专利名称：一种秀丽白虾srap-pcr体系的建立与优化方法
技术领域：
本发明涉及一种秀丽白虾SRAP-PCR体系的建立与优化方法，能快速、准确地建立最优化的秀丽白虾SRAP-PCR反应体系，借助这一方法可以便捷地开展秀丽白虾遗传多样性及种质资源调查，属于渔业生物技术领域。
背景技术：
秀丽白虾(Exopalaemon modestus)隶属于甲壳纲、十足目、长臂虾科、白虾属，广泛分布于我国淡水湖泊及河流中，是长江中下游地区许多中大型湖泊的虾类优势种。太湖秀丽白虾因其壳薄味美、营养丰富、产量高而与银鱼、梅鲚并称“太湖三宝”，巢湖秀丽白虾与银鱼、河蟹并称为“巢湖三鲜”，巢湖和洪泽湖的“湖米”(白虾的虾仁)远销海内外。因此不论从产量还是产值上讲，秀丽白虾在我国淡水湖泊渔业中占有非常重要的位置。近年来由于水质污染、过度捕捞等原因，湖泊中秀丽白虾呈现个体小型化、产量下降的趋势，白虾种质资源保护显得尤为重要。遗传多样性的研究是种质资源保护的重要部分，而合适的分子标记和良好的反应体系的建立是得出科学结论的前提条件。目前有关秀丽白虾种质遗传多样性的研究仅见于RAPD标记和AFLP标记。RAPD分子标记是一种显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子，且实验结果不稳定，重复性差；AFLP标记需要预扩增和连接，实验操作过程烦琐，工作量大，实验费用高。因此急需开发新的分子标记和建立优化的反应体系，补充、丰富秀丽白虾分子生物学研究的手段和方法。SRAP (sequence-related amplified polymorphism)是由美国力口州大学 Li 与 Quiros博士开发出的新型DNA分子标记技术。其原理是利用独特的正反引物设计，对开放阅读框进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与外显子间隔区长度不同而产生多态性。该分子标记技术有简便、快速、稳定、不需预知序列信息等优点，不仅广泛应用于植物的遗传多样性分析、基因定位和遗传图谱构建等，近年来已用于罗氏沼虾、日本沼虾、海南沼虾、草鱼、团头鲂等水产动物遗传多样性的研究；在反应体系的优化上，以往多采用简单的梯度试验，对各个因素的最佳水平进行逐个摸索，过程比较繁琐，而且很难兼顾各个因素之间的交互作用，实验结果误差大。
发明内容
发明目的
目前秀丽白虾种质遗传研究上缺乏足够、可靠的分子标记，本发明开发了一种秀丽白虾SRAP分子标记，并将正交设计引入到反应体系的优化中，对影响SRAP-PCR的5个因素 (Mg2+、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4个水平上进行正交组合，建立了秀丽白虾最优 SRAP-PCR反应体系，这一发明补充、丰富秀丽白虾分子生物学研究的手段和方法，为秀丽白虾种质资源保护奠定了基础。技术方案一种秀丽白虾SRAP-PCR体系的建立与优化方法，其特征在于该方法包括25 μ L的PCR 体系中含有 Mg2+ 2mmol/L、Taq 酶 0. 5U、模板 DNA 75ng、dNTPs 0. 20mmol/L、引物 0. 2 μ mol/ L,其中引物为 5 ‘ -TGAGTCCAAACCGGAGC-3 ‘禾口 5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。有益效果
本发明开发了一种秀丽白虾SRAP分子标记，并将正交设计引入反应体系的优化中，建立了秀丽白虾最优SRAP-PCR反应体系。该方法与现有技术相比具有以下优势
(1)目前报道的应用于秀丽白虾种质遗传分析的分子标记只有RAPD和AFLP2种。本发明开发了一种新的分子标记SRAP标记，补充、丰富了秀丽白虾分子生物学研究的手段和方法。(2) RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；而且对于反应条件比较敏感，稳定性和重复性差，SRAP标记具有高共显性、重复性好的特点，克服了 RAPD标记的上述缺点。(3)AFLP标记需要预扩增和连接，实验操作过程烦琐，工作量大，实验费用高。相比之下，SRAP标记具有实验操作简单，工作量小，实验费较低的优势。(4) SRAP标记与性状的表现型相关性更高，因此通过分离特异SRAP标记、序列测定的方法更易筛选到与某个性状相关的功能基因。
具体实施方案实施例1
本发明为一种秀丽白虾SRAP-PCR体系的建立与优化方法，采用以下工艺步骤 1、采集秀丽白虾样本，保存于95%乙醇中带回实验室。常规酚/氯仿法提取样本总DNA。 提取的DNA经70%的乙醇洗涤，室温干燥后溶于适量ddH20中，置于_20°C保存备用。2、参照有关文献合成SRAP引物序列，选取部分白虾样品预扩增，筛选扩增效果好的引物对。筛选出的SRAP引物对的序列为
ME2 (5' -TGAGTCCAAACCGGAGC-3‘)禾口 EM4 (5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘)。3、PCR反应的因素与水平梯度设计，如表1。表1 PCR反应的因素与水平
权利要求
1. 一种秀丽白虾SRAP-PCR体系的建立与优化方法，其特征在于该方法包括25 μ L 的 PCR 体系中含有 Mg2+ 2mmol/L、Taq 酶 0. 5U、模板 DNA 75ng、dNTPs 0. 20mmol/L、引物 0. 2 μ mol/L，其中引物为 5 ‘ -TGAGTCCAAACCGGAGC-3 '和 5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘。
全文摘要
本发明涉及一种秀丽白虾SRAP-PCR体系的建立与优化方法，属于渔业生物技术领域；一种秀丽白虾SRAP-PCR体系的建立与优化方法，其特征在于该方法包括25μL的PCR体系中含有Mg2+2mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA75ng、dNTPs0.20mmol/L、引物0.2μmol/L，其中引物为5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′、GACTGCGTACGAATTTGA。目前报道的应用于秀丽白虾种质遗传分析的分子标记只有RAPD和AFLP2种。本发明开发了一种新的分子标记SRAP标记，补充、丰富了秀丽白虾分子生物学研究的手段和方法。
文档编号C12N15/10GK102234644SQ20111016312
公开日2011年11月9日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者刘凯, 张敏莹, 徐东坡, 施炜纲, 段金荣, 程长洪 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心