狼尾草及其用途的制作方法

专利名称：狼尾草及其用途的制作方法
技术领域：
本申请案涉及用于培养纤维素分解微生物以产生纤维素酶的培养基、组合物和方法。
背景技术：
在过去的数十年中，针对纤维素酶系统的大部分研究主要集中于纤维素分解生物质转化以产生富能量(energy-rich)物质(例如乙醇、氢气和甲烷)。因此，已研发出许多相关技术(夏尔汉(Sheehan)和海默尔(Himmel)，1999)。这些生物技术的关键在于实现微生物和酶促纤维素水解范例的实用目标(李德(Lynd)等人，2002)。然而，目前可用于将纤维素转化成生物燃料的生物技术方法尽管颇具前景，却相对缺乏深入研究。此外，使用天然形成的木质纤维素(源自木材、草、林业废料、废纸、城市废料，和农业残余物，例如玉米秸 和禾草)生产纤维素酶的趋势在世界范围内已明显增加。在所有原料中，农业生物质(由超过50%纤维素和半纤维素组成)因经营成本极低而成为生产微生物酶的极佳碳源。降低微生物酶生产的成本已成为当下生物燃料研发与生产的重要研究目标。由于纤维素酶在众多工业工艺(诸如动物饲料、淀粉加工、制曲和酿酒、谷物酒精发酵、水果和蔬菜加工、纸浆造纸业和纺织业)中的应用潜力巨大(博艾特(Bhat)，2000)，大量研究已集中于纤维素酶。许多产生各种纤维素分解酶的微生物已研究了数十年(李德(Lynd)等人，2002)。一些用于增加纤维素酶产量的培养方法已被广泛报导，包括深层发酵与固态发酵(盖嘉克(Grajek), 1987)、不同类型和浓度的底物(帕瓦林纳(Pavarina)和杜兰特(Durrant), 2002)、利用碳源和氮源进行调节(洛克金顿(Lockington)等人,2002)、进行共培养来产生纤维素酶(王(Wang)等人，2006)和菌株改良(艾德索尔(Adsul)等人，2007)。考虑到需要使用纤维素酶进行基于纤维素的物质的糖化，因此筛选具有高纤维素酶活性、水解产物中无残余物(例如纤维二糖)留下且具有热-PH稳定性酶的微生物将为有益的。在具有适用性、高活性和高生产力的纤维素酶的研发和生产过程中，成本问题是一个关键性问题。制备培养基的化学物质是生长纤维素分解微生物以产生纤维素酶的典型花费。需要一种具有成本效益的培养基。

发明内容
本发明涉及用于生长纤维素分解微生物以产生纤维素酶的具有成本效益的培养基和方法。因此,本发明一方面的特征在于一种含有狼尾(Napier ；NP)草(象草(Pennisetumpurpureum))的培养基。在一实例中，培养基包含约O. I %到5% (w/v)NP草碎片。培养基可含有氮(N)源。在一实例中，培养基经过灭菌。在另一实例中，培养基进一步含有抗生素。在第二方面中，本发明的特征在于一种培养纤维素分解微生物的方法。所述方法包括以下步骤获得上述培养基；和在所述培养基中，在允许纤维素分解微生物的细胞生长的条件下培养所述细胞。纤维素分解微生物的实例包括(但不限于)镰刀菌属(Fusarium spp·)、曲霉菌属(Aspergillus spp.)和脉抱菌属(Neurospora spp.)。优选使用的纤维素分解微生物可为真菌，诸如黑曲霉菌(Aspergillus niger)、菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、裂裙菌(Schizopphyllum commune)和里氏木霉(Trichoderma reesei);细菌，诸如农杆菌(Agrobacterium)ATCC 21400、解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、产玻拍酸拟杆菌(Bacteroides succinogenes)、幾肥纤维单胞菌(Cellumonas fimi)、潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、非脱羧埃希菌(Escherichia adecarboxylata)、菊欧文氏菌(Erwiniachrysantemi)、双抱小双抱菌(Microbispora bispora)和高温单抱菌 YX (ThermonosporaYX);或从诸如黄胸散白蚁(Reticulitermes fIavipes)、食木船蛆(Xylophaga)、澳洲土垄家白蚁(Coptotermes Iacteus)、黑胸象白蚁(Nasutitermes walkeri)、大和白蚁(Leucotermes speratus)(散白蚁属(Reticulitermes))、盖罩大蜗牛(Helixpomatia)、隐尾爐(Cryptocercus punctulates)、食木蟑螂(Panesthia cribrata)、桑粒肩天牛 (Calolampra elegans)和穴居蟑螂(Geoscapheus dilatatus)等动物获得的其它微生物。在第三方面中，本发明的特征在于一种产生纤维素酶的方法。所述方法包括以下步骤获得上述培养基，并在所述培养基中，在允许表达纤维素酶的条件下培养含有编码纤维素酶的核酸的纤维素分解微生物(诸如选自镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的真菌)的细胞；和从所培养的细胞或培养基纯化纤维素酶。在第四方面中，本发明的特征在于一种具有上述培养基和纤维素分解微生物(诸如选自镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的真菌)的细胞的组合物。可以使用上述方法和组合物，由木质纤维素物质产生可发酵糖和能量。因而，在第五方面中，本发明的特征在于一种由木质纤维素物质产生可发酵糖的方法。所述方法包括提供具有上述培养基和纤维素分解微生物的细胞的组合物；和使所述组合物与木质纤维素物质接触以产生可发酵糖。在一实例中，培养基含有约O. 1%到5%，例如1.0% (w/v)NP草碎片。可发酵糖可为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、寡糖(例如纤维素低聚物或木糖低聚物)或其任意组合。木质纤维素物质的实例包括纤维素性动物废料、城市固体废料、废纸、庭院废料、农业残余物、林业残余物及其任意组合。所述方法可进一步包括将可发酵糖转化成发酵产物的步骤。这一转化步骤可通过微生物发酵或酶处理来进行。在第六方面中，本发明的特征在于一种由木质纤维素物质产生能量的方法。所述方法包括提供上述组合物；使所述组合物与木质纤维素物质接触以产生可发酵糖；转化所述可发酵糖以产生可燃发酵产物；和燃烧所述可燃发酵产物或水解性固体废料或残余物以产生能量。在第七方面中，本发明的特征在于一种用于饲料或食品添加剂加工、生物制浆或复合物处理的方法。所述方法包括提供上述组合物，其包含培养基和纤维素分解微生物的细胞；和使所述组合物与待加工或处理的物质接触。在第八方面中，本发明的特征在于一种生物反应器，其含有木质纤维素物质和上述组合物。本发明一个或一个以上实施例的细节将于所附图式和以下描述中予以阐述。根据这些描述和图式以及权利要求书，将易于了解本发明的其它特征、目的和优势。


图Ia到图Ic为显示与使用1% CMC相比，使用1% (w/v)NP草使(a)镰刀菌属、(b)曲霉菌属和(C)脉孢菌属3种真菌的总纤维素酶产量(FPase活性)增加的图。所有菌株都在不存在大豆蛋白胨且以I % NP或I % CMC作为主要碳源的MR培养基中培养。在不含上述碳源的相同培养基中培养的菌株指定为对照实验(即无NP)。一般条件为pH 7.0、25°C到35°C以及150rpm，以1% NP草作为对照实验。图2a到图2c为显示最佳浓度的NP草使(a)镰刀菌属、(b)曲霉菌属和(C)脉孢菌属3种真菌的总纤维素酶产量(FPase)明显增加的图。所有菌株都在不存在大豆蛋白胨 且以不同百分比的NP作为主要碳源的MR培养基中在相应最佳生长条件下培养。一般条件为pH 7. 0、25°C到35°C以及150rpm，以1% NP草作为对照实验。
具体实施例方式本发明至少部分基于意外地发现狼尾草可用作有效而便宜的主要碳源供生长纤维素分解真菌，从而产生纤维素酶。狼尾(NP)草(象草)，常见于热带和亚热带地区，已被广泛用作反刍动物的饲料，并且其组成、性质和部分基因组信息已得到充分研究；然而，尚无报导显示可利用NP草来产生微生物纤维素酶。本发明提供NP草作为有效而便宜的碳源以生长最初从稻草或甘蔗渣堆肥分离的纤维素分解真菌(即镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属)的新应用。结果显示，当使用1% (w/v)NP草作为这3种真菌的主要碳源时，总纤维素酶活性(FPase)显著增加(镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属分别从O. 008增到O. 085、从O增到O. 085、从O. 002增到
O.124U/ml)(图I)。将所有个别培养条件最佳化后，镰刀菌属和脉孢菌属的最佳纤维素酶产量分别为O. 18到O. 22U/ml和O. 14到O. 16U/ml。在所研究的碳源(即葡萄糖、CMC和NP草)中，含有1% NP草的培养基不仅达成最佳的纤维素分解活性，而且是所有测试的碳源中最便宜的组合。这一发现使NP草成为改良由纤维素分解微生物产生生物燃料、纺织业和其它行业必需的纤维素酶的可额外选择的主要碳源。举例来说，在由木质纤维素物质产生可发酵糖和能量时，可以使用纤维素酶。如本文所使用的术语“木质纤维素物质”是指含有纤维素和/或半纤维素的物质。一般说来，这些物质也含有木聚糖、木质素、蛋白质，和碳水化合物，诸如淀粉和糖。举例来说，在植物的茎、叶、外壳、外皮和穗轴(cob)，或树木的叶、枝和木质部中可发现木质纤维素。复杂碳水化合物(诸如淀粉、纤维素或半纤维素)转化成可发酵糖的过程在本文中也称为“糖化”。如本文所使用的可发酵糖是指单糖，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖。木质纤维素物质可包括原始植物生物质和/或非原始植物生物质，诸如农业生物质、商业有机物、建筑物和废墟碎屑、城市固体废料、废纸和庭院废料。木质纤维素物质的常见形式包括树、灌木和草、小麦、小麦秸杆、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米粒(包括来自谷粒的纤维)、由研磨诸如玉米、稻米、小麦和大麦等谷物(包括湿式研磨和干式研磨)得到的产物和副产物，以及城市固体废料、废纸和庭院废料。木质纤维素物质也可为(但不限于)草本物质、农业残余物、林业残余物和造纸厂残余物。“农业生物质”包括枝、灌木丛、藤茎、玉米和玉米皮、能源作物、森林、果类、花、谷物、草、草本作物、叶、树皮、针状叶(needle)、原木、根、苗木、短轮伐期木本作物(short rotation woodycrop)、灌木、柳枝稷(switch grass)、树木、蔬菜、果皮、藤本植物、甜菜柏、小麦麸、燕麦壳、硬木和软木(不包括含有害物质的木材)、农业过程所产生的有机废料(包括耕种和林业活动，尤其包括林业木材废料)或其混合物。此方法中所用木质纤维素物质的实例包括(但不限于)果园剪枝、树丛、工厂废料、城市木材废料、城市废料、砍伐废料、森林抚育间伐(forest thinning)、短轮伐期木本作物、工业废料、小麦、小麦秸杆、燕麦秸杆、稻草、大麦秸杆、黑麦秸杆、亚麻秸杆、大豆壳、
稻壳、燕麦壳、甘蔗、玉米、玉米秸、玉米秸杆、玉米面筋饲料、玉米穗、玉米皮、玉米粒、谷粒纤维、大网茅草(prairie grass)、鸭茅状磨擦禾(gamagrass)、狐尾草、甜菜柏、柑桔果衆、种子壳、纤维素性动物废料、草坪修剪物、棉花、海藻、树木、灌木、草、甘蔗渣、谷物湿式研磨或干式研磨的产物和副产物、城市固体废料、废纸、庭院废料、草本物质、农业残余物、林业残余物、城市固体废料、废纸、纸浆、造纸厂残余物、枝、灌木丛、藤茎、玉米、玉米皮、能源作物、森林、果类、花、谷物、草、草本作物、叶、树皮、针状叶、原木、根、苗木、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、藤本植物、甜菜柏、小麦麸、燕麦壳、硬木和软木、农业过程所产生的有机废料、林业木材废料或其组合。在此研究中，用含有狼尾(NP)草(象草)、CMC或葡萄糖作为主要碳源的培养基培养这些镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属真菌菌株，以在细胞外产生纤维素酶。结果显示，当使用1% (w/v)NP草培养这3种分离的真菌时，曲霉菌属、镰刀菌属和脉孢菌属的总纤维素酶活性(基于FPase测量值)显著增加，分别从O (无NP)增到O. 085U/ml (I % NP)、从
0.008增到0. 085U/ml和从0. 002增到0. 124U/ml ;其为用1% (w/v)CMC培养时的总纤维素酶活性的约I到23倍。在最佳化的培养条件下达到最佳纤维素酶活性(对于曲霉菌属和脉孢菌属，分别为0. 18到0. 22U/ml和0. 14到0. 16U/ml)。此外，从I % NP批次收集的纤维素酶具有良好的PH值和温度工作范围，且在广泛pH值下稳定。在所有测试的碳源中，含有NP草的培养基不仅达到最佳的纤维素分解活性，而且还是最便宜的组合。这一发现提供NP草作为主要碳源的额外利用选择，以改良由纤维素分解真菌产生生物燃料、纺织业和其它行业必需的纤维素酶。因此，本文所揭示的培养基、组合物和方法可按美国申请案20100047869和20080131958 以及美国专利 5232851、5677151、6451063、6602700 和 7226773 中所述的方式用于饲料或食品添加剂加工、生物制浆或复合物处理中，所述各案的内容以引用的方式并入本文中。以下具体实例应解释为仅具说明性，且不以无论任何方式限制本发明的其余部分。无需进一步阐明，相信所属领域技术人员可根据本文的描述最大限度地利用本发明。本文所引用的所有出版物都以全文引用的方式并入本文中。此外，下文提出的任何机制不以任何方式限制所主张的发明的范围。I.引言:在此研究中，使用3种产生纤维素酶的菌株镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属。这3种真菌菌株的培养条件经最佳化以达到最佳的纤维素酶活性。将3种不同的天然或人工碳源(即狼尾草、CMC或葡萄糖)补充到培养基中以评估其在较低成本下增加纤维素酶产量的潜能。2.方法2. I 底物NP 草是从台湾畜产试验所(Taiwan Livestock Research Institute)(信华(Hsin-hua),台湾台南(Tainan, Taiwan))。羧甲基纤维素(CMC)、葡萄糖、β-对硝基-苯基-葡糖苷(β -pNPG)、华特曼(Whatman) I号纸和本研究中使用的所有化学物质均购自西格玛公司(Sigma)。CMC、华特曼I号纸和β -pNPG分别为CMCase、β -葡糖苷酶和FPase测量的底物。将浓度为1% (w/v)的CMC、葡萄糖和NP草用作碳源以检查3种真菌中纤维素酶的产量。将NP草风干，使用切碎机切成小片,研磨成较小颗粒,接着经由通过O. 45mm筛网进行最终分离。将通过筛网的部分和市售化学物质用于培养基的制备。
2. 2接种和培养条件将Fp和RS-N菌株在28°C下维持于PDA琼脂上5到7天，同时将RS-A维持于35°C下5到7天，此时，孢子形成的情况良好。使用来自此培养物的新鲜菌丝作为接种物。通过用5ml灭菌的水洗涤斜面培养物，制得分生孢子悬浮液。使用血球计对孢子悬浮液进行计数，得到IO8个孢子/毫升。使镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的2毫升孢子悬浮液在含有100ml MR培养基(不含O. I %大豆蛋白胨)的250ml烧瓶中生长，其中分别使用I % NP草、1% CMC或I %葡萄糖作为碳源来检查纤维素酶产生。在5天培养期间，记录在不同碳源中生长的3种真菌的纤维素酶活性。对于NP草的最佳浓度，采用不同百分比的NP并在相应最佳生长条件下用不含O. I %大豆蛋白胨的MR培养基进行培养。2. 3由3种真菌得到的粗纤维酶制剂将源自于用I % NP草培养的镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的培养液在8，000 Xg下离心20分钟以去除菌丝和未利用的底物。上清液经由华特曼I号纸和0.45 μ m膜进行过滤，且接着通过用并有3kDa膜(Vivaspin 20)的艾美康(Amicon)浓缩装置过滤加以浓缩，其中在过滤过程中FPase活性损失小于3%。向上清液中添加O. 01% (v/w)叠氮化钠(NaN3)以防止微生物生长。含有O. 01% NaNjP O. 01%苯基甲烷磺酰氟(PMSF，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)的浓缩粗酶制剂可在4°C下储存，且I周后仍可保留80%的活性。使用粗酶制剂研究酶特征，包括最佳pH值、pH值稳定性、最佳温度和热稳定性。2. 4纤维素酶(CMCase、FPase和β -葡糖苷酶)活性分析对于碳源活性测试，使用方法中所述的相应I %底物在40°C下测量镰刀菌属的粗酶提取物的CMCase、β -葡糖苷酶和FPase活性，但对于曲霉菌属和脉孢菌属，则在50°C下进行测量。通过在200 μ I反应混合物(100 μ I粗酶和100μ I于IOOmM NaOACUOOmMNaCl (pH 5.0)中的2%底物)中测量在10分钟内由I % CMC释放的还原糖来测定CMCase。使用3mg I号(华特曼)滤纸作为底物，在200 μ I反应混合物(如上)中经I小时测定FPase活性。使用改进的DNS法(伍德(Wood)等人，1988)，在添加200 μ I 二硝基水杨酸(DNS)且在100°C下加热10分钟后，测定释放的总还原糖。一个单位(IU)CMCase和FPase活性定义为，在分析条件下每分钟释放Iymol葡萄糖(作为还原糖等效物)的酶量。对于葡糖苷酶活性，通过将β-pNPG(最终浓度lmM)与在乙酸钠缓冲液(IOOmM NaOAC,IOOmM NaCl，pH5. 0)中制备的10 μ I酶溶液混合得到150 μ I工作体积来进行3种真菌的分析。培育10分钟后，通过添加50 μ I 2Μ碳酸钠终止反应。用分光光度计在400nm下测量3种真菌的反应混合物的吸光度。基于4-硝基苯酚校准曲线计算β-葡糖苷酶活性。一个单位的酶活性定义为每分钟释放I μ mol 4-硝基苯酚的当量数。3.结果与讨论碳(C)源的影响诸如培养基复杂性和底物结构复杂性等培养因素可能影响丝状真菌分泌水解酶(库尔琴科(Kurchenko)等人，2001)。在此研究中，估计不同的碳源(即NP草和CMC)改良镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的纤维素酶分泌的潜能。结果显示，3种真菌在无碳源补充的培养基中生长后总纤维素酶活性(FPase)极低。一旦在存在1% (w/v)NP草但无有机氮条件下培养(表I和图l)，FPase活性即显著增加约60到105倍(即对于镰刀菌属、曲霉菌 属和脉孢菌属，分别从O增到O. 062U/ml、从O. 008增到O. 085U/ml和从O. 002增到O. 124U/ml)，这表示NP草诱导产生大量纤维素酶。CMCase和β -葡糖苷酶活性也显示类似的改良(表I)，且与FPase相比，活性提高的程度更大。此外，用1% NP草培养的批次的FPase活性是用1% CMC培养的批次的约I到23倍。这些结果表明，NP草可用作理想碳源以改良此研究中分离的纤维素分解真菌的纤维素酶产生。此外，进一步评估产生纤维素酶的最佳NP草浓度。通常，对于镰刀菌属和脉孢菌属而言，FPase活性随NP草的量升高而增强，但5% NP除外(图2a和图2c)。镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属分别在2%、5%和3% NP草存在下培育4到5天后出现FPase最大值；这一值甚至比1%NP的值更高。本研究中所研发的基于NP草的培养基预期可节约50%的培养基成本，而碳源花费通常为总培养基成本的一半以上(表2)。据此推断，NP草可为用于经济纤维素酶生产的较佳底物源。表I.使用I % (v/w) NP草作为主要碳源增强3种真菌的纤维素(FPase、CMCase和β-葡糖苷酶)产量。
权利要求
1.一种培养基，其包含狼尾(Napier ；NP)草(象草(Pennisetum purpureum))。
2.根据权利要求I所述的培养基，其中所述培养基包含约O.1%到5% (w/v)狼尾(NP)草(象草)碎片。
3.根据权利要求2所述的培养基，其中所述培养基包含约1%到3%(w/v)狼尾(NP)草(象草)碎片。
4.根据权利要求I至3中任一权利要求所述的培养基，其中所述培养基经灭菌。
5.根据权利要求I至3中任一权利要求所述的培养基，其中所述培养基进一步包含抗生素。
6.一种培养纤维素分解微生物的方法，其包含 获得根据权利要求I至5中任一权利要求所述的培养基；和 在所述培养基中，在允许纤维素分解微生物的细胞生长的条件下培养所述细胞。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述纤维素分解微生物为一种或一种以上选自镰刀菌属(Fusarium spp·)、曲霉菌属(Aspergillus spp.)和脉抱菌属(Neurospora spp.)的真菌。
8.—种产生纤维素酶的方法，其包含 获得根据权利要求I至5中任一权利要求所述的培养基；和 在允许表达纤维素酶的条件下培养含有编码所述纤维素酶的核酸的纤维素分解微生物的细胞；和 自所述培养的细胞或所述培养基纯化所述纤维素酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述纤维素分解微生物为一种或一种以上选自镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的真菌。
10.一种组合物，其包含根据权利要求I至5中任一权利要求所述的培养基和纤维素分解微生物的细胞。
11.根据权利要求11所述的组合物，其中所述纤维素分解微生物为一种或一种以上选自镰刀菌属、曲霉菌属和脉孢菌属的真菌。
12.—种由木质纤维素物质产生可发酵糖的方法，其包含 提供包含根据权利要求I至5中任一权利要求所述的培养基和纤维素分解微生物的细胞的组合物； 使所述组合物与木质纤维素物质接触以产生可发酵糖。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述可发酵糖选自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、寡糖及其任一组合组成的群组。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述木质纤维素物质选自由纤维素性动物废料、城市固体废料、废纸、庭院废料、农业残余物、林业残余物及其任一组合组成的群组。
15.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其进一步包含将所述可发酵糖转化成发酵产物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述转化步骤是通过微生物发酵或酶处理来进行。
17.一种由木质纤维素物质产生能量的方法，其包含提供根据权利要求10或11所述的组合物； 使所述组合物与所述木质纤维素物质接触以产生可发酵糖； 转化所述可发酵糖以产生可燃发酵产物；和 燃烧所述可燃发酵产物或水解性固体废料或残余物以产生能量。
18.—种生物反应器，其含有木质纤维素物质和根据权利要求10或11所述的组合物。
19.一种用于饲料或食品添加剂加工、生物制浆或复合物处理的方法，其包含 提供包含根据权利要求I至5中任一权利要求所述的培养基和纤维素分解微生物的细胞的组合物；和 使所述组合物与待加工或处理的物质接触。
全文摘要
狼尾草及其用途。本发明揭示用于培养纤维素分解微生物以产生纤维素酶的培养基、组合物和方法。
文档编号C12R1/77GK102827801SQ201110169038
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者余淑美, 贺端华, 池俊利, 郭献文, 刘建宏 申请人:中央研究院