泌表达Ⅱa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程菌及其应用，特别涉及食品级异源分泌表达IIa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
食品在加工和保藏过程中，极易受到微生物污染而导致腐败变质，采用防腐剂抑制微生物，延缓腐败是当今食品保鲜的重要技术之一。据FDA估算，世界上每年约有20% 以上的食品因微生物腐败而浪费，损失高达170亿美元。我国常用的防腐剂有30多种，年生产消耗约12万吨，价值约50多亿元，是一个相当大的产业，对国民经济发展有较大影响。 按国家批准的使用范围和以1%。的比例添加，相当于预防了 5000万吨食品腐败变质。然而， 食品中使用的大多是化学防腐剂，影响人体健康，它的应用越来越受到众多国家的限制。天然生物防腐剂具有安全、无毒、适用性广、性能稳定等优点，因此，开发高效广谱食品生物防腐剂已成为现代食品工业的重要任务。细菌素是细菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内可被降解，具有无毒、无残留，高效、耐酸、耐高温、无抗药性等特点，目前已成为天然防腐剂研究与开发的热点。II a类细菌素，是细菌素中数量最多且研究最为深入的一群，主要包括肠球菌素(enterocin)、片球菌素(pediocin)等小分子细菌素。这类细菌素不仅抑制某些腐败乳酸菌、索丝菌(Brochotrix spp.)、梭状杆菌(Clostridium spp·)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)等，而且对食源性病原菌单增李斯特氏菌 (Listeria monocylogenes)有强烈的抑制作用，具有很好的控制食品腐败菌及病原菌的潜在应用价值。此外，与其它细菌素相比，II a类细菌素的抑菌活性较强且具有良好的物理化学性质，是目前公认的最有希望应用于多种工业用途的细菌素。近年来，构建乳酸菌食品级异源表达系统，探究一些有巨大应用前景的IIa类细菌素基因在乳酸菌中的克隆和表达已成为乳酸菌细菌素分子遗传学的研究热点。然而传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，虽然这为遗传操作时保持一定的选择压力并有效选择转化子，但是将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物安全性的严重后果，所以从食品安全角度考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食品生产中。而为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害，最有效的办法是使用对人体安全的食品级筛选标记替代抗生素抗性标记以构建食品级受体及载体系统。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备产细菌素的基因工程菌方法。本发明所提供的制备产细菌素的基因工程菌方法，包括如下步骤将细菌素的编码基因导入宿主菌得到重组菌；从所述重组菌中获得表达所述细菌素的基因工程菌；所述细菌素的氨基酸序列如序列表中序列3所示。所述细菌素的编码基因为如下A)或B)所示A)所述细菌素的编码基因为如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子；B)所述细菌素的编码基因为如下4)或5)或6)中任一所述的DNA分子4)序列表中的序列2所示的DNA分子；5)在严格条件下与4)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；6)与4)或5)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。所述宿主菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。所述细菌素的编码基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。所述重组表达载体为将所述细菌素的编码基因插入表达载体PLEB590的BamHI和 XhoI酶切位点之间得到的重组表达载体。由所述方法制备得到的基因工程菌也属于本发明的保护范围。所述基因工程菌在制备细菌素中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种制备头细菌素的方法。本发明所提供的制备头细菌素的方法，包括如下步骤发酵所述基因工程菌，即得到细菌素。所述发酵的培养基为GM17液体培养基；所述发酵的温度为30°C -37°C或37°C或30°C或34°C ；所述发酵的时间为18小时-32小时或18小时-24小时；所述发酵的接种量的体积百分比为1%。所述方法在所述发酵之后，还包括从发酵液上清中分离纯化得到所述细菌素的步骤；所述分离纯化的方法包括以下步骤(a)将发酵液上清用80%饱和度硫酸铵沉淀盐析，收集沉淀，得到细菌素粗提物；(b)将步骤(a)得到的细菌素粗提物进行凝胶过滤层析，用0. 02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到为初纯细菌素样品；所述凝胶过滤层析中采用的凝胶柱的型号为Si^phadex G-IO ；(c)将步骤(b)收集的洗脱液进行阳离子交换柱层析，用含0M-1M NaCl的 0. 02mol/L醋酸缓冲液进行线性洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到细菌素；所述阳离子交换柱层析中采用的阳离子交换柱的型号为SP Sepharose Fast Flow ；所述线性梯度洗脱中NaCl的浓度在40min-60min或40min或50min或60min分钟内由OM线性升至1M。本发明所提供的生产II a类细菌素的基因工程乳酸乳球菌，可实现II a类细菌素的超量表达、连续生产和快速检测。利用该基因工程乳酸乳球菌，可从每IOOOmL该基因工程乳酸乳球菌发酵液中提取纯化到5. 66mg,比活力为5. 12X 105AU/mg的细菌素 enterocin P。同时，对该重组菌以选择压力物质nisin进行筛选，nisin是公认安全的天然食品防腐剂，且nisi基因来源于乳酸菌自身，这使得将nisi基因作为乳酸菌食品级筛选标记更有优势。
图1为重组表达质粒pLEB590-sEntPl和pLEB590_sEntP2的构建过程图。图2为重组表达质粒的鉴定电泳图。图3为重组乳酸乳球菌的生长曲线图。图4为纯化后细菌素的Tricine SDS-PAGE及抑菌活性检测图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、生产细菌素的基因工程乳酸乳球菌的构建及其应用一、生产细菌素的基因工程乳酸乳球菌的构建1、Enterocin P编码基因的克隆1)引物设计与合成依据质粒pLEB590的多克隆位点(MCS)及GenBank中已知编码细菌素enterocinP 的核昔酸序列(Original accession number :AF005726. 1) (enterocin P 的氛基酸序列如序列表中序列3所示)，在Primer 5. 0上设计引物并插入两个限制性酶切位点(BamHI和 XhoI)，见表 1。表IPCR扩增enterocin P编码基因引物及产物
权利要求
1.一种制备产细菌素的基因工程菌方法，包括如下步骤将细菌素的编码基因导入宿主菌得到重组菌；从所述重组菌中获得表达所述细菌素的基因工程菌；所述细菌素的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细菌素的编码基因为如下A)或B)所示A)所述细菌素的编码基因为如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子；B)所述细菌素的编码基因为如下4)或5)或6)中任一所述的DNA分子4)序列表中的序列2所示的DNA分子；5)在严格条件下与4)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；6)与4)或5)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述宿主菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述细菌素的编码基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为将所述细菌素的编码基因插入表达载体PLEB590的多克隆位点得到的重组表达载体。
6.由权利要求1-5中任一所述的方法制备得到的基因工程菌。
7.权利要求6所述的基因工程菌在制备细菌素中的应用。
8.一种制备细菌素的方法，包括如下步骤发酵权利要求6所述的基因工程菌，即得到细菌素。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为30°C -37°C或37°C或30°C或34°C ；所述发酵的时间为18小时-32小时或18小时-24小时；所述发酵的接种量的体积百分比为1%。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法在所述发酵之后，还包括从发酵液上清中分离纯化得到所述细菌素的步骤； 所述分离纯化的方法包括以下步骤(a)将发酵液上清用80%饱和度硫酸铵沉淀盐析，收集沉淀，得到细菌素粗提物；(b)将步骤(a)得到的细菌素粗提物进行凝胶过滤层析，用0.02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到为初纯细菌素样品；所述凝胶过滤层析中采用的凝胶柱的型号为S印hadex G-IO ；(c)将步骤(b)收集的洗脱液进行阳离子交换柱层析，用含0M-1MNaCl的0. 02mol/L 醋酸缓冲液进行线性洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到细菌素；所述阳离子交换柱层析中采用的阳离子交换柱的型号为SP Sepharose Fast Flow ；所述线性梯度洗脱中NaCl 的浓度在40min-60min或40min或50min或60min内由OM线性升至1M。
全文摘要
本发明公开了食品级异源分泌表达IIa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种基因工程菌，本发明所提供的基因工程菌，为将含有DNA分子I的DNA片段导入宿主菌得到的基因工程菌；所述DNA分子I如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明所提供的生产IIa类细菌素的基因工程乳酸乳球菌，可实现II a类细菌素的超量表达、连续生产和快速检测。
文档编号C12N1/21GK102260689SQ20111014378
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者刘国荣, 尚楠, 张宝, 张香美, 李平兰, 陈尚武, 马世敏 申请人:中国农业大学